一种白英的快速繁殖方法

文档序号:253892阅读:326来源:国知局
一种白英的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明涉及一种白英的快速繁殖方法,包括以下步骤:(1)配置培养基:a、种子萌发培养基、b、子叶诱导愈伤组织培养基、c、下胚轴诱导愈伤组织培养基、d、丛生芽培养基、e、生根培养基;上述各培养基在灭菌前调pH值均为5.8,加入10g/L琼脂,且在1.1kg/cm2,121℃饱和蒸气下灭菌20min;(2)种子预处理(3)子叶愈伤组织培养(4)下胚轴诱导愈伤组织培养(5)丛生芽培养(6)生根培养。本发明白英的快速繁殖方法,在暗培养条件下,诱导出的愈伤组织生长分化生根的情况明显好于光照条件。本发明用组培种子苗诱导分化丛生芽进行生根培养,可获得大量优质白英幼苗。为其组培苗的大规模生产提供技术参数。
【专利说明】一种白英的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物的培养方法,具体是涉及一种白英的快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002]白英(Solanum lyratum Thunb)为爺科爺属多年生蔓性草本,生于山谷草地或路旁、田边,主要分布于浙江、安徽、湖北、福建等黄河以南各省。白英以全草及根入药,中药名分别为:白英(白毛藤)、白毛藤根,具有解毒消肿、祛风、化痕等功效,近年来在多种癌症的治疗中有显著疗效。对白英的研究大多集中在药理应用方面,对白英的组培研究国内外鲜有报道,其组织培养无法实现大规模生产,造成了白英植物的供不应求。
[0003]基于此,提出本发明。

【发明内容】

[0004]针对现有技术的上述技术问题,本发明的目的是提供一种白英的快速繁殖方法,本发明探索白英的组织培养技术,为其组培苗的大规模生产提供技术参数。
[0005]为达到上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:
[0006]一种白英的快速繁殖方法,包括以下步骤:
[0007](I)配置培养基:
[0008]a、种子萌发培养基 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7 或 S8 ;
[0009]b、子叶诱导愈伤组织培养基 Cl、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、Rl、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、RIO、Rll、R12、R13、R14、R15、R16、R17 或 R18 ;
[0010]C、下胚轴诱导愈伤组织培养基 PU P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、Rl、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、RIO、Rll、R12、R13、R14、R15、R16、R17 或 R18 ;
[0011]d、丛生芽培养基 RU R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、RIO、Rll、R12、R13、R14、R15、R16、R17 或 R18 ;
[0012]e、生根培养基P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9 或PlO ;所述的 SI 为 MS,S2 为 5/6MS,
S3为 2/3MS, S4 为 1/3MS, S5 为 MS+30g/L 蔗糖,S6 为 5/6MS+30g/L 蔗糖,S7 为 2/3MS+30g/L 蔗糖,S8 为 l/3MS+30g/L 蔗糖;
[0013]所述的Pl 为 MS+NAA0.2+6-BA0.2+30g/L 蔗糖,P2 为 MS+NAA0.2+6-BA0.5+30g/L 蔗糖,P3 为 MS+NAA0.2+6-BA0.8+30g/L 蔗糖,P4 为 MS+NAA0.2+6-BA1.0+30g/L 蔗糖,P5 为 MS+IBA2.0+6-BA0.5+30g/L 蔗糖,P6 为 MS+IBA0.05+6-BA1.0+30g/L 蔗糖,P7 为 MS+IBA1.0+6-BA2.0+30g/L 蔗糖,P8 为 MS+NAA1.5+6-BA2.0+30g/L 蔗糖,P9 为MS+NAA0.2+6-BA2.0+30g/L 蔗糖,PlO 为 MS+NAA1.0+6-BA2.0+30g/L 蔗糖;
[0014]所述的Cl 为 MS+IBA2.0+6-BA0.5+30g/L 蔗糖,C2 为 MS+NAA0.2+6-BA0.2+30g/L蔗糖,C3 为 MS+IBA0.1+6-BA2.5+30g/L 蔗糖,C4 为 MS+IBA0.5+6-BA1.5+30g/L 蔗糖,C5 为MS+2.4-D0.5+30g/L 蔗糖,C6 为 MS+NAA1.0+6-BA1.0+30g/L 蔗糖,C7 为 MS+6-BA5.0+30g/L蔗糖,C8 为 MS+6-BA0.2+30g/L 蔗糖,C9 为 MS+NAA+6_BA+30g/L 蔗糖;[0015]所述的Rl 为 MS+6-BA0.5+30g/L 蔗糖,R2 为 MS+6-BA1.0+30g/L 蔗糖,R3 为MS+6-BA1.5+30g/L蔗糖,R4 为 MS+6-BA2.0+30g/L蔗糖,R5 为 MS+6-BA2.5+30g/L蔗糖,R6 为MS+6-BA3.0+30g/L 蔗糖,R7 为 MS+6-BA3.5+30g/L 蔗糖,R8 为 MS+6-BA4.0+30g/L 蔗糖,R9 为MS+6-BA4.5+30g/L 蔗糖,RlO 为 MS+6-BA5.0+30g/L 蔗糖,Rll 为 MS+6-BA5.0+IBA1.0+30g/L 蔗糖,R12 为 MS+6-BA0.5+IBA0.2+30g/L 蔗糖,R13 为 MS+6-BA0.8+IBA0.2+30g/L 蔗糖,R14 为 MS+6-BA1.0+ΙΒΑ0.2+30g/L 蔗糖,R15 为 MS+6-BA1.2+IBA0.2+30g/L 蔗糖,R16 为 MS+6-BA1.0+ΙΒΑ0.5+30g/L 蔗糖,R17 为 MS+6-BA1.5+IBA0.5+30g/L 蔗糖,R18 为MS+6-BA2.0+ΙΒΑ0.2+30g/L 蔗糖;
[0016]上述各培养基在灭菌前调pH值均为5.8,加入10g/L琼脂,且在1.1kg/cm2,121°C饱和蒸气下灭菌20min ;
[0017](2)种子预处理:取新鲜果实,在果实无损情况下,去蒂,用蒸馏水漂洗几次,洗去浮土,然后转到超净工作台上,75%酒精浸没10秒,再用无菌水漂洗2~3次,在无菌水中剖开果实,取出种子无菌水反复漂洗2~3次,至洗去果肉,无菌滤纸上吸干水,接种于步骤(I)的种子萌发培养基中,每个配方接种五个重复,每个重复接种40粒种子;置于温度22 ± 2摄氏度的培养箱中,进行暗培养,接种后第7天和第14天分别统计种子萌发和生长情况;
[0018](3)子叶愈伤组织培养:超净工作台上取出白英组培种子苗,把子叶切成
0.3*0.3cm的见方小片接种于子叶诱导愈伤组织培养基中,在温度22±2摄氏度的培养箱中,进行暗培养,在接种后第30天统计子叶愈伤组织生长情况;
[0019](4)下胚轴诱导愈伤组织培养:超净工作台上取出白英组培种子苗,把下胚轴切成Icm长的小段接种于下胚轴诱导愈伤组织培养基中,在温度22 ± 2摄氏度的培养箱中,进行暗培养,在接种后第30天统计下胚轴愈伤组织生长情况;
[0020](5)丛生芽培养:将组织接种到丛生芽培养基中,到接种后第30天时,愈伤组织已经分化出丛生芽,对丛生芽情况进行统计;
[0021](6)生根培养:把芽从基部切下,接种到生根培养基中,到接种后第30天时,对生根情况进行统计。
[0022]所述白英的快速繁殖方法,所述步骤(1)中配置的培养基优选如下:
[0023]a、种子萌发培养基S5;
[0024]b、子叶诱导愈伤组织培养基C2、R3或Rll ;
[0025]C、下胚轴诱导愈伤组织培养基P1、P10、R5或Rll ;
[0026]d、丛生芽培养基R3或R5 ;
[0027]e、生根培养基Pl。
[0028]本发明的有益效果如下:
[0029]本发明白英的快速繁殖方法,在暗培养条件下,诱导出的愈伤组织生长分化生根的情况明显好于光照条件。本发明用组培种子苗诱导分化丛生芽进行生根培养,可获得大量优质白英幼苗。为其组培苗的大规模生产提供技术参数。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但本发明的保护范围并不限于此。
[0031]本发明中的培养基Pl为MS+NAA0.2+6-BA0.2+30g/L蔗糖,P2为MS+NAA0.2+6-BA0.5+30g/L 蔗糖,P3 为 MS+NAA0.2+6-BA0.8+30g/L 蔗糖,P4 为MS+NAA0.2+6-BA1.0+30g/L 蔗糖,P5 为 MS+IBA2.0+6-BA0.5+30g/L 蔗糖,P6 为MS+IBA0.05+6-BA1.0+30g/L 蔗糖,P7 为 MS+IBA1.0+6-BA2.0+30g/L 蔗糖,P8 为MS+NAA1.5+6-BA2.0+30g/L 蔗糖,P9 为 MS+NAA0.2+6-BA2.0+30g/L 蔗糖,PlO 为MS+NAA1.0+6-BA2.0+30g/L 蔗糖;
[0032]Cl 为 MS+IBA2.0+6-BA0.5+30g/L 蔗糖,C2 为 MS+NAA0.2+6-BA0.2+30g/L 蔗糖,C3 为 MS+IBA0.1+6-BA2.5+30g/L 蔗糖,C4 为 MS+IBA0.5+6-BA1.5+30g/L 蔗糖,C5 为MS+2.4-D0.5+30g/L 蔗糖,C6 为 MS+NAA1.0+6-BA1.0+30g/L 蔗糖,C7 为 MS+6-BA5.0+30g/L蔗糖,C8 为 MS+6-BA0.2+30g/L 蔗糖,C9 为 MS+NAA+6_BA+30g/L 蔗糖;
[0033]Rl 为 MS+6-BA0.5+30g/L 蔗糖,R2 为 MS+6-BA1.0+30g/L 蔗糖,R3 为MS+6-BA1.5+30g/L蔗糖,R4 为 MS+6-BA2.0+30g/L蔗糖,R5 为 MS+6-BA2.5+30g/L蔗糖,R6 为MS+6-BA3.0+30g/L 蔗糖,R7 为 MS+6-BA3.5+30g/L 蔗糖,R8 为 MS+6-BA4.0+30g/L 蔗糖,R9 为MS+6-BA4.5+30g/L 蔗糖,RlO 为 MS+6-BA5.0+30g/L 蔗糖,Rll 为 MS+6-BA5.0+IBA1.0+30g/L 蔗糖,R12 为 MS+6-BA0.5+IBA0.2+30g/L 蔗糖,R13 为 MS+6-BA0.8+IBA0.2+30g/L 蔗糖,R14 为 MS+6-BA1.0+ΙΒΑ0.2+30g/L 蔗糖,R15 为 MS+6-BA1.2+IBA0.2+30g/L 蔗糖,R16 为 MS+6-BA1.0+ ΙΒΑ0.5+30g/L 蔗糖,R17 为 MS+6-BA1.5+IBA0.5+30g/L 蔗糖,R18 为MS+6-BA2.0+ΙΒΑ0.2+30g/L 蔗糖;
[0034]本发明白英的快速繁殖方法,包括以下步骤:
[0035](I)配置培养基:
[0036]a、种子萌发培养基 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7 和 S8 ;
[0037]b、子叶诱导愈伤组织培养基 Cl、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、Rl、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、RIO、Rll、R12、R13、R14、R15、R16、R17 和 R18 ;
[0038]C、下胚轴诱导愈伤组织培养基 PU P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、Rl、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、RIO、Rll、R12、R13、R14、R15、R16、R17 和 R18 ;
[0039]d、丛生芽培养基 RU R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、RIO、Rll、R12、R13、R14、R15、R16、R17 和 R18 ;
[0040]6、生根培养基?1、?2、?3、?4、?5、?6、?7、?8、卩9 和 PlO ;
[0041]上述各培养基在灭菌前调pH值调为5.8,加入10g/L琼脂,且在1.1kg/cm2,121°C饱和蒸气下灭菌20min ;
[0042](2)种子预处理:取新鲜果实,在果实无损情况下,去蒂,用蒸馏水漂洗几次,洗去浮土,然后转到超净工作台上,75%酒精浸没10秒,再用无菌水漂洗2~3次,在无菌水中剖开果实,取出种子无菌水反复漂洗2~3次,至洗去果肉,无菌滤纸上吸干水,接种于步骤(I)的种子萌发培养基中,每个配方接种五个重复,每个重复接种40粒种子;置于温度22 ± 2摄氏度的培养箱中,进行暗培养,接种后第7天和第14天分别统计种子萌发和生长情况;
[0043]此过程中利用风干种子作为对比例,风干种子的处理:先用20~30摄氏度温水浸泡24小时,置清水中揉搓漂洗,除去果肉及杂质,然后转到超净工作台上,浸入75%酒精20秒,再用无菌水漂洗3~4次,无菌滤纸上吸干水,接种于培养基中,每个配方接种五个重复,每个重复接种40粒种子。接种后第7天和第14天分别统计种子萌发和生长情况。
[0044]为综合分析种子苗生长情况,以发芽系数来评价最佳培养基。
[0045]发芽系数=第7天发芽率平均数*0.2+第7天胚轴长平均数*0.1+第14天发芽率平均数*0.2+第14天子叶个数平均数*0.4+第14天胚轴长平均数*0.1。
[0046](3)子叶愈伤组织培养:超净工作台上取出白英组培种子苗,把子叶切成 0.3*0.3cm的见方小片接种于子叶诱导愈伤组织培养基中,在温度22±2摄氏度的培养箱中,进行暗培养,在接种后第30天统计子叶愈伤组织生长情况;
[0047](4)下胚轴诱导愈伤组织培养:超净工作台上取出白英组培种子苗,把下胚轴切成Icm长的小段接种于下胚轴诱导愈伤组织培养基中,在温度22 ± 2摄氏度的培养箱中,进行暗培养,在接种后第30天统计下胚轴愈伤组织生长情况;将12小时/天光照处理为暗培养的对照组,观察种子发芽情况。
[0048](5)丛生芽培养:将组织接种到丛生芽培养基中,到接种后第30天时,愈伤组织已经分化出丛生芽,对丛生芽情况进行统计;
[0049](6)生根培养:把芽从基部切下,接种到生根培养基中,到接种后第30天时,对生根情况进行统计。
[0050]为综合分析丛生芽的生长情况,以增殖系数评价最佳培养基。
[0051]增殖系数=0.5*增殖倍数+0.5*丛生芽长度。
[0052]为综合分析根的生长情况,以生根系数评价最佳培养基。生根系数=第30天根数平均数*0.1+第30天根长平均数*0.3+第30天根系状况平均数*0.1+第60天根数平均数*0.1+第60天根长平均数*0.3+第60天根系状况平均数*0.1。
[0053]结果分析
[0054]1、种子发芽培养基的比较分析
[0055]经观察,新鲜种子接种后第4天开始萌动,第7天大部分种子发芽,第14天已有部分长出子叶。统计第7天的发芽率、平均胚轴长,第14天的发芽率、长出子叶的种子苗个数、平均胚轴长。利用统计到的数据,进行综合分析,由表3-1、表3-2、表3-3得到分析结果:在各项指标的差异显著性分析中,S3、S4与S5显著性较高。发芽系数是对组培种子苗情况的综合评定,S5最高S3、S4排在第二和第三。因此,种子萌发最佳培养基为S5,在该培养基中种子苗的发芽率、长出子叶的种子苗个数、胚轴长度和粗壮程度最佳,其它的培养基也较好。
[0056]表3-1种子发芽情况(? 士 λ)
【权利要求】
1.一种白英的快速繁殖方法,其特征在于包括以下步骤: (1)配置培养基: a、种子萌发培养基S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7 或 S8 ; b、子叶诱导愈伤组织培养基Cl、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、Rl、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、RIO、Rll、R12、R13、R14、R15、R16、R17 或 R18 ; C、下胚轴诱导愈伤组织培养基 PU P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、RU R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、RIO、Rll、R12、R13、R14、R15、R16、R17 或 R18 ; d、丛生芽培养基 Rl、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、RIO、Rll、R12、R13、R14、R15、R16、R17 或 R18 ; . 6、生根培养基?1、?2、?3、?4、?5、?6、?7、?8、?9或卩10 ;
所述的 SI 为 MS, S2 为 5/6MS, S3 为 2/3MS, S4 为 1/3MS, S5 为 MS+30g/L 蔗糖,S6 为.5/6MS+30g/L 蔗糖,S7 为 2/3MS+30g/L 蔗糖,S8 为 l/3MS+30g/L 蔗糖; 所述的 Pl 为 MS+NAA0.2+6-BA0.2+30g/L 蔗糖,P2 为 MS+NAA0.2+6-BA0.5+30g/L 蔗糖,P3 为 MS+NAA0.2+6-BA0.8+30g/L 蔗糖,P4 为 MS+NAA0.2+6-BA1.0+30g/L 蔗糖,P5 为 MS+IBA2.0+6-BA0.5+30g/L 蔗糖,P6 为 MS+IBA0.05+6-BA1.0+30g/L 蔗糖,P7 为 MS+IBA1.0+6-BA2.0+30g/L 蔗糖,P8 为 MS+NAA1.5+6-BA2.0+30g/L 蔗糖,P9 为MS+NAA0.2+6-BA2.0+30g/L 蔗糖,PlO 为 MS+NAA1.0+6-BA2.0+30g/L 蔗糖;
所述的 Cl 为 MS+IBA2.0+6-BA0.5+30g/L 蔗糖,C2 为 MS+NAA0.2+6-BA0.2+30g/L 蔗糖,C3 为 MS+IBA0.1+6-BA2.5+30g/L 蔗糖,C4 为 MS+IBA0.5+6-BA1.5+30g/L 蔗糖,C5 为MS+2.4-D0.5+30g/L 蔗糖,C6 为 MS+NAA1.0+6-BA1.0+30g/L 蔗糖,C7 为 MS+6-BA5.0+30g/L蔗糖,C8 为 MS+6-BA0.2+30g/L 蔗糖,C9 为 MS+NAA+6_BA+30g/L 蔗糖; 所述的 Rl 为 MS+6-BA0.5+30g/L 蔗糖,R2 为 MS+6-BA1.0+30g/L 蔗糖,R3 为MS+6-BA1.5+30g/L蔗糖,R4 为 MS+6-BA2.0+30g/L蔗糖,R5 为 MS+6-BA2.5+30g/L蔗糖,R6 为MS+6-BA3.0+30g/L 蔗糖,R7 为 MS+6-BA3.5+30g/L 蔗糖,R8 为 MS+6-BA4.0+30g/L 蔗糖,R9 为MS+6-BA4.5+30g/L 蔗糖,RlO 为 MS+6-BA5.0+30g/L 蔗糖,Rll 为 MS+6-BA5.0+IBA1.0+30g/L 蔗糖,R12 为 MS+6-BA0.5+IBA0.2+30g/L 蔗糖,R13 为 MS+6-BA0.8+IBA0.2+30g/L 蔗糖,R14 为 MS+6-BA1.0+ΙΒΑ0.2+30g/L 蔗糖,R15 为 MS+6-BA1.2+IBA0.2+30g/L 蔗糖,R16 为 MS+6-BA1.0+ΙΒΑ0.5+30g/L 蔗糖,R17 为 MS+6-BA1.5+IBA0.5+30g/L 蔗糖,R18 为MS+6-BA2.0+ΙΒΑ0.2+30g/L 蔗糖; 上述各培养基在灭菌前调PH值均为5.8,加入10g/L琼脂,且在1.1kg/cm2,121°C饱和蒸气下灭菌20min ; (2)种子预处理:取新鲜果实,在果实无损情况下,去蒂,用蒸馏水漂洗几次,洗去浮土,然后转到超净工作台上,75%酒精浸没10秒,再用无菌水漂洗2~3次,在无菌水中剖开果实,取出种子无菌水反复漂洗2~3次,至洗去果肉,无菌滤纸上吸干水,接种于步骤(I)的种子萌发培养基中,每个配方接种五个重复,每个重复接种40粒种子;置于温度.22 土 2摄氏度的培养箱中,进行暗培养,接种后第7天和第14天分别统计种子萌发和生长情况;
(3)子叶愈伤组织培养:超净工作台上取出白英组培种子苗,把子叶切成0.3*0.3cm的见方小片接种于子叶诱导愈伤组织培养基中,在温度22±2摄氏度的培养箱中,进行暗培养,在接种后第30天统计子叶愈伤组织生长情况; (4)下胚轴诱导愈伤组织培养:超净工作台上取出白英组培种子苗,把下胚轴切成Icm长的小段接种于下胚轴诱导愈伤组织培养基中,在温度22±2摄氏度的培养箱中,进行暗培养,在接种后第30天统计下胚轴愈伤组织生长情况; (5)丛生芽培养:将组织接种到丛生芽培养基中,到接种后第30天时,愈伤组织已经分化出丛生芽,对丛生芽情况进行统计; (6)生根培养:把芽从基部切下,接种到生根培养基中,到接种后第30天时,对生根情况进行统计。
2.如权利要求1所述白英的快速繁殖方法,其特征在于:所述步骤(1)中配置的培养基如下: a、种子萌 发培养基S5; b、子叶诱导愈伤组织培养基C2、R3或Rll; C、下胚轴诱导愈伤组织培养基PU P10、R5或Rll ; d、丛生芽培养基R3或R5; e、生根培养基Pl。
【文档编号】A01H4/00GK104012407SQ201410217570
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】吕洪飞, 皮二旭, 姜波, 梁宗锁, 祁哲晨, 徐涛, 郭万里, 李华磊 申请人:浙江理工大学
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