一种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法
【专利摘要】本发明涉及一种辣椒花药培养获得单倍体植株的方法，属于农业【技术领域】。包括选取花蕾，花蕾消毒，花药接种，预处理，花药培养，诱导愈伤组织再分化为单倍体植株。本发明采用固体培养基将小孢子和花药壁共培养，低温、热激预处理，调节愈伤诱导、分化培养基成分和培养条件，提高了愈伤率和愈伤组织的分化能力。应用此方法进行辣椒花药培养，愈伤诱导率60％以上，出苗率80％以上，解决了辣椒花药培养诱导率低的难题。本发明可快速获得单倍体再生植株，出苗率高，为新品种选育提供有力的手段。
【专利说明】
【技术领域】：
[0001] 本发明属农业领域，具体涉及一种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法。 一种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法 技术背景：
[0002] 辣椒是重要的蔬菜作物之一，栽培普遍而广泛。辣椒杂种优势十分显著，目前多采 用常规育种手段选育新品种，育种周期长，进展缓慢，未被利用的辣椒种质材料日益减少， 种质资源匮乏。
[0003] 花药培养是在单细胞水平上获得纯系的有效方法，是重要的育种辅助手段。花药 培养能够快速固定和保存有利基因，可用于远缘杂交新类型的培育和稳定，以及选择特异 性状，作为育种基础材料；花药培养，可快速实现高度遗传纯合性，缩短育种年限，提高育种 效率，加快育种进程。
[0004] 辣椒花药培养受材料基因型、花药发育时期、预处理、培养基成分和培养条件等因 素的影响，导致辣椒花药培养的诱导率低，获得单倍体非常困难，生产上应用极少。
【发明内容】
：
[0005] 本发明目的在于针对【背景技术】提出的辣椒花药培养效率低问题，提供一种辣椒花 药培养获得单倍体再生植株的方法。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0007] -种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法，包括以下步骤：
[0008] (1)取花粉发育处于单核中后期的花药；
[0009] (2)接种至预处理培养基上，预处理；
[0010] ⑶将预处理后的花药，在24°C?28°C条件下暗培养6?7d至花药顶端出现黄 白色组织后，转接至愈伤组织诱导培养基，在昼温25土 1°C /夜温22±1°C、光照2000? 3000LX、光周期14h · cT1条件下培养20?30d获得愈伤组织；
[0011] (4)将愈伤组织转接至1/2MS分化培养基上，在昼温25土 1°C /夜温22土 1°C、光 照3000?4000LX、光周期16h · cT1条件下分化培养至愈伤组织直径为1?2cm，然后转接 至MS分化培养基继续培育获得再生植株；
[0012] (5)移栽。
[0013] 所述的预处理培养基为 MS+0. lmg · L 1 ?0· 2mg · L 4-D+O. 5mg · L 1 ? 1. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼脂，ρΗ5· 8 ?6 培养基。
[0014] 所述预处理的过程为：置于4°C暗处理45?50h，再移至36°C处理120?150h。
[0015] 所述的愈伤组织诱导培养基为MS+0. lmg · Γ1?0. 25mg · Ll, 4-D+l. Omg · I71? 3. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼月旨，ρΗ5· 8 ?6。
[0016] 所述 1/2MS 分化培养基为 1/2MS+0. Olmg · L 1 ?0· 02mg · L ΑΑΑ+^ι· Omg · L 1 ? 6. Omg · L iT+l· Omg · L 1 ?5. Omg · L WcC 维生素 C)+2 % ?3 % 鹿糖 +0· 6 % ?0· 8 % 琼 月旨，ρΗ5· 8?6 ;所述的MS分化培养基为MS+0. Olmg · L 1?0· 02mg · L ^ΑΑ+Θ. Omg · L 1? 8.〇11^*]^11(丁+5.〇11^*]^1?10.〇11^*]^1￥〇+2 (%?3(%鹿糖+0.6(%?0.8(%琼月旨，卩!15.8? 6。
[0017] 本发明所述培养基中蔗糖和琼脂的浓度单位为质量百分比。
[0018] 步骤（5)中所述移栽的过程为：提前2d打开瓶盖，然后取出再生植株，洗净培养 基，50 %多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡，晾干后移植于装有灭菌蛭石和珍珠岩（体积比 2:1)的穴盘；置于育苗棚内驯化30?35d后定植于棚室。
[0019] 步骤（1)中所述单核中后期花药的取出过程为：植株盛花期于晴天上午9:00? 11:00采集花蕾，醋酸洋红染色压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期花蕾； 花蕾消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20?30min;然后依次用70 % (体积百分比）乙醇溶 液浸0. 5min，6. 0 %次氯酸钠溶液（取市售次氯酸钠分析纯6. 0ml加水定容至100ml)消毒 15min，最后用无菌水冲洗3?4次；无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离、取出。
[0020] 本发明方法的最优选技术方案为：
[0021] (1)取花粉发育处于单核中后期的花药
[0022] 取样：植株盛花期于晴天上午9:00?11:00采集花蕾。醋酸洋红染色法镜检鉴定 花粉发育时期，选取花粉发育处于单核中后期的花蕾。
[0023] 花蕾消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20?30min ;超净工作台内，花蕾70%乙醇 溶液浸〇. 5min，然后用6. 0%的次氯酸钠溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗3?4次，每次 5min。无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离、取出。
[0024] (2)接种至预处理培养基上，预处理
[0025] 将取出的花药接种于预处理培养基上，Parafilm封口膜封口。花药壁组织与小孢 子共培养，能提高愈伤组织的诱导频率。
[0026] 所述的预处理培养基为 MS+0. lmg · L 1 ?0· 2mg · L 4-D+O. 5mg · L 1 ? 1. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼脂，ρΗ5· 8 ?6 培养基。
[0027] 预处理：接种后，置于4°C暗处理45?50h，再移至36°C处理120?150h。通过预 处理可显著提高愈伤组织诱导频率。
[0028] (3)愈伤组织诱导：预处理后移至24°C?28°C组织培养室中暗培养。6?7d后花 药顶端现黄白色组织，转接至愈伤组织诱导培养基上，置于昼温25 ± 1 °C /夜温22 ± 1 °C、光 照2000?3000LX、光周期14h · cf1条件下培养获得愈伤组织。花药壁组织与小孢子共培 养，能提高愈伤组织的诱导频率。
[0029] 所述的愈伤组织诱导培养基为MS+0. lmg · Γ1?0. 25mg · Ll, 4-D+l. Omg · I71? 3. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼月旨，ρΗ5· 8 ?6。
[0030] (4)植株再生：培养20?30d后，将愈伤组织接种到1/2MS分化培养基上，置于昼 温25±1°C /夜温22±1°C、光照3000?4000LX、光周期16h · (Γ条件下培养。培养18? 24d后，愈伤组织直径1?2cm，接种于MS分化培养基上进行培养；8?12d后愈伤组织周 围可见黄绿色小点，并逐渐发育成小苗。
[0031] 所述 1/2MS 分化培养基为 1/2MS+0. Olmg · L 1 ?0· 02mg · L ΑΑΑ+^ι· Omg · L 1 ? 6.〇11^*]^11(丁+1.〇11^*]^1?5.〇11^*]^ 1\^+2(%?3(%鹿糖+0.6(%?0.8(%琼月旨，卩!15.8?6;
[0032] 所述的 MS 分化培养基为 MS+0. Olmg · L 1 ?0· 02mg · L WAA+e. Omg · L 1 ? 8.〇11^*]^11(丁+5.〇11^*]^1?10.〇11^*]^ 1￥〇+2(%?3(%鹿糖+0.6(%?0.8(%琼月旨，卩!15.8? 6〇
[0033] (5)移栽：移植前2d打开瓶盖；移栽时，将再生植株取出，洗净培养基，50%多菌灵 可湿性粉剂1〇〇〇倍液浸泡，移植于装有灭菌蛭石和珍珠岩（体积比2:1)的穴盘；穴盘置于 育苗棚内驯化，30?35d后定植于棚室。
[0034] 染色体鉴定：采用染色体计数直接鉴定法，显微镜下观察统计根尖细胞中期染色 体，进行再生植株染色体倍性检测。
[0035] 本发明所述的方法，通过培养成分和培养条件的调节，降低愈伤组织褐化的发生， 提1?诱导频率。
[0036] 本发明方法通过优化培养条件和培养基配方，显著提高了愈伤组织诱导率和植株 再生的频率。
[0037] 本发明的有益效果：
[0038] 本发明提供了一种辣椒花药培养技术，利用辣椒花药培养获得了单倍体再生植 株。采用固体培养基将小孢子和花药壁共培养，低温、热激预处理，调节愈伤诱导、分化培养 基成分和培养条件，提高了愈伤率和愈伤组织的分化能力。
[0039] 本发明中花药接种于培养基中进行预处理，花药壁组织与小孢子共培养，提高愈 伤组织的诱导频率；愈伤诱导及分化培养基成分和培养条件的调节，降低了愈伤组织褐化 的发生，提高了愈伤组织诱导和植株再生的频率。通过本发明的方法培育辣椒单倍体植株， 其愈伤诱导率达到60%以上，出苗率达到80%以上，本发明可快速获得单倍体再生植株， 出苗率高，为辣椒新品种选育提供更有效的手段。本发明的辣椒花药培养技术获得再生单 倍体，解决了辣椒花药培养诱导率低的难题。
【具体实施方式】：
[0040] 本实例以综合优良性状的杂交一代辣椒组合P1302、P1212作为试验材料，采用本 发明方法获取了单倍体植株。实施过程如下：
[0041] 一、取材
[0042] 5月上旬，试材盛花期，于晴天上午10:00采集花蕾。醋酸洋红染色压片法镜检花 药发育时期，选取处于单核中后期、蕾长5. 5?6. 5mm、花冠稍长于花萼的花蕾；适宜生长环 境条件下，花芽分化后23?25d，即开花前6?8d花蕾。
[0043] 二、消毒
[0044] (1)培养基灭菌与分装：60mm培养皿、三角瓶、固体培养基等121°C、1. IMpa灭菌 20min。超净工作台内分装，每一培养皿8ml培养基。
[0045] (2)花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗30min ;超净工作台内，冲洗后的花蕾用70% (体 积百分比）乙醇溶液浸0. 5min，然后用6. 0%次氯酸钠溶液（取市售次氯酸钠分析纯6. 0ml 加水定容至l〇〇ml)消毒15min，最后用无菌水冲洗4次，每次5min。无菌条件下，将花药从 消毒的花蕾中完整剥离、取出，去除花丝。
[0046] 三、预处理
[0047] 将取出的花药接种于预处理培养基：MS+0. 15mg · Ll, 4-D+l. Omg · 1^0+3% (质 量百分比）蔗糖+〇· 75% (质量百分比）琼脂，ρΗ5· 8 ;每一培养皿放入20枚花药，Parafilm 封口膜封口。将接种后的花药培养皿置于4°C暗处理2d ;然后移至36°C处理6d。
【权利要求】
1. 一种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 取花粉发育处于单核中后期的花药； (2) 接种至预处理培养基上，预处理； (3) 将预处理后的花药，在24°C?28°C条件下暗培养6?7d至花药顶端出现黄白色组 织后，转接至愈伤组织诱导培养基，在昼温25 ± 1 °C /夜温22 ± 1 °C、光照2000?3000LX、光 周期14h · cf1条件下培养20?30d获得愈伤组织； (4) 将愈伤组织转接至1/2MS分化培养基上，在昼温25±1°C /夜温22±1°C、光照 3000?4000LX、光周期16h · cf1条件下分化培养至愈伤组织直径为1?2cm，然后转接至 MS分化培养基继续培育获得再生植株； (5) 移栽。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的预处理培养基为MS+0. lmg · Γ1? 0.211^*]^12,4-0+0.511^*]^1?1.011^*]^11(丁+2 (%?3(%鹿糖+0.6(%?0.8(%琼月旨，卩!15.8? 6培养基。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述预处理的过程为：置于4°C暗处理 45?50h，再移至36°C处理120?150h。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的愈伤组织诱导培养基为 MS+0. lmg · L 1 ?0· 25mg · L 工2, 4-D+1. Omg · L 1 ?3. Omg · L % ?3 % 鹿糖 +0· 6 % ? 0.8%琼脂邛!15.8?6。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述1/2MS分化培养基为 1/2MS+0. Olmg · L 1 ?0· 02mg · L ΑΑΑ+^ι· Omg · L 1 ?6. Omg · L iT+l. Omg · L 1 ? 5. Omg · I^VC+2 %?3 %蔗糖+0· 6 %?(λ 8 %琼脂，ρΗ5· 8?6 ;所述的MS分化培养 基为 MS+0. Olmg · L 1 ?0· 02mg · L iNAA+G· Omg · L 1 ?8. Omg · L ^Τ+δ. Omg · L 1 ? 10. Omg · L-1VC+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼月旨，ρΗ5· 8 ?6。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5)中所述移栽的过程为：提前2d打 开瓶盖，然后取出再生植株，洗净培养基，50 %多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡，晾干后移 植于装有灭菌蛭石和珍珠岩（体积比2:1)的穴盘；置于育苗棚内驯化30?35d后定植于 棚室。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1)中所述单核中后期花药的取出过 程为：植株盛花期于晴天上午9:00?11:00采集花蕾，醋酸洋红染色压片法镜检鉴定花粉 发育时期，选取处于单核中后期花蕾；花蕾消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20?30min ; 然后依次用70 %乙醇溶液浸0.5min，6.0 %次氯酸钠溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗 3?4次；无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离、取出。
【文档编号】A01H4/00GK104041414SQ201410274070
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】张燕燕, 黄忠阳, 魏猷刚, 唐懋华, 缪其松, 刘叶琼, 胡静, 孙雪花 申请人:南京市蔬菜科学研究所