一种应用dse真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法

文档序号:249261阅读:321来源:国知局
一种应用dse真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法
【专利摘要】本发明公开了一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其先分别培养DSE真菌和蓝莓苗,再分别将DSE真菌与蓝莓扦插苗、蓝莓幼苗和一年生蓝莓苗进行共生栽培,本发明可以促进蓝莓扦插苗的生根和蓝莓幼苗根系的发育,大大缩短育苗的生长周期;可以加快一年生蓝莓苗的根系发育,增加蓝莓分支的数量和苗的生长量,提高蓝莓苗的抗旱性。本发明栽培方法操作简单、易于大面积推广,投资少、增产效果显著。
【专利说明】一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法
[0001]【技术领域】:
本发明属于生物【技术领域】,具体涉及一种应用从越橘属植物蓝莓根内分离获得的DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法。
[0002]【背景技术】:
蓝莓(Blueberry),学名越桔,属于杜醇花科、越橘亚科、越橘属(spp.)多年生落叶或常绿灌木。原产地和主产区都在美国。其果实中含有丰富的营养成分,具有延缓脑神经衰老、解除眼睛疲劳并增加视力、增强心脏功能和抗癌的独特功效,联合国粮农组织将其列为人类五大健康食品之一。
[0003]目前,国际上栽培的蓝莓品种主要有:适于温带栽培的高灌蓝莓,适于高寒地带栽培的矮灌蓝莓和适于亚热带或热带栽培的兔眼蓝莓。蓝莓的根系细,呈纤维状,没有根毛,吸收能力小,适宜在土壤疏松、湿润、有机质含量高的地域栽培,其光合最适温度范围相对较小。由于蓝莓对生长环境要求高,自然繁殖率低,生长缓慢,在加上蓝莓果本身较高的营养价值,近年来对蓝莓的需求量不断增加,导致蓝莓的价格昂贵。
[0004]蓝莓的试管苗快速繁殖虽然获得了成功,但试管苗的培养步骤复杂且难度高,尤其是幼苗生根方面,一般的培养基生根率不高;试管苗出瓶后生长缓慢、生长周期长等问题成为制约蓝莓大面积栽培的主要障碍。
[0005]
【发明内容】
:
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种方法简单、易于大面积推广,投资少、不施任何肥料和农药,缩短育苗的生产周期,增加蓝莓苗的分支数量和苗的生长量,提高苗的抗旱性,实现蓝莓绿色优质高产的应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法。
[0006]本发明的目的可以通过如下措施来达到:一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于其包括如下步骤:
1)、DSE真菌的培养:
将DSE真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后,转接于PDA培养基的平皿中,于21-25°C恒温培养11-19天,分别在菌落边缘打孔成菌饼,并接入液体培养基进行培养或接入固体培养基进行培养;
所述的DSE真菌液体培养基的组成按重量百分计为:葡萄糖1.5-4.5%,麦芽浸膏
1.5-4.5%,大豆蛋白胨0.3-0.7%,余量水,培养基pH值为50-6.0 ;震荡培养,培养容器装量10-40% ;液体培养基高压灭菌后接入DSE真菌;种子菌种接种量为培养容器装量的10-20% ;液体培养的培养条件为:摇床震荡转速为130-150r/min ;21_25°C培养26-30天;培养结束后可直接使用或用匀浆机打碎菌体后备用;
所述的DSE真菌固体培养基由固体基本培养基与液体MEA组成,固体基本培养基的组成按重量计为:麦麸:麦壳:阔叶树锯末=1-2:1-3:1-3 ;液体MEA量为以上麦麸、麦壳、阔叶树锯末总重量的20-40%,培养基pH为5.0-6.0,静置培养,培养容器装量30-70% ;固体培养基灭菌后接入DSE真菌,菌种接种量为培养容器装量的10-20%;固体培养的培养条件为:21-25°C培养26-30天;待菌丝长满整个培养基质时培养结束,可直接使用或用粉碎机粉碎后备用;
2)、蓝莓苗的培养:
(1)蓝莓芽分化:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖或食用白砂糖20-40g、琼脂5-15g,添加的植物激素为玉米素1.0-3.0mg,培养基pH5.0-6.0 ;静置暗培养,培养容器装量10_30%,光照培养的条件为温度15-25°C,光照强度为1000-30001x,光照时间8_16h/天,培养时间40-120天;
(2)蓝莓丛芽增殖:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖或食用白砂糖20-40g、琼脂5-15g,添加的植物激素为玉米素0.5-2.5mg,培养基pH5.0-6.0 ;静置暗培养,培养容器装量10_30%,光照培养的条件为温度15-25°C,光照强度为1000-30001x,光照时间8_16h/天,培养时间40-120天;
(3))蓝莓苗继代培养:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖或食用白砂糖20-40g、琼脂5-15g,添加的植物激素为玉米素0.5-2.5mg,培养基pH5.0-6.0 ;静置暗培养,培养容器装量10_30%,光照培养的条件为温度15_25°C,光照强度为1000-30001x,光照时间8_16h/天,培养时间40-120天;
(4)蓝莓壮苗生根:按常规组培技术培养,所用的培养基是以1/2WPM培养基为基本培养基,在每升1/2WPM培养基中均添加蔗糖或食用白砂糖20-40g,用滤纸球或小棉花团铺满所用的培养容器的底部,添加的植物激素为吲哚丁酸0.5-2.5mg,培养基pH5.0-6.0 ;静置暗培养,培养容器装量10-30%,光照培养的条件为温度15-25°C,光照强度为1000-30001x,光照时间8-16h/天,培养时间40-120天;
(5)蓝莓扦插苗培养或蓝莓幼苗培养或一年生蓝莓苗培养:
所述的蓝莓扦插苗培养:经继代培`养的蓝莓组培苗经低温驯化后,剪取生长健壮5-6cm的茎段以苔藓为栽培基质扦插到营养穴盘里,扦插后生长30-50天,然后剪取5-6cm的生长健壮、长势均一的营养穴盘蓝莓苗的无根茎段作为蓝莓扦插苗;
所述的蓝莓幼苗培养:壮苗生根培养后的蓝莓组培苗经低温驯化后移栽到以苔藓和草炭土为栽培基质的营养钵里,生长20-40天,即为蓝莓幼苗;
所述的一年生蓝莓苗培养:上述蓝莓幼苗继续生长11-13月,即为一年生蓝莓苗;
3)、DSE真菌与蓝莓的共生栽培:
蓝莓扦插苗或蓝莓幼苗或一年生蓝莓苗与DSE真菌按以下方法共生栽培:
(1)蓝莓扦插苗与DSE真菌的共生栽培:在具有遮阳网的露天大棚,或塑料薄膜温室,或玻璃温室中进行育苗载培,栽培蓝莓扦插苗的株距为3-lOcm ;培养条件为18-25°C光照培养,光照强度为20001x,光照时间16h/天,环境湿度为60%-80% ;在上述蓝莓扦插苗的基部放置3/5穴孔容积的栽培基质后,采用上述DSE真菌培养物与蓝莓扦插苗共生栽培,最后用栽培基质把扦插苗固定好,蓝莓扦插苗在14天左右开始生根,6个月后生长为根系发达的蓝莓幼苗;
(2)蓝莓幼苗与DSE真菌的共生栽培:在具有遮阳网的露天大棚,或塑料薄膜温室,或玻璃温室中进行育苗载培,栽培蓝莓幼苗的株距为10-30cm,培养条件为间歇光照培养,光照强度为1000-30001χ,光照时间8-16h,环境湿度为60-80% ;放置栽培基质后,在上述蓝莓幼苗根部施加备好的DSE真菌液体或固体培养物,DSE真菌液体培养物的添加量为30-100mL,或DSE真菌固体培养物的添加量为20_60g ;蓝莓幼苗与DSE真菌共生60天后均形成菌根结构,继续生长2个月后可转移至大田进行大面积栽培;
(3)一年生蓝莓苗与DSE真菌蓝莓的大田栽培:先在大田中挖出定植穴,株距为20-60cm,再在定植穴内铺放栽培基质并施加的DSE真菌液体培养物30_100mL,或DSE真菌固体培养物20-60g,最后把上述一年生蓝莓苗栽培于定植穴中;在蓝莓生长过程中每年可以补施DSE真菌液体或固体培养物1-7次。
[0007]为了进一步实现本发明的目的,所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培中的栽培基质为苔藓。
[0008]为了进一步实现本发明的目的,所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培中的栽培基质为苔藓和草炭土,这2种材料加入量之间的比例按重量计为:苔藓:草炭土 =1-5:1-5。
[0009]为了进一步实现本发明的目的,所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培中的栽培基质为苔藓、草炭土和蛭石,这3种材料加入量之间的比例按重量计为:苔藓:草炭土:蛭石=1-5:1-5:1-2。
[0010]为了进一步实现本发明的目的,所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培中的栽培基质为有机土和草炭土,这2种材料加入量之间的比例按重量计为:有机土:草炭土=1-5:1-5。
[0011]为了进一步实现本发明的目的,所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培中的栽培基质为沙土和草炭土,这2种材料加入量之间的比例按重量计为:沙土:草炭土 =1-3:1-5。
[0012]为了进一步实现本发明的目的,所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培中的栽培基质为有机土;
为了进一步实现本发明的目的,`所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培步骤(1)蓝莓扦插苗与DSE真菌的共生栽培中在蓝莓扦插苗的基部放置3/5穴孔容积的栽培基质后,在蓝莓扦插苗基部施加上备好的DSE真菌液体培养物2-10mL或DSE真菌固体培养物2_10g,最后用栽培基质把扦插苗固定好。
[0013]为了进一步实现本发明的目的,所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培步骤(1)蓝莓扦插苗与DSE真菌的共生栽培中在蓝莓扦插苗的基部放置3/5穴孔容积的3/5栽培基质后,先用DSE真菌液体培养物浸泡扦插苗,真菌液体培养物的添加标准为完全浸没扦插苗,浸泡的时间为10-30min,再用栽培基质把蓝莓扦插苗固定好即可。
[0014]为了进一步实现本发明的目的,所述的DSE真菌于2013年10月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏,保藏编号为=CGMCC N0.8260。
[0015]本发明同已有技术相比可产生如下积极效果:DSE真菌能够侵染蓝莓根系,并且促进蓝莓根系的发育和苗的生长,提高苗的抗旱性,本发明利用菌根技术将蓝莓与DSE真菌共生栽培,解决了蓝莓育苗中幼苗生根率低,生长缓慢等问题,可以促进蓝莓扦插苗的生根和蓝莓幼苗根系的发育,大大缩短育苗的生长周期;增加蓝莓分支的数量和苗的生长量,提高蓝莓苗的抗旱性。将DSE真菌用于蓝莓的育苗和大田栽培,对于蓝莓的大面积栽培具有重大的理论意义和应用价值。本发明栽培方法操作简单、易于大面积推广,投资少、增产效果显著。
[0016]【具体实施方式】:
下面结合附图和具体实例对本发明作出进一步的说明,本发明的保护范围不受实施例的限制。
[0017]DSE真菌是一种枝孢属iCladosporiimi)的芽枝状枝孢菌iCladosporiumcladosporioides),以下采用的DSE真菌于2013年10月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏,保藏编号为:CGMCC N0.8260。
[0018]实施例1:
一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗的方法,其特征在于其包括如下步骤:
UDSE真菌的培养:
将DSE真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后,转接于PDA培养基的平皿中,于23°C恒温培养15天,用Φ 5mm的打孔器分别在菌落边缘打孔成菌饼,并接入液体培养基进行培养。液体培养基的组成按重量百分计为:葡萄糖2%,麦芽浸膏3%,大豆蛋白胨0.5%,余量水,培养基PH值为5.5 ;用玻璃三角瓶震荡培养,培养容器装量25% ;;液体培养基高压灭菌后接入DSE真菌;种子菌种接种量为培养容器装量的15% ;摇床震荡转速为140r/min ;23°C培养28天;培养结束后用匀浆机打碎菌体后备用。
[0019]2、蓝莓苗的培养:
(1)蓝莓芽分化:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖30g、琼脂10g、玉米素2.0mg,培养基pH5.5 ;用玻璃三角瓶静置暗培养,培养容器装量20%,光照培养的条件为温度20°C,光照强度为20001x,光照时间12h/天,培养时间80天;
(2)蓝莓丛芽增殖:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖30g、琼脂10g、玉米素1.5mg,培养基pH5.5 ;用玻璃三角瓶静置暗培养,培养容器装量`20%,光照培养的条件为温度20°C,光照强度为20001x,光照时间12h/天,培养时间80天;
(3))蓝莓苗继代培养:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖30g、琼脂10g、玉米素1.5mg,培养基pH5.5 ;用玻璃三角瓶静置暗培养,培养容器装量20%,光照培养的条件为温度20°C,光照强度为20001x,光照时间12h/天,培养时间80天;
(4)蓝莓壮苗生根:按常规组培技术培养,所用的培养基是以1/2WPM培养基为基本培养基,在每升1/2WPM培养基中均添加蔗糖30g,用滤纸球或小棉花团铺满所用的培养容器的底部,添加的植物激素为IBA (吲哚丁酸)1.5mg,培养基pH5.5 ;用玻璃三角瓶静置暗培养,培养容器装量20%,光照培养的条件为温度20°C,光照强度为20001x,光照时间12h/天,培养时间80天;
(5)蓝莓扦插苗培养:
经继代培养的蓝莓组培苗经低温驯化后,剪取生长健壮5-6cm的茎段以苔藓为栽培基质扦插到5cm高128孔的营养穴盘里,扦插后生长30-50天,即为营养穴盘蓝莓苗。然后剪取5-6cm的生长健壮、长势均一的营养穴盘蓝莓苗的无根茎段作为蓝莓扦插苗;
3、DSE真菌与蓝莓扦插苗的共生栽培:
(I)栽培基质:苔藓。
[0020](2)蓝莓扦插苗与DSE真菌按以下方法共生栽培:在具有遮阳网的露天大棚,或塑料薄膜温室,或玻璃温室中进行育苗载培,栽培工具为5 cm高128孔的营养穴盘,立体栽培;栽培蓝莓扦插苗的株距为3-lOcm ;在蓝莓扦插苗的基部平铺一层3/5穴孔容积的苔藓,用上述备好的DSE真菌液体培养物浸泡扦插苗,真菌液体培养物的添加标准为完全浸没扦插苗,浸泡的时间为10-30min,再用苔藓把蓝莓扦插苗固定好即可;将穴盘放置在玻璃温室中,环境温度为18~25°C,光照强度为2000Lx,光照时间为16h,环境湿度为60%_80%。
[0021](3)蓝莓苗的收获:
蓝莓扦插苗在14天左右开始生根,6个月后生长为根系发达的蓝莓幼苗,即可为市场提供大面积栽培的蓝莓苗。
[0022]实施例2:
一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于其包括如下步骤: UDSE真菌的培养:
将DSE真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后,转接于PDA培养基的平皿中,于21°C恒温培养19天,用Φ 5mm的打孔器分别在菌落边缘打孔成菌饼,并接入液体培养基进行培养。液体培养基的组成按重量百分计为:葡萄糖1.5%,麦芽浸膏4.5%,大豆蛋白胨0.3%,余量水,培养基PH值为5 ;用玻璃罐头瓶震荡培养,培养容器装量10% ;;液体培养基高压灭菌后接入DSE真菌;种子菌种接种量为培养容器装量的10% ;摇床震荡转速为130r/min ;21°C培养30天;培养结束后备用。
[0023]2、蓝莓苗的培养:
(1)蓝莓芽分化:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加食用白砂糖20g、琼脂5g、玉米素1.0mg,培养基pH5 ;用玻璃罐头瓶静置暗培养,培养容器装量10%,光照培养的条件为温度15°C,光照强度为30001x,光照时间8h/天,培养时间120天;` (2)蓝莓丛芽增殖:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加食用白砂糖20g、琼脂5g、玉米素0.5mg,培养基pH5 ;用玻璃罐头瓶静置暗培养,培养容器装量10%,光照培养的条件为温度15°C,光照强度为30001x,光照时间8h/天,培养时间120天;
(3))蓝莓苗继代培养:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加食用白砂糖20g、琼脂5g、玉米素0.5mg,培养基pH5 ;用玻璃罐头瓶静置暗培养,培养容器装量10%,光照培养的条件为温度15°c,光照强度为30001x,光照时间8h/天,培养时间120天;
(4)蓝莓壮苗生根:按常规组培技术培养,所用的培养基是以1/2WPM培养基为基本培养基,在每升1/2WPM培养基中均添加食用白砂糖20g,用滤纸球或小棉花团铺满所用的培养容器的底部,添加的植物激素为IBA (吲哚丁酸)0.5mg,培养基pH5 ;用玻璃罐头瓶静置暗培养,培养容器装量10%,光照培养的条件为温度15°C,光照强度为30001x,光照时间8h/天,培养时间120天;
(5)蓝莓幼苗培养:
壮苗生根培养后的蓝莓组培苗经低温驯化后移栽到以苔藓和草炭土为栽培基质的营养钵里,生长20-40天,即为蓝莓幼苗;
3、DSE真菌与蓝莓幼苗的共生栽培:
(I)栽培基质为苔藓和草炭土,这2种材料加入量之间的比例按重量计为:苔藓:草炭土 =1-5:1-5 ;先将苔藓用蒸馏水浸泡7-10个小时,使其充分吸收水分,在浙干多余水分后与草炭土混合。
[0024](2)蓝莓幼苗与DSE真菌按以下方法共生栽培:
在具有遮阳网的露天大棚,或塑料薄膜温室,或玻璃温室中进行育苗载培,栽培蓝莓幼苗的株距为10-30cm,培养条件为25°C /18°C光照培养,光照强度为1000_30001x,光照时间8-16h,环境湿度为60-80% ;用IOcmX 20cm (底直径X高)营养钵,将营养钵的底部放置3/5的苔藓和草炭土混合基质后,在蓝莓幼苗的根部加入备好的DSE真菌液体培养物30_100mL。
[0025](3 )蓝莓苗的收获:
蓝莓幼苗与DSE真菌共生60天后均形成菌根结构,蓝莓幼苗根系发达且生长旺盛,植株上有分枝长成,继续生长2个月后可转移至大田进行大面积栽培。
[0026]实施例3:
一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于其包括如下步骤: UDSE真菌的培养:
将DSE真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后,转接于PDA培养基的平皿中,于25V恒温培养11天,用Φ5_的打孔器分别在菌落边缘打孔成菌饼,并接入液体培养基进行培养。液体培养基的组成按重量百分计为:葡萄糖4.5%,麦芽浸膏1.5%,大豆蛋白胨0.7%,余量水,培养基PH值为6 ;用塑料瓶器皿震荡培养,培养容器装量40% ;;液体培养基高压灭菌后接入DSE真菌;种子菌种接种量为培养容器装量的20% ;摇床震荡转速为150r/min ;25°C培养26天;培养结束后用匀浆机打碎菌体后备用。
[0027]2、蓝莓苗的培养:
(1)蓝莓芽分化:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖40g、琼脂15g、玉米素3.0mg,培养基pH6 ;用塑料瓶器皿静置暗培养,培养容器装量30%,光照培养的条件为温度25°C,光照强度为ΙΟΟΟΙχ,光照时间16h/天,培养时间40天;
(2)蓝莓丛芽增殖:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖40g、琼脂15g、玉米素2.5mg,培养基pH6 ;用塑料瓶器皿静置暗培养,培养容器装量30%,光照培养的条件为温度25°C,光照强度为ΙΟΟΟΙχ,光照时间16h/天,培养时间40天;
(3))蓝莓苗继代培养:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖40g、琼脂15g、玉米素2.5mg,培养基pH6 ;用塑料瓶器皿静置暗培养,培养容器装量30%,光照培养的条件为温度25°C,光照强度为1000lx,光照时间16h/天,培养时间40天;
(4)蓝莓壮苗生根:按常规组培技术培养,所用的培养基是以1/2WPM培养基为基本培养基,在每升1/2WPM培养基中均添加蔗糖40g,用滤纸球或小棉花团铺满所用的培养容器的底部,添加的植物激素为IBA (吲哚丁酸)2.5mg,培养基pH6 ;用塑料瓶器皿静置暗培养,培养容器装量30%,光照培养的条件为温度25°C,光照强度为ΙΟΟΟΙχ,光照时间16h/天,培养时间40天;
(5)蓝莓幼苗培养:壮苗生根培养后的蓝莓组培苗经低温驯化后移栽到以苔藓和草炭土为栽培基质的营养钵里,生长20-40天,即为蓝莓幼苗;
(6)一年生蓝莓苗培养:上述蓝莓幼苗继续生长11-13月,即为一年生蓝莓苗。
[0028]3、DSE真菌与一年生蓝莓苗培养的共生栽培:
(1)栽培基质为沙土和草炭土,这2种材料加入量之间的比例按重量计为:沙土:草炭土 =1-3:1-5 ;
(2)—年生蓝莓苗与DSE真菌按以下方法共生栽培:在土壤有机质含量丰富且土壤pH适宜的大田中进行栽培,栽培时,先在大田中挖出定植穴,株距为20-60cm,再在定植穴内铺放栽培基质并施加DSE真菌液体培养物30-100mL,最后把上述一年生蓝莓苗栽培于定植穴中。在蓝莓生长过程中每年可以补施DSE真菌液体培养物1-7次。
[0029](3)DSE真菌与一年生蓝莓苗共生栽培的结果:DSE真菌与一年生蓝莓苗共生60天后可明显看到蓝莓苗生长旺盛且分枝增多,抗旱能力明显增强。
[0030]实施例4:
一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗的方法,其特征在于其包括如下步骤:
UDSE真菌的培养:
将DSE真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后,转接于PDA培养基的平皿中,于23°C恒温培养15天,用Φ 5mm的打孔器分别在菌落边缘打孔成菌饼,并接入DSE真菌固体培养基进行培养。DSE真菌固体培养基由固体基本培养基与液体MEA组成,固体基本培养基的组成按重量计为:麦麸:麦壳:阔叶树锯末=1:1:1 ;液体MEA量为以上麦麸、麦壳、阔叶树锯末总重量的30%,培养基pH为5.5`,采用玻璃三角瓶5静置培养,培养容器装量50% ;DSE真菌固体培养基灭菌后接入DSE真菌,菌种接种量为培养容器装量的15% ;固体培养的培养条件为:23°C培养28天;待菌丝长满整个培养基质时培养结束,用粉碎机粉碎后备用。
[0031]2、蓝莓苗的培养:
(1)蓝莓芽分化:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖30g、琼脂10g、玉米素2.0mg,培养基pH5.5 ;用玻璃三角瓶静置暗培养,培养容器装量20%,光照培养的条件为温度20°C,光照强度为20001x,光照时间12h/天,培养时间80天;
(2)蓝莓丛芽增殖:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖30g、琼脂10g、玉米素1.5mg,培养基pH5.5 ;用玻璃三角瓶静置暗培养,培养容器装量20%,光照培养的条件为温度20°C,光照强度为20001x,光照时间12h/天,培养时间80天;
(3))蓝莓苗继代培养:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖30g、琼脂10g、玉米素1.5mg,培养基pH5.5 ;用玻璃三角瓶静置暗培养,培养容器装量20%,光照培养的条件为温度20°C,光照强度为20001x,光照时间12h/天,培养时间80天;
(4)蓝莓壮苗生根:按常规组培技术培养,所用的培养基是以1/2WPM培养基为基本培养基,在每升1/2WPM培养基中均添加蔗糖30g,用滤纸球或小棉花团铺满所用的培养容器的底部,添加的植物激素为IBA (吲哚丁酸)1.5mg,培养基pH5.5 ;用玻璃三角瓶静置暗培养,培养容器装量20%,光照培养的条件为温度20°C,光照强度为20001x,光照时间12h/天,培养时间80天;
(5)蓝莓扦插苗培养:
经继代培养的蓝莓组培苗经低温驯化后,剪取生长健壮5-6cm的茎段以苔藓为栽培基质扦插到5cm高128孔的营养穴盘里,扦插后生长30-50天,即为营养穴盘蓝莓苗。然后剪取5-6cm的生长健壮、长势均一的营养穴盘蓝莓苗的无根茎段作为蓝莓扦插苗;
3、DSE真菌与蓝莓扦插苗的共生栽培:
(1)栽培基质:苔藓、草炭土和蛭石,这3种材料加入量之间的比例按重量计为:苔藓:草炭土:蛭石=1_5:1-5:1-2 ;
(2)蓝莓扦插苗与DSE真菌按以下方法共生栽培:在具有遮阳网的露天大棚,或塑料薄膜温室,或玻璃温室中进行育苗载培,栽培工具为5 cm高128孔的营养穴盘,立体栽培;栽培蓝莓扦插苗的株距为3-lOcm ;在蓝莓扦插苗的基部平铺一层3/5穴孔容积的苔藓、草炭土和蛭石的混合基质,在蓝莓扦插苗基部施加上备好的DSE真菌固体培养物2-10g,最后用苔藓、草炭土和蛭石的混合基质把扦插苗固定好即可;将穴盘放置在玻璃温室中,环境温度为18~25°C,光照强度为2000Lx,光照时间为16h,环境湿度为60%_80%。
[0032]( 3 )蓝莓苗的收获:
蓝莓扦插苗在14天左右开始生根,6个月后生长为根系发达的蓝莓幼苗,即可为市场提供大面积栽培的蓝莓苗。
[0033]实施例5:
一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面`积栽培的方法,其特征在于其包括如下步骤: UDSE真菌的培养:
将DSE真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后,转接于PDA培养基的平皿中,于21°C恒温培养19天,用Φ 5mm的打孔器分别在菌落边缘打孔成菌饼,并接入DSE真菌固体培养基进行培养。DSE真菌固体培养基由固体基本培养基与液体MEA组成,固体基本培养基的组成按重量计为:麦麸:麦壳:阔叶树锯末=1.5:2:2 ;液体MEA量为以上麦麸、麦壳、阔叶树锯末总重量的20%,培养基pH为5.0,采用玻璃罐头瓶静置培养,培养容器装量30% ;DSE真菌固体培养基灭菌后接入DSE真菌,菌种接种量为培养容器装量的10% ;固体培养的培养条件为:21°C培养30天;待菌丝长满整个培养基质时培养结束,可直接使用。
[0034]2、蓝莓苗的培养:
(1)蓝莓芽分化:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加食用白砂糖20g、琼脂5g、玉米素1.0mg,培养基pH5 ;用玻璃罐头瓶静置暗培养,培养容器装量10%,光照培养的条件为温度15°C,光照强度为30001x,光照时间6h/天,培养时间120天;
(2)蓝莓丛芽增殖:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加食用白砂糖20g、琼脂5g、玉米素0.5mg,培养基pH5 ;用玻璃罐头瓶静置暗培养,培养容器装量10%,光照培养的条件为温度15°C,光照强度为30001x,光照时间6h/天,培养时间120天;
(3))蓝莓苗继代培养:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加食用白砂糖20g、琼脂5g、玉米素0.5mg,培养基pH5 ;用玻璃罐头瓶静置暗培养,培养容器装量10%,光照培养的条件为温度15°c,光照强度为30001x,光照时间6h/天,培养时间120天;
(4)蓝莓壮苗生根:按常规组培技术培养,所用的培养基是以1/2WPM培养基为基本培养基,在每升1/2WPM培养基中均添加食用白砂糖20g,用滤纸球或小棉花团铺满所用的培养容器的底部,添加的植物激素为IBA (吲哚丁酸)0.5mg,培养基pH5 ;用玻璃罐头瓶静置暗培养,培养容器装量10%,光照培养的条件为温度15°C,光照强度为30001x,光照时间8h/天,培养时间120天;
(5)蓝莓幼苗培养:
壮苗生根培养后的蓝莓组培苗经低温驯化后移栽到以苔藓和草炭土为栽培基质的营养钵里,生长20-40天,即为蓝莓幼苗;
3、DSE真菌与蓝莓幼苗的共生栽培:
(1)栽培基质为有机土和草炭土,这2种材料加入量之间的比例按重量计为:有机土:草炭土 =1-5:1-5 ;
(2)蓝莓幼苗与DSE真菌按以下方法共生栽培:
在具有遮阳网的露天大棚,或塑料薄膜温室,或玻璃温室中进行育苗载培,栽培蓝莓幼苗的株距为10-30cm,培养条件为25°C /18°C光照培养,光照强度为1000_30001x,光照时间8-16h,环境湿度为60-80%;用IOcmX 20cm(底直径X高)营养钵,将营养钵的底部放置3/5的有机土和草炭土混合基质后,加入DSE真菌固体培养物20-60g。
[0035]( 3 )蓝莓苗的收获:
蓝莓幼苗与DSE真菌共生60天后均形成菌根结构,蓝莓幼苗根系发达且生长旺盛,植株上有分枝长成,继续生长2个月后可转移至大田进行大面积栽培。
[0036]实施例6:
一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于其包括如下步骤: UDSE真菌的培养:
将DSE真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后,转接于PDA培养基的平皿中,于25°C恒温培养11天,用Φ5_的打孔器分别在菌落边缘打孔成菌饼,并接入DSE真菌固体培养基进行培养。DSE真菌固体培养基由固体基本培养基与液体MEA组成,固体基本培养基的组成按重量计为:麦麸:麦壳:阔叶树锯末=2: 3: 3 ;液体MEA量为以上麦麸、麦壳、阔叶树锯末总重量的40%,培养基pH为6.0,采用塑料袋容器静置培养,培养容器装量70% ;DSE真菌固体培养基灭菌后接入DSE真菌,菌种接种量为培养容器装量的120% ;固体培养的培养条件为:25°C培养26天;待菌丝长满整个培养基质时培养结束,用粉碎机粉碎后备用。
[0037]2、蓝莓苗的培养:
(1)蓝莓芽分化:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖40g、琼脂15g、玉米素3.0mg,培养基pH6 ;用塑料瓶器皿静置暗培养,培养容器装量30%,光照培养的条件为温度25°C,光照强度为ΙΟΟΟΙχ,光照时间16h/天,培养时间40天;
(2)蓝莓丛芽增殖:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖40g、琼脂15g、玉米素2.5mg,培养基pH6 ;用塑料瓶器皿静置暗培养,培养容器装量30%,光照培养的条件为温度25°C,光照强度为ΙΟΟΟΙχ,光照时间16h/天,培养时间40天;(3))蓝莓苗继代培养:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖40g、琼脂15g、玉米素2.5mg,培养基pH6 ;用塑料瓶器皿静置暗培养,培养容器装量30%,光照培养的条件为温度25°C,光照强度为1000lx,光照时间16h/天,培养时间40天;
(4)蓝莓壮苗生根:按常规组培技术培养,所用的培养基是以1/2WPM培养基为基本培养基,在每升1/2WPM培养基中均添加蔗糖40g,用滤纸球或小棉花团铺满所用的培养容器的底部,添加的植物激素为IBA (吲哚丁酸)2.5mg,培养基pH6 ;用塑料瓶器皿静置暗培养,培养容器装量30%,光照培养的条件为温度25°C,光照强度为ΙΟΟΟΙχ,光照时间16h/天,培养时间40天;
(5)蓝莓幼苗培养:
壮苗生根培养后的蓝莓组培苗经低温驯化后移栽到以苔藓和草炭土为栽培基质的营养钵里,生长20-40天,即为蓝莓幼苗;
(6)一年生蓝莓苗培养:上述蓝莓幼苗继续生长11-13月,即为一年生蓝莓苗。
[0038]3、DSE真菌与一年生蓝莓苗培养的共生栽培:
(1)栽培基质为有机土;
(2)—年生蓝莓苗与DSE真菌按以下方法共生栽培:在土壤有机质含量丰富且土壤pH适宜的大田中进行栽培,栽培时,先在大田中挖出定植穴,株距为20-60cm,再在定植穴内铺放栽培基质并施加上述DSE真菌固体培养物20-60g,最后把上述一年生蓝莓苗栽培于定植穴中。在蓝莓生长过程中每年可以补施DSE真菌固体培养物1-7次。
[0039](3)DSE真菌与一年生蓝莓苗共生栽培的结果:DSE真菌与一年生蓝莓苗共生60天后可明显看到蓝莓苗生长旺盛且分枝增多,抗旱能力明显增强,为蓝莓的大面积栽培提供了保障。
[0040]比较例一:DSE真菌对蓝莓扦插苗的育苗效应
栽培时以添加已灭菌液体培养基的蓝莓扦插苗的生长情况作为对照。剪取的蓝莓扦插苗用已灭菌液体培养基浸泡10-30min,再用苔藓把蓝莓扦插苗固定好。玻璃温室的培养条件为18-25°C光照培养,光照强度为20001x,光照时间16h/天,环境湿度为60%_80%。
[0041]蓝莓扦插苗在温室栽培I个月后收获部分蓝莓苗(包括对照和实施例1的蓝莓苗),连同栽培基质一起带回实验室统计分析地上部分的鲜重、苗高、根系总长和根表面积,将收获的蓝莓苗于60°C烘箱烘干至恒重,测量重量。
[0042]统计分析结果表明,与未接种的对照蓝莓扦插苗相比,与DSE真菌共生栽培的蓝莓扦插苗的地上部分高度增加了 29%-43%,鲜重增加了 50%-80%,干重增加了 14%_221%。
[0043]比较例二:DSE真菌对蓝莓幼苗的生长效应
栽培时以添加已灭菌液体培养基的蓝莓幼苗的生长情况作为对照。共生栽培基质处理方法,先将苔藓用蒸馏水浸泡7-10个小时,使其充分吸收水分,在浙干多余水分,和草炭土按1:1的比例混合。将营养钵底部放置3/5的基质,再在蓝莓幼苗的根部放置制备好的已灭菌液体培养基3 0mL,使蓝莓幼苗的根部与其充分接触,最后用苔藓和草炭土混合基质把蓝莓幼苗固定好。所有蓝莓幼苗均在玻璃温室中培养,培养条件为18-25°C光照培养,光照强度为20001x,光照时间16h/天,环境湿度为60%-80%。
[0044]蓝莓幼苗栽培2个月后收获部分蓝莓苗(包括对照和实施例2的蓝莓苗),连同基质一起带回实验室统计分析地上部分的鲜重、苗高、根系总长和根表面积,将收获的蓝莓苗于60°C烘箱烘干至恒重并测量重量。统计分析结果表明,与未接种的对照蓝莓幼苗相比,与DSE真菌共生栽培的蓝莓幼苗的地上部分高度增加了 40%-65%,鲜重增加了 60%-70%,干重增加了 50%-60%。
[0045]从上述比较例可以看出,DSE真菌显著促进蓝莓扦插苗的生根和蓝莓幼苗的生长,接菌栽培的蓝莓苗与对照蓝莓苗相比,接菌的蓝莓苗的生根率、鲜重和干重的含量较不接菌的均有很大提高。另一方面,本发明可显著缩短蓝莓的育苗周期,同时菌根化后的蓝莓苗的各种抗性较对照蓝莓苗有很大增强,尤其是抗旱能力,降低对栽培环境的要求,保证蓝莓的绿色优质高产,该发明适用于蓝莓从育苗到大田栽培的整个过程。
[0046]以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进,均应落入`本发明的权利要求书确定的保护范围内。
【权利要求】
1.一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于其包括如下步骤: 1)、DSE真菌的培养: 将DSE真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后,转接于PDA培养基的平皿中,于21-25°C恒温培养11-19天,分别在菌落边缘打孔成菌饼,并接入液体培养基进行培养或接入固体培养基进行培养; 所述的DSE真菌液体培养基的组成按重量百分计为:葡萄糖1.5-4.5%,麦芽浸膏1.5-4.5%,大豆蛋白胨0.3-0.7%,余量水,培养基pH值为50-6.0 ;震荡培养,培养容器装量10-40% ;液体培养基高压灭菌后接入DSE真菌;种子菌种接种量为培养容器装量的10-20% ;液体培养的培养条件为:摇床震荡转速为130-150r/min ;21_25°C培养26-30天;培养结束后可直接使用或用匀浆机打碎菌体后备用; 所述的DSE真菌固体培养基由固体基本培养基与液体MEA组成,固体基本培养基的组成按重量计为:麦麸:麦壳:阔叶树锯末=1-2:1-3:1-3 ;液体MEA量为以上麦麸、麦壳、阔叶树锯末总重量的20-40%,培养基pH为5.0-6.0,静置培养,培养容器装量30-70% ;固体培养基灭菌后接入DSE真菌,菌种接种量为培养容器装量的10-20% ;固体培养的培养条件为:21-25°C培养26-30天;待菌丝长满整个培养基质时培养结束,可直接使用或用粉碎机粉碎后备用; 2)、蓝莓苗的培养: (1)蓝莓芽分化:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖或食用白砂糖20-40g、琼脂5-15g,添加的植物激素为玉米素1.0-3.0mg,培养基pH5.0-6.0 ;静置暗培养,培养容器装量10_30%,光照培养的条件为温度15-25°C,光照强度为1000-30001x,光照时间8_16h/天,培养时间40-120天; (2)蓝莓丛芽增殖:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖或食用白砂糖20-40g、琼脂5-15g,添加的植物激素为玉米素0.5-2.5mg,培养基pH5.0-6.0 ;静置暗培养,培养容器装量10_30%,光照培养的条件为温度15-25°C,光照强度为1000-30001x,光照时间8_16h/天,培养时间40-120天; (3))蓝莓苗继代培养:按常规组培技术培养,所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基,在每升WPM培养基中均添加蔗糖或食用白砂糖20-40g、琼脂5-15g,添加的植物激素为玉米素0.5-2.5mg,培养基pH5.0-6.0 ;静置暗培养,培养容器装量10_30%,光照培养的条件为温度15_25°C,光照强度为1000-30001x,光照时间8_16h/天,培养时间40-120天; (4)蓝莓壮苗生根:按常规组培技术培养,所用的培养基是以1/2WPM培养基为基本培养基,在每升1/2WPM培养基中均添加蔗糖或食用白砂糖20-40g,用滤纸球或小棉花团铺满所用的培养容器的底部,添加的植物激素为吲哚丁酸0.5-2.5mg,培养基pH5.0-6.0 ;静置暗培养,培养容器装量10-30%,光照培养的条件为温度15-25°C,光照强度为1000-30001x,光照时间8-16h/天,培养时间40-120天; (5)蓝莓扦插苗培养或蓝莓幼苗培养或一年生蓝莓苗培养: 所述的蓝莓扦插苗培养:经继代培养的蓝莓组培苗经低温驯化后,剪取生长健壮5-6cm的茎段以苔藓为栽培基质扦插到营养穴盘里,扦插后生长30-50天,然后剪取5-6cm的生长健壮、长势均一的营养穴盘蓝莓苗的无根茎段作为蓝莓扦插苗;所述的蓝莓幼苗培养:壮苗生根培养后的蓝莓组培苗经低温驯化后移栽到以苔藓和草炭土为栽培基质的营养钵里,生长20-40天,即为蓝莓幼苗; 所述的一年生蓝莓苗培养:上述蓝莓幼苗继续生长11-13月,即为一年生蓝莓苗; 3)、DSE真菌与蓝莓的共生栽培: 蓝莓扦插苗或蓝莓幼苗或一年生蓝莓苗与DSE真菌按以下方法共生栽培: (1)蓝莓扦插苗与DSE真菌的共生栽培:在具有遮阳网的露天大棚,或塑料薄膜温室,或玻璃温室中进行育苗载培,栽培蓝莓扦插苗的株距为3-lOcm ;培养条件为18-25°C光照培养,光照强度为20001x,光照时间16h/天,环境湿度为60%-80% ;在上述蓝莓扦插苗的基部放置3/5穴孔容积的栽培基质后,采用上述DSE真菌培养物与蓝莓扦插苗共生栽培,最后用栽培基质把扦插苗固定好,蓝莓扦插苗在14天左右开始生根,6个月后生长为根系发达的蓝莓幼苗; (2)蓝莓幼苗与DSE真菌的共生栽培:在具有遮阳网的露天大棚,或塑料薄膜温室,或玻璃温室中进行育苗载培,栽培蓝莓幼苗的株距为10-30cm,培养条件为间歇光照培养,光照强度为1000-30001χ,光照时间8-16h,环境湿度为60-80% ;放置栽培基质后,在上述蓝莓幼苗根部施加备 好的DSE真菌液体或固体培养物,DSE真菌液体培养物的添加量为30-100mL,或DSE真菌固体培养物的添加量为20-60g ;蓝莓幼苗与DSE真菌共生60天后均形成菌根结构,继续生长2个月后可转移至大田进行大面积栽培; (3)一年生蓝莓苗与DSE真菌蓝莓的大田栽培:先在大田中挖出定植穴,株距为20-60cm,再在定植穴内铺放栽培基质并施加的DSE真菌液体培养物30_100mL,或DSE真菌固体培养物20-60g,最后把上述一年生蓝莓苗栽培于定植穴中; 在蓝莓生长过程中每年可以补施DSE真菌液体或固体培养物1-7次。
2.根据权利要求1所述的一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培中的栽培基质为苔藓。
3.根据权利要求1所述的一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培中的栽培基质为苔藓和草炭土,这2种材料加入量之间的比例按重量计为:苔藓:草炭土 =1-5:1-5。
4.根据权利要求1所述的一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培中的栽培基质为苔藓、草炭土和蛭石,这3种材料加入量之间的比例按重量计为:苔藓:草炭土:蛭石=1-5:1-5:1-2。
5.根据权利要求1所述的一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培中的栽培基质为有机土和草炭土,这2种材料加入量之间的比例按重量计为:有机土:草炭土 =1-5:1-5。
6.根据权利要求1所述的一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培中的栽培基质为沙土和草炭土,这2种材料加入量之间的比例按重量计为:沙土:草炭土 =1-3:1-5。
7.根据权利要求1所述的一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培中的栽培基质为有机土。
8.根据权利要求1所述的一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培步骤(1)蓝莓扦插苗与DSE真菌的共生栽培中在蓝莓扦插苗的基部放置3/5穴孔容积的栽培基质后,在蓝莓扦插苗基部施加上备好的DSE真菌液体培养物2-10mL或DSE真菌固体培养物2_10g,最后用栽培基质把扦插苗固定好。
9.根据权利要求1所述的一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于所述的3)中DSE真菌与蓝莓的共生栽培步骤(1)蓝莓扦插苗与DSE真菌的共生栽培中在蓝莓扦插苗的基部放置3/5穴孔容积的3/5栽培基质后,先用DSE真菌液体培养物浸泡扦插苗,真菌液体培养物的添加标准为完全浸没扦插苗,浸泡的时间为10-30min,再用栽培基质把蓝莓扦插苗固定好即可。
10.根据权利要求1所述的一种应用DSE真菌进行蓝莓育苗及大面积栽培的方法,其特征在于所述的DSE真菌于2013年10月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏,保藏编号为:CGMCC N0.8260。
【文档编号】A01G31/00GK103828722SQ201410110187
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】程显好, 刘凤红, 刘静, 李维焕, 赵建萍 申请人:鲁东大学
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