用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂及其制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种能够提高青贮料的发酵品质和营养价值的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂及其制作方法。所述添加剂由第一菌种、第二菌种与第三菌种混合而成，其中第一菌种为植物乳杆菌LP，第二菌种为融合魏斯氏菌WF和乳球菌LG中的其中任意一种，所述第三菌种为魏斯氏菌WB和乳酸明串珠菌LE中的其中任意一种，所述第一菌种、第二菌种、第三菌种的容积比例为(1～2)：(1～2):(1～2)。在多花黑麦草进行青贮时，将乳酸菌添加剂添加到黑麦草青贮料中，可以大大提高青贮料的发酵品质和营养价值，所述的乳酸菌添加剂制作方法是通过从多花黑麦草本身附着的乳酸菌中分离出乳酸菌菌株，更加适宜多花黑麦草的贮存。适合在青贮领域推广运用。
【专利说明】用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂及其制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于青贮领域，具体涉及一种用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂及其制作方法。
【背景技术】
[0002]青贮是通过乳酸菌的增殖，将原料中的发酵底物转化成乳酸等酸性物质，创造酸性环境，抑制有害微生物增殖，从而保存原料营养成分的过程。优质青贮饲料不仅保持了青绿饲料的鲜绿和大部分营养，而且增加了粗蛋白的含量；同时又具有芳香的酸味，柔软多汁，适口性好等特点。在青忙饲料中含有多种乳酸菌，包括乳杆菌(Iactobacillus)、肠球菌(Enterococcus)、明串珠菌(Leuconstoc)、乳球菌(Lactococcus)和片球菌(Pediococcus)等，为提高青贮品质，分离饲料中优质乳酸菌显得尤为重要。欧盟国家和美国的研究者对乳酸菌在青贮饲料中的应用进行了大量深入的研究，研究内容包括优良乳酸菌的筛选、其对青贮饲料发酵品质和二次发酵抑制作用的影响、以及青贮饲料添加乳酸菌在奶牛饲养中的应用等。例如，有学者指出附着在新鲜牧草上的微生物，特别是乳酸菌，对青贮料的发酵过程和品质起重要作用。乳酸菌和其它种类的微生物在青贮发酵过程中共同生长，且影响到青贮料的发酵特性。在发酵过程中，牧草中的乳酸菌将糖转变为乳酸，最终pH值降低，而牧草得以保存。
[0003]目前市面上的乳酸菌添加剂多是针对玉米的菌剂，用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂还未见报道。南方地区常年阴雨天气较多，干草调制受天气条件影响不易成功，而青贮不受天气条件影响，是保存牧草的有效方法，作为我国南方地区广泛种植的牧草多花黑麦草来说，开发针对其 青贮料的乳酸菌添加剂有重要的应用价值。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提高青贮料的发酵品质和营养价值的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案为:该用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂，所述添加剂由第一菌种、第二菌种与第三菌种混合而成，其中第一菌种为植物乳杆菌LP，第二菌种为融合魏斯氏菌WF和乳球菌LG中的其中任意一种，所述第三菌种为魏斯氏菌WB和乳酸明串珠菌LE中的其中任意一种，所述第一菌种、第二菌种、第三菌种的容积比例为(I~2):(1~2): (I~2)。
[0006]进一步的是，所述第二菌种为融合魏斯氏菌WF，第三菌种为魏斯氏菌WB。
[0007]进一步的是，所述植物乳杆菌LP、融合魏斯氏菌WF与魏斯氏菌WB的容积比例为1:2:2。
[0008]本发明还提供了一种制备上述用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂的制作方法，该制作方法包括以下步骤:
[0009]A、制备乳酸菌培养基，将培养基各组分加入容器中，然后进行加热搅拌，待所有组分都充分溶解后，装入培养皿中并将其密封，然后将其放置于高压灭菌炉中进行灭菌处理，灭菌处理结束后，取出培养皿，将其放置于无菌操作台上，开启紫外灯对其照射一段时间，照射结束后吹风使培养基凝固；
[0010] B、制备多花黑麦草的绿汁发酵液，将多花黑麦草原料剪切成2~3cm长的碎段，将切碎后的原料加入高速组织匀浆机中，再加入无菌蒸馏水进行搅碎，将搅碎的汁液用纱布过滤，用量筒称量滤液容积，加入相应重量的葡萄糖以使滤液中葡萄糖浓度达到20g/L，充分混匀后倒入容量瓶中，滤液要装满容量瓶且不留空气，将容量瓶盖子盖好并用胶布缠绕密封；
[0011]C、从绿汁发酵液中分离、纯化乳酸菌，将步骤B制得的绿汁发酵液置于30°C恒温培养箱中厌氧发酵48h，从绿汁发酵液放置在30°C恒温培养箱中厌氧发酵开始，每隔4h在无菌操作台上打开一瓶绿汁发酵液，用接种针蘸少许中层发酵液后在培养基上进行划线，每瓶绿汁发酵液用三个培养基进行划线，直至第48h全部绿汁发酵液均进行过划线操作为止，将划过线的培养基放置在30°C的恒温培养箱中培养，每隔两天在无菌操作台上用接种针挑取培养基上的单个菌落得到纯的乳酸菌菌株；
[0012]D、对挑取的单个菌落进行革兰氏染色并镜检，观察各个菌株在显微镜下的形态特征从而确定菌株的阴性和阳性；
[0013]E、对纯的乳酸菌菌株进行生化鉴定，在无菌操作台上用接种针挑取单菌落置于含不同糖类的生化鉴定管中，将生化鉴定管用蜡密封后置于35°C恒温培养箱中培养24h，之后根据生化鉴定管中的显色反应并结合步骤D得出的结论对得到的菌株进行初步分类；
[0014]F、对乳酸菌菌株进行分子鉴定，具体步骤如下:首先，提取乳酸菌菌株的基因组DNA,其次，对提取的基因组DNA进行PCR反应，得到琼脂糖凝胶，接着，从琼脂糖凝胶中回收DNA片段，得到PCR产物，最后，对得到的PCR产物进行测序，根据步骤E得出的结论，将测得的序列与Genbank中的已知序列进行比对,寻找同源性最高的菌种,从而确定菌株的类别；
[0015]G、混合菌剂的制备，根据步骤F得到的鉴定结果，将需要选用的植物乳杆菌LP、融合魏斯氏菌WF、乳球菌LG、魏斯氏菌WB、乳酸明串珠菌LE的菌株分离出来接种于MRS液体培养基中，然后在30°C的恒温培养箱中培养24h，然后将各菌液稀释至IX 106cfu/mL，将植物乳杆菌LP作为第一菌种，融合魏斯氏菌WF和乳球菌LG中的其中任意一种作为第二菌种，魏斯氏菌WB和乳酸明串珠菌LE中的其中任意一种作为第三菌种，按照第一菌种、第二菌种、第三菌种的容积比例为(I~2): (I~2): (I~2)混合制成乳酸菌添加剂。
[0016]进一步的是，在步骤A中，所述培养基成分为冰100000份，蛋白胨1000份，牛肉膏1000份，酵母膏500份，葡萄糖2000份，吐温80100份，K2HP04200份，乙酸钠500份，柠檬酸铵 200 份，MgSO4.7H2058 份，MnSO4.4H2025 份，琼脂 2000 份。
[0017]进一步的是，在步骤D中，所述革兰氏染色的具体步骤如下:将载玻片消毒灭菌后置于无菌操作台上晾干，用移液管向载玻片中央滴一小滴无菌蒸馏水，用接种针挑取一部分乳酸菌单菌落置于载玻片上的无菌水中并搅拌混匀，手持载玻片一端，载有乳酸菌的液滴朝上，将载玻片中央在酒精灯火焰最外层处来回通过数次，使水分蒸发，载玻片冷却后染色，向载玻片上样品位置滴加草酸铵结晶紫染色液I~2滴，染色Imin后倾斜载玻片，用自来水沿一端缓慢冲洗，直至冲下的水为无色为止，接着向载玻片样品位置滴加碘液I~2滴，染色Imin后用自来水冲洗，至冲下的水为无色为止，再向载玻片样品位置滴加复红乙醇溶液，染色Imin后用自来水冲洗至冲下的水为无色，用吸水纸吸干载玻片样品四周水分，待样品晾干后置于显微镜下观察，先用低倍镜观察，视野中找到乳酸菌，向载玻片样品位置滴加I滴香柏油，换用油镜观察乳酸菌的染色情况及形态。
[0018]进一步的是，在步骤F中，采用如下方法提取乳酸菌菌株的基因组DNA:首先，取过夜培养乳酸菌细胞加入离心管中，在lOOOOrpm室温下离心lmin，收集菌体，并吸去上清液，然后加入180ul溶菌酶溶液，重悬菌液，在37°C的水中进行水浴30~60min，接着加入20ul蛋白酶K溶液，在56°C的水中进行水浴30min至细胞完全裂解，再加入200ul溶液BD，在70°C的水中水浴lOmin，再加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，在12000rmp室温下离心3min，倒掉滤液，然后向吸附柱中加入500ul溶液PW,在1000Ormp室温下离心lmin,倒掉滤液,再向吸附柱中加入500ul漂洗液Wash buffer,在1000Ormp室温下离心lmin,倒掉滤液,将吸附柱重新放入收集管中，在12000rmp室温下离心2分钟，除去残留的漂洗液Wash buffer,取出吸附柱,放入另外一个离心管中，加入50ul预热的洗脱液Elution buffer,静置3min,在1000Ormp室温离心lmin，收集DNA溶液，即得到提取的基因组DNA。
[0019]进一步的是，在步骤F中，从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的具体步骤如下:首先，割取含需回收DNA的琼脂块，放入离心管中，称量凝胶的重量，以Img = Iul换算凝胶的体积，按照凝胶浓度，加入相应比例的Binding Buffer II,置于50~60°C水浴中IOmin,使胶彻底融化， 将融化的胶溶液转移到吸附柱中，室温放置2min，在12000rpm室温下离心lmin，取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中，加入500ul WashSolution,在12000rpm室温下离心lmin,取下吸附柱,倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中，在12000rpm室温下离心2min，将吸附柱放入另一根离心管中，在柱子膜中央加40ulElution Buffer放置5min,在12000rpm室温离心lmin,离心管中的液体即为回收的DNA片段。
[0020]进一步的是，在步骤G中，根据步骤F得到的鉴定结果，需要选用的菌株为植物乳杆菌LP、融合魏斯氏菌WF和魏斯氏菌WB。
[0021]进一步的是，在步骤G中，将选取的植物乳杆菌LP、融合魏斯氏菌WF和魏斯氏菌WB稀释至I X 106cfu/mL,然后按照植物乳杆菌LP、融合魏斯氏菌WF与魏斯氏菌WB的容积比例为1:2:2混合制成乳酸菌添加剂。
[0022]本发明的有益效果在于:本发明所述的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂由第一菌种、第二菌种与第三菌种混合而成，其中第一菌种为植物乳杆菌LP，第二菌种为融合魏斯氏菌WF和乳球菌LG中的其中任意一种，所述第三菌种为魏斯氏菌WB和乳酸明串珠菌LE中的其中任意一种，所述第一菌种、第二菌种、第三菌种的容积比例为(I~2):(1~
2): (I~2)，在多花黑麦草进行青贮时，将乳酸菌添加剂添加到黑麦草青贮料中，可以大大提高青贮料的发酵品质和营养价值，本发明所述的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂制作方法是通过从多花黑麦草本身附着的乳酸菌中分离出产酸能力强、生长旺盛且能提高多花黑麦草青贮料的发酵品质和营养价值的乳酸菌菌株，更加适宜多花黑麦草的贮存，能够有效提高青贮料的发酵品质和营养价值，在冬春季为家畜提供优质青绿饲料，解决饲草季节性供应不均的问题。【具体实施方式】
[0023]本发明所述的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂由第一菌种、第二菌种与第三菌种混合而成，其中第一菌种为植物乳杆菌LP，第二菌种为融合魏斯氏菌WF和乳球菌LG中的其中任意一种，所述第三菌种为魏斯氏菌WB和乳酸明串珠菌LE中的其中任意一种，所述第一菌种、第二菌种、第三菌种的容积比例为(I~2):(1~2): (I~2)，在多花黑麦草进行青贮时，将乳酸菌添加剂添加到黑麦草青贮料中，可以大大提高青贮料的发酵品质和营养价值，在冬春季为家畜提供优质青绿饲料，解决饲草季节性供应不均的问题。其中植物乳杆菌 LP 为 Lactobacillus pi ant arum 的缩写，乳球菌 LG 为 Lactococcus garvieae 的缩写，融合魏斯氏菌WF为Weissella confuse的缩写，魏斯氏菌WB为Weissella cibaria的缩写，乳酸明串珠菌LE为Leuconostoc Iactis的缩写。
[0024]将植物乳杆菌LP、融合魏斯氏菌WF、乳球菌LG、魏斯氏菌WB、乳酸明串珠菌LE分别稀释至I X106Cfu/mL，然后按照下表所述的组分和比例混合后添加到黑麦草青贮料中，添加水平为2mL/kg FM，其中FM表示鲜重，黑麦草青贮前的营养成分含量为对照1，添加相同量无菌水的黑麦草青贮料作为对照2，其青贮45天后，对青贮料的发酵品质和营养成分进行测定，其结果如下表所示:
【权利要求】
1.用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂，其特征在于:所述添加剂由第一菌种、第二菌种与第三菌种混合而成，其中第一菌种为植物乳杆菌LP，第二菌种为融合魏斯氏菌WF和乳球菌LG中的其中任意一种，所述第三菌种为魏斯氏菌WB和乳酸明串珠菌LE中的其中任意一种，所述第一菌种、第二菌种、第三菌种的容积比例为(I~2): (I~2): (I~2)。
2.如权利要求1所述的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂，其特征在于:所述第二菌种为融合魏斯氏菌WF，第三菌种为魏斯氏菌WB。
3.如权利要求2所述的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂，其特征在于:所述植物乳杆菌LP、融合魏斯氏菌WF与魏斯氏菌WB的容积比例为1:2:2。
4.用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂制作方法，其特征在于包括以下步骤: A、制备乳酸菌培养基，将培养基各组分加入容器中，然后进行加热搅拌，待所有组分都充分溶解后，装入培养皿中并将其密封，然后将其放置于高压灭菌炉中进行灭菌处理，灭菌处理结束后，取出培养皿，将其放置于无菌操作台上，开启紫外灯对其照射一段时间，照射结束后吹风使培养基凝固； B、制备多花黑麦草的绿汁发酵液，将多花黑麦草原料剪切成2~3cm长的碎段，将切碎后的原料加入高速组织匀浆机中，再加入无菌蒸馏水进行搅碎，将搅碎的汁液用纱布过滤，用量筒称量滤液容积，加入相应重量的葡萄糖以使滤液中葡萄糖浓度达到20g/L，充分混匀后倒入容量瓶中，滤液要装满容量瓶且不留空气，将容量瓶盖子盖好并用胶布缠绕密封； C、从绿汁发酵液中分离、纯化乳酸菌，将步骤B制得的绿汁发酵液置于30°C恒温培养箱中厌氧发酵48h，从 绿汁发酵液放置在30°C恒温培养箱中厌氧发酵开始，每隔4h在无菌操作台上打开一瓶绿汁发酵液，用接种针蘸少许中层发酵液后在培养基上进行划线，每瓶绿汁发酵液用三个培养基进行划线，直至第48h全部绿汁发酵液均进行过划线操作为止，将划过线的培养基放置在30°C的恒温培养箱中培养，每隔两天在无菌操作台上用接种针挑取培养基上的单个菌落得到纯的乳酸菌菌株； D、对挑取的单个菌落进行革兰氏染色并镜检，观察各个菌株在显微镜下的形态特征从而确定菌株的阴性和阳性； E、对纯的乳酸菌菌株进行生化鉴定，在无菌操作台上用接种针挑取单菌落置于含不同糖类的生化鉴定管中，将生化鉴定管用蜡密封后置于35°C恒温培养箱中培养24h，之后根据生化鉴定管中的显色反应并结合步骤D得出的结论对得到的菌株进行初步分类； F、对乳酸菌菌株进行分子鉴定，具体步骤如下:首先，提取乳酸菌菌株的基因组DNA，其次，对提取的基因组DNA进行PCR反应，得到琼脂糖凝胶，接着，从琼脂糖凝胶中回收DNA片段，得到PCR产物，最后，对得到的PCR产物进行测序，根据步骤E得出的结论，将测得的序列与Genbank中的已知序列进行比对,寻找同源性最高的菌种,从而确定菌株的类别； G、混合菌剂的制备，根据步骤F得到的鉴定结果，将需要选用的植物乳杆菌LP、融合魏斯氏菌WF、乳球菌LG、魏斯氏菌WB、乳酸明串珠菌LE的菌株分离出来接种于MRS液体培养基中，然后在30°C的恒温培养箱中培养24h，然后将各菌液稀释至IX 106cfu/mL，将植物乳杆菌LP作为第一菌种，融合魏斯氏菌WF和乳球菌LG中的其中任意一种作为第二菌种，魏斯氏菌WB和乳酸明串珠菌LE中的其中任意一种作为第三菌种，按照第一菌种、第二菌种、第三菌种的容积比例为(I~2): (I~2): (I~2)混合制成乳酸菌添加剂。
5.如权利要求4所述的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂制作方法，其特征在于:在步骤A中， 所述培养基成分为:水100000份，蛋白胨1000份，牛肉膏1000份，酵母膏500份，葡萄糖2000份，吐温80100份，K2HP04200份，乙酸钠500份，柠檬酸铵200份，MgSO4.7H2058 份，MnSO4.4H2025 份，琼脂 2000 份。
6.如权利要求5所述的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂制作方法，其特征在于:在步骤D中，所述革兰氏染色的具体步骤如下:将载玻片消毒灭菌后置于无菌操作台上晾干，用移液管向载玻片中央滴一小滴无菌蒸馏水，用接种针挑取一部分乳酸菌单菌落置于载玻片上的无菌水中并搅拌混匀，手持载玻片一端，载有乳酸菌的液滴朝上，将载玻片中央在酒精灯火焰最外层处来回通过数次，使水分蒸发，载玻片冷却后染色，向载玻片上样品位置滴加草酸铵结晶紫染色液I~2滴，染色Imin后倾斜载玻片，用自来水沿一端缓慢冲洗，直至冲下的水为无色为止，接着向载玻片样品位置滴加碘液I~2滴，染色Imin后用自来水冲洗，至冲下的水为无色为止，再向载玻片样品位置滴加复红乙醇溶液，染色Imin后用自来水冲洗至冲下的水为无色，用吸水纸吸干载玻片样品四周水分，待样品晾干后置于显微镜下观察，先用低倍镜观察，视野中找到乳酸菌，向载玻片样品位置滴加I滴香柏油，换用油镜观察乳酸菌的染色情况及形态。
7.如权利要求6所述的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂制作方法，其特征在于:在步骤F中，采用如下方法提取乳酸菌菌株的基因组DNA:首先，取过夜培养乳酸菌细胞加入离心管中，在1000Orpm室温下离心lmin，收集菌体，并吸去上清液，然后加入180ul溶菌酶溶液，重悬菌液，在37°C的水中进行水浴30~60min，接着加入20ul蛋白酶K溶液，在56°C的水中进行水浴30min至细胞完全裂解，再加入200ul溶液BD，在70°C的水中水浴lOmin，再加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min,在12000rmp室温下离心3min,倒掉滤液,然后向吸附柱中加入500ul溶液PW,在1000Ormp室温下离心lmin,倒掉滤液,再向吸附柱中加入500ul漂洗液Washbuffer,在1000Ormp室温下离心lmin,倒掉滤液,将吸附柱重新放入收集管中，在12000rmp室温下离心2分钟，除去残留的漂洗液Wash buffer,取出吸附柱,放入另外一个离心管中，加入50ul预热的洗脱液Elution buffer,静置3min,在1000Ormp室温离心lmin,收集DNA溶液，即得到提取的基因组DNA。
8.如权利要求7所述的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂制作方法，其特征在于:在步骤F中，从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的具体步骤如下:首先，割取含需回收DNA的琼脂块，放入离心管中，称量凝胶的重量，以Img = Iul换算凝胶的体积，按照凝胶浓度，加入相应比例的Binding Buffer II，置于50~60°C水浴中lOmin，使胶彻底融化，将融化的胶溶液转移到吸附柱中，室温放置2min,在12000rpm室温下离心lmin,取下吸附柱,倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中，加入500ul Wash Solution,在12000rpm室温下离心lmin，取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中，在12000rpm室温下离心2min,将吸附柱放入另一根离心管中，在柱子膜中央加40ul ElutionBuffer放置5min,在12000rpm室温离心lmin,离心管中的液体即为回收的DNA片段。
9.如权利要求4所述的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂制作方法，其特征在于:在步骤G中，根据步骤F得到的鉴定结果，需要选用的菌株为植物乳杆菌LP、融合魏斯氏菌WF和魏斯氏菌WB。
10.如权利要求9所述的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂制作方法，其特征在于:在步骤G中，将选取的植物乳杆菌LP、融合魏斯氏菌WF和魏斯氏菌WB稀释至1X 106cfu/mL,然后按照植物乳杆菌LP、融合魏斯氏菌WF与魏斯氏菌WB的容积比例为1:2:2混合制成乳酸菌添加剂。
【文档编号】A23K1/16GK103966144SQ201410214854
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月20日 优先权日:2014年5月20日
【发明者】杨春华, 刘刚, 贾露洁, 李达旭, 刘琳, 郭丽娟 申请人:四川农业大学