绿豆尾孢菌叶斑病的抗病性快速鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种绿豆尾孢菌叶斑病的抗病性快速鉴定方法，该方法为将绿豆种子进行表面消毒，将表面消毒后的绿豆种子点播到培养盘内；光照黑暗交替下培养，并定期观察绿豆苗生长情况；采集绿豆两叶一心期的叶片，清水洗净后放吸水纸上，并与吸水纸放入盒中保持湿润，在叶片上用牙签造成小伤口并接种6mm的菌饼，在温室条件下光照，观察其发病情况，本发明的鉴定体系是在培养室中观察发病情况。已有的观察和研究表明，病原菌的活动受到温度、光照等环境因素的影响。由于培养室的环境条件较稳定，加之本发明的鉴定体系本身是一个完全封闭的系统，使得鉴定结果的重复性和可靠性得到保证。
【专利说明】绿豆尾孢菌叶斑病的抗病性快速鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业-植物保护【技术领域】，具体地指一种绿豆尾孢菌叶斑病的抗病性 快速鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 绿豆尾孢菌叶斑病由变灰尾孢菌（Cercospora canescens)引起，主要侵染叶片， 严重时也浸染茎和荚，在生长季碰到高湿天气尤为盛行。绿豆尾孢菌叶斑病是绿豆生产上 的毁灭性病害，发病初期叶片上出现水渍状褐色小点，扩展后形成边缘红褐色至红棕色、中 间浅灰色至浅褐色的近圆形病斑。湿度大时，病斑上密生灰色霉层，病情严重时，病斑融合 成片，很快干枯。轻者减产20-50 %，严重的高达90 %以上。
[0003] 目前对于绿豆尾孢菌叶斑病的防治主要是化学药剂防治。培育抗病品种是控制该 病最有效的方法之一，而建立快速简便的抗性鉴定体系是进行绿豆尾孢菌叶斑病抗病育种 的关键。
[0004] 由于该病菌的分离培养和产孢比较困难，而品种抗病性鉴定研究需要大量菌源， 因此给绿豆抗病品种的鉴定和筛选带来了一定困难，相关的研究报道也较少。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于针对绿豆抗病育种的特点和现有技术的不足，建立一种室内可重 复、快速准确鉴定绿豆品种对尾孢菌叶斑病抗性的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供的一种绿豆尾孢菌叶斑病的抗病性快速鉴定方 法，包括以下步骤：
[0007] 1)挑选颗粒饱满，大小相似的绿豆种子进行表面消毒，备用；
[0008] 2)将培养土装袋后进行高压灭菌，灭菌后的有机培养土分装到培养盘内，将表面 消毒后的绿豆种子点播到培养盘内；光照黑暗交替下培养，并定期观察绿豆苗生长情况；
[0009] 3)将尾孢菌菌株在V8果蔬汁培养基平板上，并将平板置于28°C恒温培养箱中活 化7天，再用无菌的、直径6_的打孔器在活化好的菌种菌落生长边缘打孔，将菌丝面扣在 新的V8蔬菜汁培养基中进行扩大繁殖，以备接种。
[0010] 4)采集绿豆两叶一心期的叶片，清水洗净后放吸水纸上，并与吸水纸放入盒中保 持湿润，在叶片上用牙签造成小伤口并接种6mm的菌饼，在温室条件下光照，让叶子发病； 一个品种做4个重复，每个重复3片叶子，一组对照。
[0011] 5)观察其发病情况，接菌7d后，测量叶片病斑大小，根据病斑大小，进行分级，计 算病情指数；其中〇级：无可见侵染病斑；1级：叶片上仅有小点状病斑，直径2mm以下；2 级：病斑直径3_以下，边缘褐色；3级：直径3?6_以上的中型斑，边缘褐色，中央有灰白 色坏死组织；4级：直径6_以上的不规则型病斑，其中0、1级属于抗病型，记以R，2级属于 中间型，记以1，3、4级属感病型，记以S。
[0012] 作为优选方案，所述步骤1)中，先用体积分数为75%的酒精消毒2s，然后用质量 分数1 %的NaCIO溶液消毒3min，最后无菌水洗3次。
[0013] 作为优选方案，所述步骤3)中，V8果蔬汁培养基包括V8果蔬汁：200mL/L、CaC03 : 3g/L、琼脂：20g/L。
[0014] 本发明的有益效果在于：
[0015] 1、本发明能直接观察绿豆苗的发病情况
[0016] 2、本发明可在较短时间内连续鉴定较大数量的绿豆苗，有利于大规模筛选绿豆尾 孢菌叶斑病抗病种苗
[0017] 3、本发明的鉴定体系是在培养室中观察发病情况。已有的观察和研究表明，病原 菌的活动受到温度、光照等环境因素的影响。由于培养室的环境条件较稳定，加之本发明的 鉴定体系本身是一个完全封闭的系统，使得鉴定结果的重复性和可靠性得到保证。
[0018] 4、本发明绿豆尾孢菌叶斑病抗病鉴定时容易进行人工控制，满足不同试验需要。
[0019] 5、本发明明确绿豆种子质量对于绿豆叶斑病的抗性，是绿豆抗叶斑病的前提条 件，为抗病亲本选择提供依据。选育抗尾孢菌叶斑病的绿豆品种资源是最经济有效地方法。 本发明为了从根本上减少尾孢菌叶斑病对绿豆产量和质量的损失，从抗病育种的角度基于 豆类叶斑病现有的抗性鉴定方法，研究通过菌丝块接种离体叶片，旨在建立一种室内可重 复、快速准确鉴定绿豆品种对尾孢菌叶斑病抗性的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为灰尾孢高粱产孢形态图；
[0021] 图2为V8果蔬汁培养灰尾孢形态图（扇变）；
[0022] 图3为不同品种离体叶片室内抗病性测定结果图。
【具体实施方式】
[0023] 为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但 本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0024] 1、V8果蔬汁培养基配料及制作方法：
[0025] V8果蔬汁培养基配料：100%的蕃茄、胡萝卜、甜菜、菠菜、生菜、西芹、西洋菜 (watercress)及洋堯茜8种田园蔬菜汁。购买品牌：金宝Campbell's。
[0026] 固体V8果蔬汁培养基配料及制作方法：每升培养基中含有V8果蔬汁：200mL、 CaC03 :3g、琼脂：15?20g。将各个材料按照比例分装到250mL的三角瓶中，用lmol/L氢氧 化钠调节pH值在6. 5?7. 0之间，灭菌后使用。
[0027] 液体V8果蔬汁培养基配料及制作方法：按照每升培养基中含有V8果蔬汁： 200mL、CaC0 3 :3g的比例加入到250mL三角瓶中，调节pH值到6. 5?7. 0之间，封口灭菌后 使用。
[0028] 2、病原菌分离和培养
[0029] 2. 1材料与设备
[0030] 从田间采集到的具有典型灰斑病症状的发病绿豆病叶，携带回实验室进行病原菌 的分离。共长岭县、公主岭市、镇赉县、通榆县、前郭县和洮南市等六个地方采集了叶斑病的 标样。
[0031] 配置好的体积分数为：75%的乙醇溶液、质量分数为1%的次氯酸钠溶液、摩尔浓 度为：lmol/L的氢氧化钠溶液；
[0032] 灭过菌的纯水、V8蔬菜汁、燕麦片、新鲜的番茄、高粱米、琼脂、碳酸钙等；
[0033] 250mL三角瓶、50mL三角瓶、培养皿、烧杯、剪刀、镊子、玻璃棒等。
[0034] 2. 2方法步骤
[0035] 选取发病叶片，按常规组织分离法对发病的绿豆叶片进行单病斑分离：
[0036] a.将从田间采集的发病叶片轻轻的冲洗干净，选取病健交界的组织切成 3mm X 3mm的小块；
[0037] b.表面消毒：用镊子夹住剪好的小叶片在75 %乙醇溶液中浸泡2?3s，再用1% 次氯酸钠消毒3min，后用灭菌水冲洗3次；
[0038] c.将表面消毒过的叶片放置于倒好的V8固体培养基平板上，在28°C条件下培养。
[0039] d.根据菌落颜色、形态，将不同的菌落挑出，在V8培养基上转接再纯化1?3次， 纯化后的菌株在V8果蔬汁培养基平板上28 °C培养。
[0040] 2. 3病原菌形态
[0041] 灰尾孢引起的叶斑病斑点生于叶片的正反两面，近圆形或不规则形，叶片斑点红 褐色至暗褐色，或中央浅褐色，边缘暗褐色，叶背面斑点浅褐色或者浅灰褐色。在V8液体培 养基中接菌，摇菌20天后观察孢子形态：分生孢子鞭形或蠕虫形，无色，有3-5?12个隔 膜，基部截形，顶端略尖，直或稍弯（图1)。这一观察结果与郭英兰描述的寄生在豆科植物 上的尾孢菌基本一致，故确认绿豆叶斑病的病原菌为尾孢菌。
[0042] 灰尾孢在培养过程中由于高频率的变异和基因重组而发生形态上可辨识的表现 型分离时，可出现扇形菌落（图2)。
[0043] 3、室内与田间的抗病性测定
[0044] 将绿玉翡翠、绿珍珠、十八罗汉、中绿一号等4个品种为实验材料，采集两叶一心 期的叶片，用自来水洗净备用，将塑料箱铺上适量的吸水纸，用小喷壶均匀喷上一层水于纸 上便于保湿。用直径6mm的打孔器在V8培养基上的菌丝前沿取菌丝块，在每片叶片的正面 中部稍偏叶脉部位用牙签造成小伤口后，接种菌丝块，将有菌丝面朝下贴着叶片的表面。用 保险膜蒙在塑料箱上有利于保湿条件，放入温室25°C条件下光照保湿培养。每个品种4个 重复，每个重复3次。接种病原菌后7d，按照0-4级的病害评价等级对绿豆苗进行病害等级 鉴定。
[0045] 其中0级：无可见侵染病斑；1级：叶片上仅有小点状病斑，直径2mm以下；2级：病 斑直径3mm以下，边缘褐色；3级：直径3?6mm以上的中型斑，边缘褐色，中央有灰白色坏 死组织；4级：直径6mm以上的不规则型病斑。其中0、1级属于抗病型，记以R(Resistant)， 2级属于中间型，记以I (Intermediate)，3、4级属感病型，记以S(Susceptible)。鉴定结果 见表1和图3。
[0046] 表14个绿豆品种的抗病性结果
[0047]
【权利要求】
1. 一种绿豆尾孢菌叶斑病的抗病性快速鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 挑选颗粒饱满，大小相似的绿豆种子进行表面消毒，备用； 2) 将培养土装袋后进行高压灭菌，灭菌后的有机培养土分装到培养盘内，将表面消毒 后的绿豆种子点播到培养盘内；光照黑暗交替下培养，并定期观察绿豆苗生长情况； 3) 将尾孢菌菌株在V8果蔬汁培养基平板上，并将平板置于28°C恒温培养箱中活化7 天，再用无菌的、直径6_的打孔器在活化好的菌种菌落生长边缘打孔，将菌丝面扣在新的 V8果蔬汁培养基中进行扩大繁殖，以备接种； 4) 采集绿豆两叶一心期的叶片，清水洗净后放吸水纸上，并与吸水纸放入盒中保持湿 润，在叶片上用牙签造成小伤口并接种6_的菌饼，在温室条件下光照； 5) 观察其发病情况，接菌7d后，测量叶片病斑大小，根据病斑大小，进行分级，计算病 情指数；其中〇级：无可见侵染病斑；1级：叶片上仅有小点状病斑，直径2_以下；2级：病 斑直径3mm以下，边缘褐色；3级：直径3?6mm以上的中型斑，边缘褐色，中央有灰白色坏 死组织；4级：直径6mm以上的不规则型病斑，其中0、1级属于抗病型，记以R，2级属于中间 型，记以1，3、4级属感病型，记以S。
2. 根据权利要求1所述的绿豆尾孢菌叶斑病的抗病性快速鉴定方法，其特征在于：所 述步骤1)中，先用体积分数为75%的酒精消毒2s，然后用质量分数1 %的NaCIO溶液消毒 3min，最后无菌水洗3次。
3. 根据权利要求1或2所述的绿豆尾孢菌叶斑病的抗病性快速鉴定方法，其特征在于： 所述步骤3)中，V8果蔬汁培养基包括V8果蔬汁：200ml/L、CaC0 3 :3g/L、琼脂：20g/L。
【文档编号】A01G7/00GK104094837SQ201410276784
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】刘昌燕, 焦春海, 肖炎农, 吴小微, 万正煌, 仲建锋, 李莉 申请人:湖北省农业科学院粮食作物研究所