生物发酵饲料及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及生物发酵饲料及其制备方法，属于固体饲料领域。本发明要解决的技术问题是提供生物发酵饲料及其制备方法。本发明生物发酵饲料，是由复合菌液和发酵底物发酵而成，其中，复合菌液由枯草芽孢杆菌、复合酵母菌、乳酸杆菌和双歧杆菌组成，发酵底物由以下重量份的组分组成：玉米30～35重量份，豆粕10～15重量份，洗米糠25～35重量份，麦麸10～15重量份，酵母粉3～8重量份，氯化钠0.5～2重量份，磷酸氢钙1～5重量份，大豆油0～3重量份，硫酸锰0.5～1.5重量份，硫酸镁0.5～1.5重量份。本发明生物发酵饲料无抗生素，绿色安全，其生产原料来源广泛、可操作性大、效益明显，可降低各类疾病的发病率。
【专利说明】生物发酵饲料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物发酵饲料及其制备方法，属于固体饲料领域。
【背景技术】
[0002]随着人们生活水平的提高，对于绿色食品、无污染食品的需求越来越高，猪肉及其脏器作为中国人民传统的肉食更是备受关注。目前，猪的常用饲料种类很多，按营养划分为蛋白质饲料、能量饲料、粗饲料、青绿饲料、青忙饲料、矿物质饲料和饲料添加剂8大类。虽然各类饲料有各自特有的作用，对各种不同品种的猪的饲料搭配也有要求，特别是在植物性、动物性和矿物性物质中的抗营养因子不利于猪的消化吸收。同时，在肉猪的生产中，因急功近利导致过量的使用抗生素及滥用违禁物品，动物性食品中的有害物质残留可能超标，严重影响猪肉的产品质量，从而影响人们的身体健康。因此，针对猪肉产品的不同途径、方式和程度，研究环保型饲料替代品，取代那些易于造成猪肉污染的饲料或添加剂，从而生产出高质量安全型的猪肉产品，已成为未来饲料工业的一个新动向。
[0003]生物发酵饲料是指在人工控制条件下，微生物通过自身的代谢活动，将植物性、动物性和矿物性物质中的抗营养因子分解或转化，产生更能被畜禽采食、消化、吸收且无毒害作用的饲料原料。据研究表明，猪用全价饲料经过微生物发酵作用后，饲料中产生大量的乳酸菌，乙酸和乳酸浓度得到大幅度的提高，显著降低了饲料的pH值，饲喂发酵饲料能够提高猪的生长性能并且改善猪的肠道健康。目前的生物发酵饲料存在菌种来源复杂、营养水平低、对猪的肠道改善作用有限等缺陷，这些不仅与发酵菌种和发酵工艺相关，发酵底物对其也有一定的影响。
[0004]发明专利CN102499321A公开了一种复合菌无抗发酵饲料及其制备方法。该饲料由复合菌的菌液与配合饲料的干基质混合、发酵，发酵完成后添加4%的预混料而制成，其中，复合菌由枯草芽孢杆菌、噬酸乳杆菌和酿酒酵母菌组成，配比为1: 1: 1，干基质由以下重量百分比的组分组成:豆柏51.81%，玉米蛋白粉22.02%，菜籽柏3.89%，花生柏3.89%,磷酸氢钙5.18%，食盐2.98%，赖氨酸1.68%，氯化胆碱0.13%。该饲料未添加任何抗生素，由三种益生菌发酵而成，可以促进动物生长，并对维持肠道菌群平衡有一定的作用，但是，该饲料的干基质成本较高，并且在发酵完成之后还需加入由维生素、生物素、氯化胆碱等组成的预混料，生产工艺复杂，成本较高。
[0005]通常地，常见的益生菌如枯草芽孢杆菌、假丝酵母菌、酒香酵母菌、乳酸杆菌、双歧杆菌均可以从动物肠道以及人和动物的粪便中分离得到，如和文祥等人在婴儿粪便、老人粪便、蜜蜂肠道内分离得到双歧杆菌(双歧杆菌的分离、纯化及鉴定，西北农业学报，1999,8(4) =97-101);刘宇在猪肠道内分离得到乳酸杆菌(齐齐哈尔周边地区仔猪肠道乳酸杆菌的分离与鉴定，猪业科学，2011年第7期，94-95);周宏璐等人在猪粪便中分离得到枯草芽孢杆菌(一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其益生潜质分析，中国酿造，2010年第12期，137-139);田晖艳等在猪肠道内分离得到酒香酵母菌、瓶形酵母菌、假丝酵母菌等多种酵母菌(猪肠道酵母菌的分离与初步鉴定，饲料研究，2011年第10期，42-43)。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供生物发酵饲料及其制备方法，本发明的生物发酵饲料不含抗生素，不仅可促进动物生长，还能改善并维持肠道微生物群落稳定。
[0007]本发明生物发酵饲料，是由复合菌液和发酵底物发酵而成，其中，复合菌液由枯草芽孢杆菌、复合酵母菌、乳酸杆菌和双歧杆菌组成，复合酵母菌由假丝酵母菌和酒香酵母菌组成，发酵底物由以下重量份的组分组成:玉米30?35重量份，豆柏10?15重量份，洗米糠25?35重量份，麦麸10?15重量份，酵母粉3?8重量份，氯化钠0.5?2重量份，磷酸氢钙I?5重量份，大豆油O?3重量份，硫酸锰0.5?1.5重量份，硫酸镁0.5?1.5重量份。
[0008]本发明生物发酵饲料的复合酵母菌中，按数量比，假丝酵母菌:酒香酵母菌=1:1?3;复合菌液中，枯草芽孢杆菌:复合酵母菌:乳酸杆菌:双歧杆菌=190?210:1:7?12:7?12，优选假丝酵母菌:酒香酵母菌=1:2 ;优选枯草芽孢杆菌:复合酵母菌:乳酸杆菌:双歧杆菌=200:1:10:10。即本发明复合菌液中的四种细菌可分别进行液体培养，使用时取相应体积液体培养基混合即可，其体积比优选为枯草芽孢杆菌:复合酵母菌:乳酸杆菌:双歧杆菌=2:1:1:1，其中，枯草芽孢杆菌浓度以109CFU/ml计；复合酵母菌以107CFU/ml计；乳酸杆菌浓度以108CFU/ml计；双歧杆菌浓度以108CFU/ml计。
[0009]其中，为了提高饲效，发酵底物优选由以下重量份的组分组成:玉米32重量份，豆柏13重量份，洗米糠30重量份，麦麸12重量份，酵母粉5重量份，氯化钠I重量份，磷酸氢钙3重量份，大豆油2重量份，硫酸锰I重量份，硫酸镁I重量份。
[0010]进一步的，本发明生物发酵饲料复合菌液中的枯草芽孢杆菌、假丝酵母菌、酒香酵母菌、乳酸杆菌和双歧杆菌均由健康猪体内分离、提取得到，由这样的菌种发酵而得的饲料其重新定植肠道以及维持肠道微生物群落稳定的能力更强。
[0011]进一步的，本发明的复合菌液在发酵底物中的接种量为0.08?0.12ml/g,即在IOOg发酵底物中加入8?12ml的复合菌液，其中，复合菌液以芽孢杆菌的浓度为IO9CFU/ml计。优选复合菌液在发酵底物中的接种量为0.lml/g。
[0012]进一步的，本发明生物发酵饲料的发酵条件如下:发酵底物的含水量为60?65%，发酵时间为5?7天，发酵温度不低于20°C，优选发酵底物的含水量为65%。
[0013]本发明还提供本发明生物发酵饲料的制备方法，其步骤如下:
[0014]a、从健康猪体内分离、提取到枯草芽孢杆菌、复合酵母菌、乳酸杆菌以及双歧杆菌，并保存；
[0015]b、将枯草芽孢杆菌、复合酵母菌、乳酸杆菌以及双歧杆菌混合，并按3%的接种量接种到由15%糖蜜和5%乳清粉构成的液体培养基内，发酵2?3天；
[0016]C、将发酵好的菌液接种到发酵底物上，调节其水分含量，密封发酵5?7天，即得生物发酵饲料。
[0017]其中，枯草芽孢杆菌、复合酵母菌、乳酸杆菌以及双歧杆菌的分离鉴定方法可采用本领域常规的方法，也可采用以下方法进行:
[0018]枯草芽孢杆菌的分离提取:取健康成年猪新鲜粪便4g于50ml灭菌生理盐水中，180r/min80°C振荡15min ;取处理好的样品梯度稀释至10_9，选10'10_8、10_9三个梯度涂布于营养琼脂平板上，于37°C条件下培养48h ;挑取菌落为白色或乳白色，中间有星状皱起的单菌落再进行2?3次纯化培养；挑取少许纯化所得细菌，显微镜检；并4°C冰箱保存；枯草芽孢杆菌的鉴定:挑取少许上述保存细菌，分别进行淀粉水解试验、明胶液化试验、产蛋白酶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、抑菌试验；若上述试验结果只有吲哚试验为阴性，其它都是阳性，且抑菌试验中抑菌圈大于14mm，则判定所得细菌为所需枯草芽孢杆菌。
[0019]复合酵母菌的分离提取:选取宰杀后的健康成年猪，选取空肠剪开，取食糜样品装入封口袋中，4°C冰箱保存；取Ig样品，加生理盐水100ml，在180r/min和37°C的恒温摇床中摇瓶15min ;取处理好的样品梯度稀释至10_9，选ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—9三个梯度涂布于麦芽汁琼脂平板上，37°C条件下培养48h ;挑取菌落为白色或乳白色，有菌丝的单菌落再进行2?3次纯化培养；挑取少许纯化所得细菌，显微镜检；并4°C冰箱保存；复合酵母菌的鉴定:挑取少许上述保存细菌，分别进行淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、乙醇同化试验、葡糖糖发酵试验、抑菌试验；若上述试验都是阳性，且抑菌试验中抑菌圈大于14mm，则判定所得细菌为所需复合酵母菌。
[0020]乳酸菌的分离提取:取健康仔猪新鲜粪便4g于50ml灭菌生理盐水中，180r/min振荡5min ;取处理好的样品梯度稀释至10_9，选ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—9三个梯度涂布于MRS平板上，37°C条件下厌氧培养48h ;挑取菌落为白色或灰白色，圆形表面粗糙的单菌落再进行2?3次纯化培养；挑取少许纯化所得细菌，显微镜检；并4°C冰箱保存；乳酸菌的鉴定:挑取少许上述保存细菌，分别进行厌氧生长试验、硝酸盐还原试验、运动性试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验、吲哚试验；上述试验结果只有厌氧生长试验和抑菌试验为阳性，且抑菌试验中抑菌圈大于14mm，其它均为阴性，则判定所得细菌为所需乳酸菌。
[0021]双歧杆菌的分离提取:取健康仔猪新鲜粪便4g于50ml灭菌生理盐水中，180r/min振荡5min ;取处理好的样品梯度稀释至10_9，选10'10_8、10_9三个梯度涂布于BL平板上，于37°C条件下厌氧培养48h ;挑取菌落为乳白色的单菌落再进行2?3次纯化培养；挑取少许纯化所得细菌，显微镜检；并41:冰箱保存；双歧杆菌的鉴定:挑取少许上述保存细菌，分别进行厌氧生长试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验、吲哚试验；若上述结果只有厌氧生长试验和抑菌试验为阳性，且抑菌试验中抑菌圈大于14mm，其它均为阴性，则判定所得细菌为所需双歧杆菌。
[0022]本发明生物发酵饲料可作为饲料添加剂使用，在饲喂前半小时，将本发明生物发酵饲料与普通猪饲料混匀，并用水将饲料表面浸湿即可使用，其添加量可按饲养需求而定。一般的，饲喂仔猪添加量为20%，保育猪添加量为25%，育肥猪以及种、公猪添加量为30%。
[0023]与现有技术相比，本发明生物发酵饲料具有以下优点:
[0024]1、本发明生物发酵饲料无抗生素，绿色安全，可大量添加在日常用饲料中，能够确保进入猪体内的有益活菌数量，可降低各类疾病的发病率，特别是可降低消化道疾病的发病率。
[0025]2、本发明生物发酵饲料主要生物发酵菌的生长繁殖，水解各类营养物质，从而得到单糖、各类氨基酸、脂肪酸等可直接吸收利用的营养因子，降低了消化耗能，因此生产原料来源广泛、可操作性大、效益明显。
[0026]3、本发明生物发酵饲料成本低廉，有浓郁酒香味，可提高全群采食量，使用后，各阶段猪只采食量可提高12%，而猪饲料成本可降低13%。
[0027]4、本发明生物发酵饲料的复合菌液为从健康肥猪肠道内分离、提取到的有益菌，其重新定植肠道以及维持肠道微生物群落稳定的能力较其它途径得到的生物发酵菌强；且抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌能力较强，对全群消化道疾病有明显控制作用；发酵菌种为无毒、安全，对生物生长发育有益的菌株。
【具体实施方式】
[0028]本发明生物发酵饲料，是由复合菌液和发酵底物发酵而成，其中，复合菌液由枯草芽孢杆菌、复合酵母菌、乳酸杆菌和双歧杆菌组成，复合酵母菌由假丝酵母菌和酒香酵母菌组成，发酵底物由以下重量份的组分组成:玉米30?35重量份，豆柏10?15重量份，洗米糠25?35重量份，麦麸10?15重量份，酵母粉3?8重量份，氯化钠0.5?2重量份，磷酸氢钙I?5重量份，大豆油O?3重量份，硫酸锰0.5?1.5重量份，硫酸镁0.5?1.5重量份。
[0029]本发明生物发酵饲料的复合酵母菌中，按数量比，假丝酵母菌:酒香酵母菌=1:1?3;复合菌液中，枯草芽孢杆菌:复合酵母菌:乳酸杆菌:双歧杆菌=190?210:1:7?12:7?12，优选假丝酵母菌:酒香酵母菌=1:2 ;优选枯草芽孢杆菌:复合酵母菌:乳酸杆菌:双歧杆菌=200:1:10:10。即本发明复合菌液中的四种细菌可分别进行液体培养，使用时取相应体积液体培养基混合即可，其体积比优选为枯草芽孢杆菌:复合酵母菌:乳酸杆菌:双歧杆菌=2:1:1:1，其中，枯草芽孢杆菌浓度以109CFU/ml计；复合酵母菌以107CFU/ml计；乳酸杆菌浓度以108CFU/ml计；双歧杆菌浓度以108CFU/ml计。
[0030]其中，为了提高饲效，发酵底物优选由以下重量份的组分组成:玉米32重量份，豆柏13重量份，洗米糠30重量份，麦麸12重量份，酵母粉5重量份，氯化钠I重量份，磷酸氢钙3重量份，大豆油2重量份，硫酸锰I重量份，硫酸镁I重量份。
[0031]进一步的，本发明生物发酵饲料复合菌液中的枯草芽孢杆菌、假丝酵母菌、酒香酵母菌、乳酸杆菌和双歧杆菌均由健康猪体内分离、提取得到，由这样的菌种发酵而得的饲料其重新定植肠道以及维持肠道微生物群落稳定的能力更强。
[0032]进一步的，本发明的复合菌液在发酵底物中的接种量为0.08?0.12ml/g,即在IOOg发酵底物中加入8?12ml的复合菌液，其中，复合菌液以芽孢杆菌的浓度为IO9CFU/ml计。优选复合菌液在发酵底物中的接种量为0.lml/g。
[0033]进一步的，本发明生物发酵饲料的发酵条件如下:发酵底物的含水量为60?65%，发酵时间为5?7天，发酵温度不低于20°C，优选发酵底物的含水量为65%。
[0034]本发明还提供本发明生物发酵饲料的制备方法，其步骤如下:
[0035]a、从健康猪体内分离、提取到枯草芽孢杆菌、复合酵母菌、乳酸杆菌以及双歧杆菌，并保存；
[0036]b、将枯草芽孢杆菌、复合酵母菌、乳酸杆菌以及双歧杆菌混合，并按3%的接种量接种到由15%糖蜜和5%乳清粉构成的液体培养基内，发酵2?3天；
[0037]C、将发酵好的菌液接种到发酵底物上，调节其水分含量，密封发酵5?7天，即得生物发酵饲料。
[0038]其中，枯草芽孢杆菌、复合酵母菌、乳酸杆菌以及双歧杆菌的分离鉴定方法可采用本领域常规的方法，也可采用以下方法进行:
[0039]枯草芽孢杆菌的分离提取:取健康成年猪新鲜粪便4g于50ml灭菌生理盐水中，180r/min80°C振荡15min ;取处理好的样品梯度稀释至10_9，选10'10_8、10_9三个梯度涂布于营养琼脂平板上，于37°C条件下培养48h ;挑取菌落为白色或乳白色，中间有星状皱起的单菌落再进行2?3次纯化培养；挑取少许纯化所得细菌，显微镜检；并4°C冰箱保存；枯草芽孢杆菌的鉴定:挑取少许上述保存细菌，分别进行淀粉水解试验、明胶液化试验、产蛋白酶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、抑菌试验；若上述试验结果只有吲哚试验为阴性，其它都是阳性，且抑菌试验中抑菌圈大于14mm，则判定所得细菌为所需枯草芽孢杆菌。
[0040]复合酵母菌的分离提取:选取宰杀后的健康成年猪，选取空肠剪开，取食糜样品装入封口袋中，4°C冰箱保存；取Ig样品，加生理盐水100ml，在180r/min和37°C的恒温摇床中摇瓶15min ;取处理好的样品梯度稀释至10_9，选ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—9三个梯度涂布于麦芽汁琼脂平板上，37°C条件下培养48h ;挑取菌落为白色或乳白色，有菌丝的单菌落再进行2?3次纯化培养；挑取少许纯化所得细菌，显微镜检；并4°C冰箱保存；复合酵母菌的鉴定:挑取少许上述保存细菌，分别进行淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、乙醇同化试验、葡糖糖发酵试验、抑菌试验；若上述试验都是阳性，且抑菌试验中抑菌圈大于14mm，则判定所得细菌为所需复合酵母菌。
[0041]乳酸菌的分离提取:取健康仔猪新鲜粪便4g于50ml灭菌生理盐水中，180r/min振荡5min ;取处理好的样品梯度稀释至10_9，选ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—9三个梯度涂布于MRS平板上，37°C条件下厌氧培养48h ;挑取菌落为白色或灰白色，圆形表面粗糙的单菌落再进行2?3次纯化培养；挑取少许纯化所得细菌，显微镜检；并4°C冰箱保存；乳酸菌的鉴定:挑取少许上述保存细菌，分别进行厌氧生长试验、硝酸盐还原试验、运动性试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验、吲哚试验；上述试验结果只有厌氧生长试验和抑菌试验为阳性，且抑菌试验中抑菌圈大于14mm，其它均为阴性，则判定所得细菌为所需乳酸菌。
[0042]双歧杆菌的分离提取:取健康仔猪新鲜粪便4g于50ml灭菌生理盐水中，180r/min振荡5min ;取处理好的样品梯度稀释至10_9，选10'10_8、10_9三个梯度涂布于BL平板上，于37°C条件下厌氧培养48h ;挑取菌落为乳白色的单菌落再进行2?3次纯化培养；挑取少许纯化所得细菌，显微镜检；并41:冰箱保存；双歧杆菌的鉴定:挑取少许上述保存细菌，分别进行厌氧生长试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验、吲哚试验；若上述结果只有厌氧生长试验和抑菌试验为阳性，且抑菌试验中抑菌圈大于14mm，其它均为阴性，则判定所得细菌为所需双歧杆菌。
[0043]本发明生物发酵饲料可作为饲料添加剂使用，在饲喂前半小时，将本发明生物发酵饲料与普通猪饲料混匀，并用水将饲料表面浸湿即可使用，其添加量可按饲养需求而定。一般的，饲喂仔猪添加量为20%，保育猪添加量为25%，育肥猪以及种、公猪添加量为30%。
[0044]下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
[0045]实施例1
[0046]1、发酵底物的制备
[0047]取玉米30kg,豆柏IOkg,洗米糠25kg,麦麸IOkg,酵母粉3kg,氯化钠0.5kg,磷酸氢隹丐lkg,硫酸猛0.5kg,硫酸镁0.5kg,混勻,得到发酵底物A。
[0048]取玉米35kg,豆柏15kg,洗米糠35kg,麦麸15kg,酵母粉8kg,氯化钠2kg,磷酸氢钙5kg，大豆油3kg，硫酸锰1.8kg，硫酸镁1.8kg，混匀，得到发酵底物B。
[0049]取玉米32kg,豆柏13kg,洗米糠30kg,麦麸12kg,酵母粉5kg,氯化钠Ikg,磷酸氢隹丐3kg,大豆油2kg,硫酸猛Ikg,硫酸镁Ikg,混勻,得到发酵底物C。
[0050]2、菌种的分离鉴定
[0051]2.1、枯草芽孢杆菌的分离提取鉴定
[0052]a.枯草芽孢杆菌的分离提取:
[0053]取健康成年猪新鲜粪便4g于50ml灭菌生理盐水中，180r/min80°C振荡15min ；(无特殊说明的情况下，本发明实施例中所用猪及猪新鲜粪便均来自米易县万民农牧有限责任公司猪场。)
[0054]取处理好的样品梯度稀释至10_9，选10_7、10_8、10_9三个梯度涂布于营养琼脂平板上，于37°C条件下培养48h ;挑取菌落为白色或乳白色，中间有星状皱起的单菌落再进行2?3次纯化培养；
[0055]挑取少许纯化所得细菌，显微镜检；并4°C冰箱保存；
[0056]b.枯草芽孢杆菌的鉴定:
[0057]挑取少许上述保存细菌，分别进行淀粉水解试验、明胶液化试验、产蛋白酶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、抑菌试验；
[0058]若上述试验结果只有吲哚试验为阴性，其它都是阳性，且抑菌试验中抑菌圈大于14mm,则判定所得细菌为所需枯草芽孢杆菌。
[0059]2.2、复合酵母菌的分离提取鉴定
[0060]a.复合酵母菌的分离提取:
[0061 ] 选取宰杀后的健康成年猪，选取空肠剪开，取食糜样品装入封口袋中，4°C冰箱保存；
[0062]取Ig样品,加生理盐水100ml,在180r/min和37°C的恒温摇床中摇瓶15min ；
[0063]取处理好的样品梯度稀释至10_9，选10_7、10_8、10_9三个梯度涂布于麦芽汁琼脂平板上，37°C条件下培养48h ;挑取菌落为白色或乳白色，有菌丝的单菌落再进行2?3次纯化培养；
[0064]挑取少许纯化所得细菌，显微镜检；并4°C冰箱保存；
[0065]b.复合酵母菌的鉴定:
[0066]挑取少许上述保存细菌，分别进行淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、乙醇同化试验、葡糖糖发酵试验、抑菌试验；
[0067]若上述试验都是阳性，且抑菌试验中抑菌圈大于14mm，则判定所得细菌为所需复合酵母菌。
[0068]2.3、乳酸菌的分离提取鉴定
[0069]a.乳酸菌的分离提取:
[0070]取健康仔猪新鲜粪便4g于50ml灭菌生理盐水中，180r/min振荡5min ；
[0071]取处理好的样品梯度稀释至10_9，选ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—9三个梯度涂布于MRS平板上，37°C条件下厌氧培养48h ;挑取菌落为白色或灰白色，圆形表面粗糙的单菌落再进行2?3次纯化培养；[0072]挑取少许纯化所得细菌，显微镜检；并4°C冰箱保存；
[0073]b.乳酸菌的鉴定:
[0074]挑取少许上述保存细菌，分别进行厌氧生长试验、硝酸盐还原试验、运动性试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验、吲哚试验；
[0075]若上述试验结果只有厌氧生长试验和抑菌试验为阳性，且抑菌试验中抑菌圈大于14mm，其它均为阴性，则判定所得细菌为所需乳酸菌。
[0076]2.4、双歧杆菌的分离提取鉴定方法
[0077]a.双歧杆菌的分离提取:
[0078]取健康仔猪新鲜粪便4g于50ml灭菌生理盐水中，180r/min振荡5min ；
[0079]取处理好的样品梯度稀释至10_9，选ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—9三个梯度涂布于BL平板上，于37°C条件下厌氧培养48h ;挑取菌落为乳白色的单菌落再进行2~3次纯化培养；
[0080]挑取少许纯化所得细菌，显微镜检；并4°C冰箱保存；
[0081]b.双歧杆菌的鉴定:
[0082]挑取少许上述保存细菌，分别进行厌氧生长试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验、吲哚试验；
[0083]若上述结果只有厌氧生长试验和抑菌试验为阳性，且抑菌试验中抑菌圈大于14mm，其它均为阴性，则判定所得细菌为所需双歧杆菌。
[0084]3、复合菌液的制备
[0085]将上述筛选得到的四种细菌分别进行液体培养，使用时取相应体积液体培养基混合，其体积比为枯草芽孢杆菌:复合酵母菌:乳酸菌:双歧杆菌=此时，枯草芽孢杆菌浓度以109CFU/ml计；复合酵母菌以107CFU/ml计；乳酸菌浓度以108CFU/ml计；双歧杆菌浓度以108CFU/ml计。
[0086]将混合好的菌液按3%的接种量接种到由15%糖蜜和5%乳清粉构成的液体培养基内，发酵2~3天，此时，液体培养基散发出浓郁的酸香味，其中，双歧杆菌的浓度为109CFU/ml。
[0087]4、生物发酵饲料的制备
[0088]将上述制备的复合菌液接种到发酵底物上，并加入适量冷开水调节其水分在65%左右，此时，用力握紧一团发酵底物，拳缝有水印但无滴水，分装到密封袋内进行发酵至散发出浓郁酒香味，即得生物发酵饲料。其中，接种量和发酵条件见表1。
[0089]表1
[0090]
生物发酵饲料编号I发酵底物 I接种量I发酵时间 I发酵温度(°c)^
1发酵底物A~ 8%5^20
2发酵底物B~Τ?%25
3发酵底物C~12%28
4发酵底物C~10% 5^21[0091]试验例I
[0092]将实施例1所得的生物发酵饲料I~4应用于仔猪饲喂中。实验组I~4分别为在日常饲料中添加生物发酵饲料I~4(即实验组I为添加实施例1中的生物发酵饲料1，实验组2为添加实施例1中的生物发酵饲料2，实验组3为添加实施例1中的生物发酵饲料3，实验组4为添加实施例1中的生物发酵饲料4)，其添加量占总饲料量的20%。设两组对照，对照组I为日常饲料；对照组2在日常饲料中添加如下的生物发酵饲料:采用的复合菌液为市售的菌种配置而成(枯草芽孢杆菌、假丝酵母菌、酒香酵母菌、乳酸杆菌以及双歧杆菌均为市售)，其发酵条件与生物发酵饲料4的条件相同，其添加量占总饲料量的20%。每组30只乳猪，十次重复，取平均值，统计结果见表2。
[0093]表 2
[0094]
【权利要求】
1.生物发酵饲料，其特征在于:它是由复合菌液和发酵底物发酵而成，其中，复合菌液由枯草芽孢杆菌、复合酵母菌、乳酸杆菌和双歧杆菌组成，复合酵母菌由假丝酵母菌和酒香酵母菌组成，发酵底物由以下重量份的组分组成:玉米30~35重量份，豆柏10~15重量份，洗米糠25~35重量份，麦麸10~15重量份，酵母粉3~8重量份，氯化钠0.5~2重量份，磷酸氢韩I~5重量份,大豆油O~3重量份,硫酸猛0.5~1.5重量份,硫酸镁0.5~.1.5重量份。
2.根据权利要求1所述的生物发酵饲料，其特征在于:所述复合酵母菌中，按数量比，假丝酵母菌:酒香酵母菌=1:1~3 ;所述复合菌液中，枯草芽孢杆菌:复合酵母菌:乳酸杆菌:双歧杆菌=190~210:1:7~12:7~12，优选假丝酵母菌:酒香酵母菌=1:2 ;枯草芽孢杆菌:复合酵母菌:乳酸杆菌:双歧杆菌=200:1:10:10.
3.根据权利要求1所述的生物发酵饲料，其特征在于:所述发酵底物由以下重量份的组分组成:玉米32重量份，豆柏13重量份，洗米糠30重量份，麦麸12重量份，酵母粉5重量份，氯化钠I重量份，磷酸氢韩3重量份,大豆油2重量份,硫酸猛I重量份，硫酸镁I重量份。
4.根据权利要求1所述的生物发酵饲料，其特征在于:所述复合菌液中的枯草芽孢杆菌、假丝酵母菌、酒香酵母菌、乳酸杆菌和双歧杆菌均由健康猪体内分离、提取得到。
5.根据权利要求1~4任一项所述的生物发酵饲料，其特征在于:复合菌液在发酵底物中的接种量为0.08~0.12ml/g，其中，复合菌液以芽孢杆菌的浓度为109CFU/ml计。
6.根据权利要求5所述生物发酵饲料，其特征在于:复合菌液在发酵底物中的接种量为 0.lml/g.
7.根据权利要求1~6任一项所述的生物发酵饲料，其特征在于:发酵的条件如下:发酵底物的含水量为60~65%，发酵时间为5~7天，发酵温度不低于20°C，优选发酵底物的含水量为65%。
8.权利要求1~7任一项所述的生物发酵饲料的制备方法，其步骤如下: a、从健康猪体内分离、提取到枯草芽孢杆菌、复合酵母菌、乳酸杆菌以及双歧杆菌，并保存； b、将枯草芽孢杆菌、复合酵母菌、乳酸杆菌以及双歧杆菌混合，并按3%的接种量接种到由15%糖蜜和5%乳清粉构成的液体培养基内，发酵2~3天； C、将发酵好的菌液接种到发酵底物上，调节其水分含量，密封发酵5~7天，即得生物发酵饲料。
【文档编号】A23K1/00GK104012758SQ201410275657
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】万启明, 宋昌明 申请人:米易县万民农牧有限责任公司