一种肺组织特异性bpifa3启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及一种肺组织异性BPIFA3启动子及其应用，特别提供了一种肺组织特异性表达基因5′调控区特异性启动子及其在转基因猪中的应用，该启动子只在肺组织中具有启动特性，而在除肺组织外的多种细胞中均无启动活性，可见该基因启动子只在肺组织中特异性地启动下游基因的表达，因此能够满足目的基因在肺组织中特异性表达的要求，为通过转基因技术来提高猪的抗病品质提供了一种重要的元件。
【专利说明】—种肺组织特异性BPIFA3启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种肺组织特异性表达基因5'调控区特异性BPIFA3启动子及其在转基因猪中的应用。
【背景技术】
[0002]真核生物基因表达的时间和水平严格按照发育顺序进行。某些特定基因表达模式的调节能够引起转录因子与相关元件的特异性结合，成为转录起始的关键步骤，并最终导致基因的时间和空间表达。编码组织特异蛋白的系列家族基因严格按照组织特异性和发育阶段性表达，为基因表达调控机制提供了很好的研究模式。在转基因动物中，获得能广泛应用的特异性启动子显得非常重要。但启动子的特异性由多个元件控制，在不同种类和不同发育时期起关键作用的调控元件并不相同，调控元件和反式作用因子之间的相互作用也十分复杂。因此要使外源基因能够在动物组织中特异高效地表达，必须构建一个可以特异高效表达的动物表达载体，其中启动子的选择是重要的条件之一。[0003]杀菌/ 通透性增加蛋白(Bactericidal / permeability increasing protein,BPI)是哺乳动物中性粒细胞中存在的一种碱性蛋白，相对分子质量55X 103。人BPI全长cDNA克隆，其编码31个氨基酸的信号肽和456个氨基酸的成熟蛋白。它能与革兰氏阴性菌脂多糖结合增加外膜对抗菌药的通透性具有中和内毒素和杀灭细菌的生物学作用，还具有中和内毒素活性、促进补体活化，增强吞噬的调理功能、抑制血管生成、抑制炎性介质释放、抗真菌和原虫等一系列生物学功能，是一种很有希望成为新型抗菌药物的物质。猪杀菌/通透性增加蛋白BPI目前有三种蛋白被确定，BPIFAU BPIFA2和BPIFA3，其中猪的BPIFA3位于17号染色体，由7个外显子和8个内含子组成，编码238个氨基酸。通过克隆该基因启动子区并在体外分析其启动特性，利用相关序列构建肺组织特异性表达载体是一种有效的方法，但是上述的研究均还处在起步阶段，对于转基因猪的培育和抗病性提高均没有起到较好的促进作用。
【发明内容】
[0004]基于上述的原因，本发明的发明人经过研究发现猪BPIFA3基因5'调控区具有肺组织特异性启动特性，并利用这一特性设计了一种肺组织特异性BPIFA3启动子载体，该启动子可以在转基因猪的培育中应用。该启动子载体具有肺组织特异性启动特性，而在除肺组织外的多种细胞中均无启动活性，可见该启动子在肺组织中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在肺组织中特异性表达的要求，为转基因载体提供了一种重要的元件。
[0005]本发明所提供的肺组织特异性表达基因5'调控区特异性启动子，其基因序列如Seq ID No:1 所示；
[0006]除了上述的启动子之外，还可以是该启动子变体或者片段，但均具有如Seq IDNo:1所不的基因序列。[0007]“变体”是指对猪肺组织BPIFA3启动子Seq ID No:1序列进行一个或者多个碱基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失或者添加所产生的序列，该序列仍然表现出类似于SeqID No:1DNA序列的活性。
[0008]“片段”是指基本猪肺组织BPIFA3启动子Seq ID No:1序列的一个或者多个区域，其仍然类似于基本DNA序列的活性。
[0009]具有上述序列的启动子或其变体，或者片段，具有肺组织特异性启动特性，而在肺组织之外的多种细胞中均无启动活性，可见该基因启动子在肺组织中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在肺组织中特异性表达的要求，并能应用于转基因猪的培育中。
[0010]应用上述的启动子时，一般采用重组核酸序列，该序列中含有上述的启动子或其变体，或者片段，这样就可以使于启动子下游的目的基因在肺组织中特异性表达，作为分析、开发、改造肺组织特性的研究模型。还可以利用已有的分子生物学操作技术获得包含目的基因的重组核酸，通过显微注射等基因导入技术获得转基因胚胎，用于建立转基因动物。重组核酸序列中的目的基因，含有下列的至少一种功能基因，主要包括抗病基因，加快生长速度基因，提高饲料报酬的基因以及生产特定药物的基因，这样就可以在获得肺组织特异性启动特性之外，提高该重组核酸序列的性能，为转基因猪的培养提供更多的功能性方向，增加其附加产值，如将Toll样受体基因在该启动子指导下表达可以特异性提高肺组织中白介素和干扰素，提高猪的抗病性能。
[0011]在获得了上述的重组核酸序列之后，还可以用其建立特殊的表达系统，以便更好的应用于转基因猪的培育过程中。将目的基因重组至该启动子下游，通过基因转入技术使调控区与目的基因共同整合进染色体中，获得转基因动物，在该启动子作用下目的基因仅在肺组织中表达，在其 他组织器官中不表达，降低目的基因对动物的影响，提高转基因的效果O
[0012]本发明主要通过报告基因分析确定该启动子的启动特征。首先获得无启动子红色荧光蛋白载体。然后通过PCR或者基因捕获等技术获得肺组织中特异性表达的猪表面活性物质蛋白基因BPIFA3型5'调控区，长度为2.98kb，插入红色荧光蛋白上游，得到启动子报告基因分析载体，将CMV启动子(589bp)连入空载体DsRed载体中作为阳性对照，空载体DsRed载体为阴性对照。质粒去内毒素后，转染V79仓鼠肺细胞系，同时转染3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞系和Marcl45非洲绿猴肾细胞系为对照,48h后用倒置荧光显微镜观察红色荧光蛋白表达情况，分析启动子特性。其中之所以选择CMV连入的空载体中作为阳性对照，主要是因为CMV为已知公认的强启动子，将强启动子连入无启动子的载体上游可以启动报告基因RFP的表达，该载体转染如细胞作为阳性对照，可以证明实验中所用的细胞以及转染试剂、转染技术等不存在问题，证明阴性对照无RFP表达是由于没有启动子的存在，而不是其他因素造成。进而更有力的证明连入实验启动子的载体转入细胞后启动RFP的表达是因为该启动子的作用。
[0013]与现有技术相比，本发明选用了独特的载体DsRed载体(商业载体全称为pDsRed-Express2-lvector),以适应本发明所米用的报告基因RFP (红色突光蛋白)，同时本发明为BPIFA3特别设计了引物、启动子序列以及酶切位点等供研究其使用，均具有独特的代表性，因此与现有的肺组织特异性启动子相比，本发明的技术具有明显的不同和显著的进步和针对性。
[0014]当上述的启动子，或者重组核酸序列或者表达系统被应用到转基因猪的培育中后，可以有效的提高培育的效果，且通过添加各种功能性基因，使得转基因猪可以获得更好的抗病品质，更高的生长速度，更好的抗病性以及降低饲养成本，还可以在特定药物的生产中得到更为广泛的应用，对于该领域的研究有着很好的参考价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为BPIFA3(F)和BPIFA3(R)引物PCR扩增BPIFA3启动子片段电泳图，图中泳道 M 为 MassRuler Maker, I 为 PCR 产物；
[0016]图2为无启动子的DsRed载体图谱；
[0017]图3为转染BPIFA3promoter DsRed48h仓鼠V79细胞照片灰度图，
[0018]图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，可见RFP表达，BPIFA3promoter有启动活性；
[0019]图4为转染BPIFA3promoter DsRed48h小鼠胚胎成纤维3T3-L1细胞照片灰度图，
[0020]图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，无RFP表达，BPIFA3promoter无启动活性；
[0021]图5为转染BPIFA3promoter DsRed48h非洲绿猴肾Marcl45细胞照片灰度图， [0022]图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，无RFP表达，BPIFA3promoter无启动活性；
[0023]图6为转染CMV Promoter DsRed48h仓鼠V79细胞照片灰度图，
[0024]图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，可见RFP表达，转染技术有效；
[0025]图7为转染promoter less DsRed48h仓鼠V79细胞照片灰度图，
[0026]图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，无RFP表达，转染试剂有效。
【具体实施方式】
[0027]在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
[0028]实施例1启动子报告基因载体的构建
[0029]基因组提取:取大约克夏猪耳组织,按照TIANamp genomic DNA (天根)试剂盒说明书进行基因组DNA提取。
[0030]无启动子的DsRed载体作为阴性对照；以DsRed为骨架用Sma I (Fermentas)酶切，回收4107bp片段，得到无启动子片段。将完整的CMV启动子正向连入该载体中，得到该载体的阳性对照载体。
[0031]将包含阴性对照和阳性对照载体的菌液按照1:500的比例分别接种至含卡那霉素100 μ g/ml LB培养基中,200rpm剧烈摇晃14h。4°C 6000g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi (QIAGEN)说明书进行,纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。
[0032]根据NCBI (GeneID:100155470)设计如下引物，BPIFA3 (F)基因序列如 Seq IDNo: 2所示，BPIFA3(R)基因序列如Seq ID No:3所示,它包含了从转录起始位点下游47bp到上游2939bp的范围。
[0033]
【权利要求】
1.一种肺组织特异性BPIFA3启动子，其特征在于:该启动子的基因序列如Seq IDNo:1所示。
【文档编号】A01K67/027GK103834660SQ201410084078
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】姜运良, 王鹏飞, 刘根, 李艳平, 康丽, 孙亿, 刘浩 申请人:山东农业大学