一种降低水稻地上部镉含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种降低水稻地上部镉含量的方法，所述方法的具体步骤如下:（1）用纳米材料氧化锌代替原Kafer培养基中的ZnSO4·7H2O，在1升培养基中加入纳米材料氧化锌10mg；（2）将活化后的印度梨形孢接种于步骤（1）所述的液体Kafer培养基中培养，然后收集菌丝体，制备印度梨形孢菌丝液，接着浇灌于水稻秧苗根部，灌根处理，使印度梨形孢定殖于水稻根部；（3）经印度梨形孢定殖后水稻移栽到大田，之后进行常规的水肥管理，使水稻正常生长至收获。本方法易于掌握、成本较低、简单实用，绿色环保，不会引起二次污染，适合用于无公害水稻的生产；它不仅适用于重金属污染土壤中水稻的种植，对于非污染土壤也可使用。
【专利说明】一种降低水稻地上部镉含量的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物资源的利用和农产品质量安全【技术领域】，尤其涉及一种降低水稻地上部镉含量的方法。
【背景技术】
[0002]随着化肥、农药的大量施用和工业的迅速发展，环境污染日益严重。镉是一种有毒的重金属，也是主要的环境污染物之一。中等水平镉污染的耕作层土壤不会对植物造成毒害作用，但可以使得作物的可食用部分积累相当多的镉，通过食物链危害人类的健康。目前，稻田被镉污染和稻谷中镉的积累已成为严重的农业问题。因此，如何减少水田的镉污染和谷粒中镉积累已经成为农业科学领域一个主要的任务。
[0003]目前，降低稻谷中镉积累的方法除了保护水稻种植环境、减少重金属镉污染之外，治理镉污染稻田的方法有向土壤中添加诸如磷酸盐、硅酸盐和石灰等改良剂，使土壤中的重金属得以稳定，不易被植物吸收。这种方法操作简单，缺点是只改变了重金属的形态，并没有根本去除重金属，重金属元素仍保留在土壤中，很容易再度活化而危害植物。在一些镉污染比较严重的地方通过更换土壤的方法进行治理，而更换土壤需要大量资金和可更换的土壤，同时对置换出来的污土集中处理也是一个难点。另外，通过转基因技术也可达到降低水稻植株镉的积累，但人们会担心转基因水稻的种植可能引起新的食品安全问题。因此，选用一种更经济实用的技术措施对于有效降低稻谷重金属残留是必要的。
[0004]为了实现农业产业的可持续发展，人们越来越重视生物修复技术。生物修复是指在一定条件下利用植物、动物和微生物吸收、降解、转化土壤和水体中的污染物，使环境中的污染物浓度降低到可接受的水平，该技术已经引起土壤学家、植物学家和环境科学家的广泛关注。
[0005]中国专利申请2 01310104049.7公开了里氏木霉联合伴矿景天在镉污染农田土壤修复中的应用，菌剂使用方法是在伴矿景天幼苗根际施加里氏木霉FSlO-C发酵液或微生物制剂；中国专利申请201210137704公开了一种利用丛枝菌根修复重金属污染土壤的方法，菌种使用方法是将丛枝菌根接种于稗草根部。上述两项专利是用生物菌种来提高寄主植物吸收土壤中重金属的能力，随后移除寄主植物，完成重金属污染土壤的修复。这类方法能够降低土壤中的重金属含量，但同时也降低了耕地的复种指数，且如何处理寄主植物也是生产实际中的难题。中国专利申请20121007120和201010525189均公开了一种利用丛枝菌根真菌降低烟草重金属残留的方法，丛枝菌根真菌和烟草形成丛枝菌根共生体，促进烟草生长，降低烟草重金属残留。但丛枝菌根真菌不能人工培养，在生产中的推广应用受到了影响。
[0006]印度梨形孢是一种根部内生真菌，具有广泛的寄主范围，能促进植物生长，诱导植物产生系统抗病性，提高寄主对非生物胁迫的抗性等。同时，印度梨形孢不同于丛枝菌根真菌，它可在培养基上生长，这就为该菌在农业和园艺业的大面积应用提供可能(楼兵干，孙超，蔡大广.印度梨形孢的多种功能及其应用前景[J].植物保护学报.2007, 34(6):653-656)。因此，通过开发利用印度梨形孢，在不影响水稻产量的前提下达到降低水稻体内重金属含量，尤其是稻米中镉的含量，具有广泛的应用前景。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种利用植物内生真菌印度梨形孢降低水稻地上部重金属镉含量的方法，以降低稻米中的重金属镉残留。
[0008]本发明采用如下技术方案:
[0009]本发明降低水稻地上部镉含量方法的具体步骤如下:
[0010](I)含0.01g/L纳米材料氧化锌培养基的配制；
[0011]用纳米材料氧化锌代替原Kafer培养基中的ZnSO4.7H20，在I升培养基中加入纳米材料氧化锌IOmg ；
[0012](2)印度梨形孢菌丝液灌根处理水稻秧苗根部；
[0013]将活化后的印度梨形孢接种于步骤(1)所述的液体Kafer培养基中培养，然后收集菌丝体，制备印度梨形孢菌丝液，接着浇灌于水稻秧苗根部，灌根处理，使印度梨形孢定殖于水稻根部；
[0014](3)水稻秧苗的移栽和后期的管理
[0015]经印度梨形孢定殖后水稻移栽到大田，之后进行常规的水肥管理，使水稻正常生长至收获。
[0016]步骤(1)中，纳米`材料氧化锌的粒径为30nm。
[0017]步骤(1)中，所述的Kafer培养基配方为每升培养基中含有:2.0Og蛋白胨、1.0Og酵母提取物、1.0Og 水解酪蛋白、0.60gNaN03、0.52gKCl、0.52gMgS04.7H20、1.52gKH2P04、
0.52gZnS04.7H20, IOmgH3BO3^mgMnSO4.H20、1.6mgCoCl.5H20、1.6mgCuS04.5H20、
1.1mg(NH4)6MO7O24U.3mgFeS04、l.8mgEDTA、0.1Omg 硫胺素、0.04mg 甘氨酸、0.01mg 烟酸、0.01mg批唆醇。
[0018]步骤(2)中，所述的印度梨形孢菌丝液的制备方法如下:在25°C~28°C、100rpm~120rpm避光摇床上，用含0.01g/L纳米材料氧化锌的Kafer培养基培养印度梨形孢7_10天，过滤，收集菌丝体，用蒸懼水配成浓度为lg/L-4g/L的菌丝液。
[0019]步骤(2)中，所述印度梨形孢菌丝液印度梨形孢菌丝液浓度为lg/L_4g/L。
[0020]步骤(2)中，所述灌根处理时水稻苗龄为7-14天。
[0021 ] 本发明的积极效果如下:
[0022]1.与丛枝菌根真菌相比，印度梨形孢可在培养基上生长，应用方便；
[0023]2.在含纳米材料ZnO (30nm) 0.01mg/L的Kafer培养基培养的印度梨形孢，其在水稻根部的定殖率显著提高，由原来的80.0%提高到95.0%，同时使水稻生长更健壮。
[0024]3.本发明的内生真菌印度梨形孢菌剂能够改善水稻的营养状况，提高水稻叶片叶绿素含量，增强光合作用，促进水稻生长，提高水稻产量。本发明能在不影响农业生产的情况下降低水稻地上部重金属镉残留，水培试验表明在3mg/LCd胁迫下12天，接种印度梨形孢的水稻幼苗其地下部和地上部Cd含量分别是对照的9.84和0.61倍；盆栽试验表明，在3mg/kgCd胁迫下，分蘖期水稻的根、茎杆和叶片的Cd含量分别是对照的1.24、0.58和0.52倍，灌浆期水稻的根、茎杆、叶片和糙米的Cd含量分别是对照的1.24,0.66,0.57和0.55倍。本方法易于掌握、成本较低、简单实用，绿色环保，不会引起二次污染，适合用于无公害水稻的生产；它不仅适用于重金属污染土壤中水稻的种植，对于非污染土壤也可使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1是纳米材料Zn0(30nm)对印度梨形孢菌落形态和生物量影响的示意图。
[0026]图2是印度梨形孢在水稻根部定殖的示意图。
[0027]图3是水培条件下印度梨形孢对水稻幼苗不同部位镉含量影响的示意图。
[0028]图4是盆栽条件下印度梨形孢对分蘖期水稻不同组织镉含量影响的示意图。
[0029]图5是盆栽条件下印度梨形孢对灌浆期水稻不同组织镉含量影响的示意图。
[0030]图6是在不同镉浓度胁迫下印度梨形孢对水稻叶片叶绿素含量影响的动态变化的示意图。
[0031]图7是在不同镉浓度胁迫下印度梨形孢对水稻叶片丙二醛(MDA)含量影响的动态变化的示意图。
[0032]图8是在25mg/L镉胁迫下印度梨形孢对水稻叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性影响的动态变化的示意图。
[0033]图9是在25mg/L镉胁迫下印度梨形孢对水稻叶片过氧化物酶(POD)活性影响的动态变化的示意图。
【具体实施方式】
[0034]下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0035]实施例1
[0036]一种降低水稻地上部镉积累的方法，包括如下步骤:
[0037]菌种的活化:将保存在冰箱里的印度梨形孢菌种接种于Kafer培养基(KM)平板上，置于28°C恒温箱里避光培养7天。用直径为5mm的打孔器在活化好的印度梨形孢菌落边缘打孔。
[0038]菌液的培养:配制液体Kafer培养基和含纳米材料ZnO (30nm) 0.0I g/L的液体Kafer培养基(即以纳米材料ZnO (30nm)代替ZnS04)，用250ml三角锥形瓶分装，每瓶装150ml培养基，灭菌备用。在无菌条件下，将印度梨形孢菌丝块加入装有上述培养基的三角锥形瓶中，每瓶4块菌丝块；置于恒温摇床120rpm、28°C避光振荡培养5天。
[0039]菌丝体的收集:用四层纱布过滤，用无菌蒸馏水冲洗菌丝体2-3遍，冲掉残留的液体Kafer培养基，将纱布拧干，用灭过菌的镊子收集纱布上的菌丝体，放入50mL的离心管中，直于4 C保存，备用；
[0040]菌丝液浇灌到秧苗根部:用水将印度梨形孢菌丝配成含菌丝浓度为4g/L的菌丝液，将菌丝液浇灌于苗龄为10天的水稻秧苗根部，设2个处理与I个对照。处理I为含纳米材料ZnO (30nm)的液体Kafer培养基培养的印度梨形孢菌丝液，处理2为普通液体Kafer培养基培养的印度梨形孢菌丝液，对照浇灌相同体积的水。菌丝液浇灌秧苗根部后14天，移栽到塑料桶中，同时抽样检测比较印度梨形孢在水稻根部的定殖情况。
[0041]通过台盼蓝染色显微镜下观察检测印度梨形孢在水稻根部的定殖情况，结果显示处理I的定殖率为95%，处理2的定殖率为80%，结果表明含纳米材料Zn0(30nm)的液体Kafer培养基培养的印度梨形孢菌丝在水稻根部的定殖率明显提高。
[0042]将水稻秧苗移至塑料桶中栽培:挑选处理I和对照中长势一致的苗龄为25天水稻秧苗移栽至塑料桶(内径为30cm，高度为28cm)中，桶内装有含3mg/kgCd的土壤颗粒，每桶种植4穴，每穴2株，对照和处理各5桶。在水稻的整个生育期，保持水面深为l-2cm。
[0043]测定水稻不同组织的镉含量:分别在水稻分蘖期和灌浆期取样，测定Cd元素含量，结果是处理组水稻植株地上部组织的镉含量显著低于对照。如分蘖期，茎杆和叶片镉含量分别降低了 41.6%和48.0% (图4);灌浆期，茎杆、叶片和糙米镉含量分别降低了 33.5%、42.6% 和 44.5% (图 5)。
[0044]实施例2
[0045]将实施例1中盆栽水稻改成水培水稻，用营养液(参照国际水稻研究所(IRRI)配方)培养，置(25± I) °C、14h/10h光暗交替的植物生长室中，每5d更换一次营养液，最终同样能降低水稻地上部镉的积累。如3mg/L镉胁迫处理12天后，接种印度梨形孢的水稻地上部的镉含量比对照降低了 38.4% (图3)。
[0046]水培条件下，印度梨形孢显著提高了水稻对镉胁迫的耐性。例如，25mg/L镉处理后第12天，接种印度梨形孢的水稻幼苗的老叶开始表现出轻微的发黄症状，而对照组水稻苗的最大功能叶已经失绿；而在50mg/L镉胁迫下，对照组水稻幼苗的绝大多数叶片变黄枯死，只有少数叶片呈绿色，此时接种印度梨形孢的水稻幼苗也表现出较为明显的镉中毒症状，但是其症状远远轻于对照。
[0047]镉胁迫下，水稻首先表现出来的毒害症状是叶片变黄失绿，因此叶绿素含量的变化幅度可以反映出镉元素对水稻的毒害程度。在不同Cd浓度胁迫下、不同取样时间，接种印度梨形孢的水稻植株其叶绿素含量均比对照高，平均比对照增加13.5%。例如在Cd3和Cd25水平下，Cd处理后第1`2天时，接种印度梨形孢的水稻植株其叶绿素含量分别比对照提高了 58.7%和43.2%。说明在镉胁迫下，印度梨形孢可以减弱镉元素对叶绿素的影响，增强光合作用，促进水稻生长，缓解镉对水稻的毒害作用(图6)。
[0048]丙二醛(MDA)含量通常用于衡量植物体内脂质过氧化程度，以及判断植物对胁迫环境反应的强弱。在长时间或者高浓度镉胁迫下，印度梨形孢可以降低水稻体内MDA含量，削弱膜脂过氧化程度，维持细胞的正常膨压和生理代谢，提高水稻对镉胁迫的耐性。(图7)
[0049]超氧化物歧化酶(SOD)是植物抗氧化系统的第一道防线，其活性的高低变化能够反映出对氧化损伤的修复能力。在25mg/LCd浓度下，不同时间点，接种印度梨形孢的水稻叶片SOD几乎都显著高于对照。说明印度梨形孢诱导水稻产生S0D，其增强了活性氧的清除能力，减轻了 Cd所带来的胁迫压力(图8)。
[0050]过氧化物酶(POD)的作用是清除SOD催化反应的产物H2O2,使植物体免受其危害。随着镉处理时间的延长，水稻叶片POD活性增强。在25mg/LCd胁迫下，不同取样时间，接种印度梨形孢的水稻叶片中POD活性均高于对照，如在第9天和第12天分别提高了 20.1%和26.6%(图9)。说明印度梨形孢可以增强水稻叶片POD活性，说明该菌激活了水稻叶片中的活性氧清除系统，降低了活性氧含量。
[0051]实施例3
[0052]将实施例1中印度梨形孢菌丝块改成印度梨形孢孢子液，接种于含0.01g/LZnO的液体Kafer培养基中，于恒温摇床100rpm、25°C避光振荡培养7天，其余等同于实例1，最终也能降低水稻地上部镉的积累。
[0053]实施例4
[0054]将实施例1中印度梨形孢菌丝液浓度改为lg/L，其余等同于实例I，最终也能达到降低水稻地上部镉的积累。
[0055]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所 附权利要求及其等同物限定。
【权利要求】
1.一种降低水稻地上部镉含量的方法，其特征在于:所述方法的具体步骤如下: (1)含0.01g/L纳米材料氧化锌培养基的配制； 用纳米材料氧化锌代替原Kafer培养基中的ZnSO4.7H20，在I升培养基中加入纳米材料氧化锌IOmg ； (2)印度梨形孢菌丝液灌根处理水稻秧苗根部； 将活化后的印度梨形孢接种于步骤(1)所述的液体Kafer培养基中培养，然后收集菌丝体，制备印度梨形孢菌丝液，接着浇灌于水稻秧苗根部，灌根处理，使印度梨形孢定殖于水稻根部； (3)水稻秧苗的移栽和后期的管理 经印度梨形孢定殖后水稻移栽到大田，之后进行常规的水肥管理，使水稻正常生长至收获。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，纳米材料氧化锌的粒径为30nmo
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，所述的Kafer培养基配方为每升培养基中含有:2.0Og蛋白胨、1.0Og酵母提取物、1.0Og水解酪蛋白、0.60gNaN03、0.52gKCl、0.52gMgS04.7Η20、1.52gKH2P04、0.52gZnS04.7H20, IOmgH3BO3^mgMnSO4.H2O,1.6mgCoCl.5H20、L 6mgCuS04.5H20、1.1mg (NH4)6MO7O24U.3mgFeS04、l.8mgEDTA、0.1Omg 硫胺素、0.04mg甘氨酸`、0.01mg烟酸、0.01mg批卩多醇。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述的印度梨形孢菌丝液的制备方法如下:在25°C~28°C、100rpm~120rpm避光摇床上，用含0.01g/L纳米材料氧化锌的Kafer培养基培养印度梨形孢7_10天，过滤,收集菌丝体，用蒸懼水配成浓度为lg/L_4g/L的菌丝液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述印度梨形孢菌丝液印度梨形孢菌丝液浓度为lg/L-4g/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述灌根处理时水稻苗龄为7-14 天。
【文档编号】A01G16/00GK103858719SQ201410087609
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】楼兵干, 吴金丹, 刘晓曦, 陈乾, 高其康, 林福呈 申请人:浙江大学