玉米单倍体植株的培育方法
【专利摘要】本发明涉及植株单倍体的培育方法，尤其涉及一种玉米单倍体幼胚培养成单倍体植株的方法，其以玉米单倍体幼胚为受体材料，将其诱导为愈伤组织，并将该愈伤组织接种于继代培养基，采用光暗培养的方法进行光照鉴定，筛选出未变色的愈伤组织作为拟单倍体愈伤组织，进行分化和生根培养得到玉米单倍体植株。本发明利用玉米单倍体幼胚获得玉米单倍体植株，通过光照培养进行单倍体愈伤组织的鉴定，该鉴定方法简单易行，降低了鉴定成本；该培育方法建立了单倍体植株的稳定高效的组织培养体系，可广泛用于玉米的遗传再生、组织培养、材料选育等方面。
【专利说明】玉米单倍体植株的培育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植株单倍体的培育方法，尤其涉及一种玉米单倍体幼胚培养成单倍体植株的方法。
【背景技术】
[0002]玉米是世界上主要的粮食、饲料和经济作物，1998年以来，玉米的总产量超过水稻和小麦，居世界首位，但是全球玉米需求持续增长，尤其是亚洲地区；我国玉米长期以来存在需求量大、供求不足的问题，因此，当务之急应开发高产、优质、多抗的玉米新品种。
[0003]玉米是雌雄同株异花、进行有性生殖的作物，是研究遗传学、基因组学和分子生物学的理想的单子叶模式植物。通过常规的杂交育种获得纯合的株系需要漫长的育种周期。为了获得纯合的玉米株系，研究者以往采用选育玉米自交系的方法，但是玉米自交系的培育，必须经过多代的自交和选择，选育一个品种的年限很长。因此，研究者一直致力于如何缩短选育玉米自交系的时间，提高育种效率。
[0004]随着生物技术的迅速发展和不断完善，越来越多的研究和新品种的产生采用基因工程手段来进行作物遗传改良和新物种的创造。目前，植物基因转化多以成熟胚、幼胚或其诱导的愈伤组织、丛生芽及原生质体等二倍体材料作为受体。这些材料来源相对较广泛，转化效率较高，生活力较强，但由于外源基因在转化所得的阳性植株中易发生丢失和沉默或多以杂合状态存在，导致遗传稳定性下降或形成嵌合体，由此要得到纯合株系，至少需要培育5-7代，即4-6年的时间，导致需要消耗大量的人力和时间。而单倍体材料只有一套染色体，以单倍体为转基因受体，避免了等位基因分离，单倍体植株或组织器官经加倍即可得到纯合的二倍体植株，可使外源基因在后代中迅速纯合并稳定遗传，即培育2个世代就可以获得纯合株系，明显缩短育种年限。因此，以单倍体为受体的转基因育种技术越来越受到关注，且以单倍体植株或组织器官作为转基因受体已经成功的应用于烟草、水稻等多种植物中。
[0005]转基因育种需要建立优良的再生体系作为遗传转化的基础，因此，对于研究以单倍体为受体的转基因育种技术，首先需要建立一套成熟的遗传再生体系。目前，国内外许多研究中虽已获得了大量以单倍体为受体的玉米转基因植株，但大部分都是经大量且多次重复实验后仅得到几个转基因植株后代，尤其是以小孢子、花药等组织为转化受体的材料，其存在愈伤组织诱导率低、愈伤组织器官分化率低等问题，导致其转化效率不到1%，远不能达到生产应用的标准。由此可知，现阶段迫切需要一种能提高材料转化效率、缩短转化时间的转化受体，该转化受体为玉米单倍体植株培养的关键。
[0006]玉米单倍体植株培养的另一关键是单倍体的鉴定效率。目前，玉米单倍体的鉴定方法主要有形态鉴别法及遗传标记法等，但在实践中，以上鉴定方法由于不同材料的表达差别以及不同的环境条件对表达的影响，对鉴定结果有较大差别。因此迫切需要开发出一种新的高效、准确的单倍体鉴定方法。
【发明内容】
[0007]针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种采用玉米单倍体幼胚为受体材料，培养成愈伤组织后进行单倍体鉴定，最后培养为玉米单倍体植株的方法。
[0008]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下:
[0009]一种玉米单倍体植株的培育方法，包括以下步骤:
[0010](I)首先获取玉米单倍体幼胚，取授粉后10-14d的玉米幼穗，从玉米幼穗的籽粒中挑取玉米幼胚；随后将玉米幼胚接种于诱导培养基，(26±2) °C暗培养20d，后得到愈伤组织；
[0011](2)其次进行第一次继代培养和第一次倍性鉴定，将得到的所述愈伤组织进行光暗周期培养，光照强度2000-25001X，光照时间14h+暗培养10h，筛选未变色的愈伤组织作为拟单倍体I愈伤组织；随后将所述的拟单倍体I愈伤组织继代培养数次，筛选出准单倍体愈伤组织，并对其继续继代培养数次；
[0012](3)再次进行分化培养和生根培养，将得到的所述准单倍体愈伤组织接种于分化培养基中培养，得到玉米单倍体幼苗，随后将玉米单倍体幼苗转移到生根培养基中，培养得到完整的植株。
[0013]较佳地，所述单倍体II型愈伤组织的分化及再生方法具体为:将II型愈伤组织转到分化培养基中，28°C暗培养7d后，转到相同温度下每天12~16h的光照培养，待愈伤组织上长出绿色芽后， 将愈伤组织转入分化培养瓶中光照强度为1500~20001x，日光灯照明，培养成苗。当幼苗长大到3~5cm时，从幼苗基部将小苗分成单株，不要损伤生长点，转移到生根培养基上，在28 °C光照培养，2~3周后小植株长出大量的根，形成完整的植株。植株长到约1cm时，打开培养瓶瓶盖，加入无菌水没过培养基，光照培养2d后再取出，洗净粘在根系上的培养基，炼苗(炼苗用的土:蛭石的比例为3: I)，炼苗时用蒸馏水保湿。待植株适应外界环境、健康生长后，将其转移到育种基地，育成完整的植株个体。
[0014]较佳地，所述“将所述的拟单倍体I愈伤组织继代培养数次，筛选出准单倍体愈伤组织”包括第二次继代培养和第二次倍性鉴定，具体为将所述拟单倍体I愈伤组织接种于继代培养基上培养，培养完成后进行第二次倍性鉴定，筛选出拟单倍体II愈伤组织后继续进行继代培养，得到准单倍体愈伤组织；其中所述第二次倍性鉴定为染色体压片观察鉴定。
[0015]具体地，所述染色体压片观察鉴定方法为:取Imm左右的拟单倍体I愈伤组织继代培养后的愈伤组织材料浸泡在α -溴奈中进行预处理，以药液浸没该愈伤组织为度，处理3~4h。愈伤组织经预处理后，用流水冲洗，然后投入卡诺液(3份甲醇:1份冰乙酸，现配现用)中固定3d，用95%的乙醇洗两次，转入70%乙醇中保存备用。从70%乙醇中取出固定好的愈伤组织，流水冲洗7min，吸水纸吸干；放入盛有适量lmol/L HC1，60°C的离心管中水浴保温，解离lOmin。解离后材料水洗5min并吸干，取0.2mm左右的愈伤组织于载玻片上压碎打散，滴加I~2滴卡宝品红染液，染色10~15min，压片。在经染色的材料上加一滴染液，盖上盖玻片，覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打，或以拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动)，使材料分散压平。使用OLYMPUS相差显微镜进行观察和记录，筛选出拟单倍体II材料。
[0016]较佳地，所述“将所述的拟单倍体I愈伤组织继代培养数次，筛选出准单倍体愈伤组织”还包括第三次继代培养和第三次倍性鉴定，具体为将所述拟单倍体II愈伤组织接种于继代培养基上培养，培养完成后进行第三次倍性鉴定，筛选出准单倍体愈伤组织；其中所述第三次倍性鉴定具体为流式细胞仪检测鉴定。
[0017]具体地，所述流式细胞仪检测鉴定方法为:取拟单倍体II愈伤组织材料继代培养后的愈伤组织lg，分别在Im L中Otto I buffer (pH2.3的0.lmol/L梓檬酸+0.5% (v/v)Tween20)用锋利的刀片切碎、过滤、收集滤液,经5000r/min离心5min后，弃上清至10mL,再加入 100m L Otto I buffer 于 4°C保存。加入 Otto II buffer (pH = 8.9 的 0.4mol/LNa2HPO4.12H20)和 RNase 后，用 PI (Propidium 1dide 碘化丙卩定，50mg/mL)染液对细胞核DNA进行荧光标记，置于暗处30min后，用流式细胞仪进行植株倍性鉴定。采用美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪(flow cytometry)进行倍性检测，并用cellQuest (BD公司)软件获取数据，ModFit软件(Yeritv Software House公司)分析结果,得到准单倍体愈伤组织。
[0018]较佳地,所述分化培养的培养基是在N6基本培养液中添加酸水解酪蛋白、L-脯氨酸、2，4 一二氯苯氧乙酸、激动素、6-苄氨基腺嘌呤、脱落酸、萘乙酸、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中所述碳源为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖中的一种或几种，所述凝胶剂为琼脂、卡拉胶中的一种；其他组分的浓度为:激动素为0.2~lmg/L, 6-节氨基腺嘌呤为0.5~2mg/L,脱落酸为0.2~lmg/L, 2，4 一二氯苯氧乙酸为0.2~lmg/L,萘乙酸为0.1~lmg/L。更优地，所述激动素的浓度为0.5mg/L,所述6-苄氨基腺嘌呤的浓度为0.5mg/L,所述脱落酸的浓度为0.5mg/L,所述2，4 一二氯苯氧乙酸的浓度为lmg/L,所述萘乙酸的浓度为0.1mg/L0
[0019]较佳地，所述诱导培养基在N6基本培养液的基础上添加2,4 —二氯苯氧乙酸、酸水解酪蛋白、L 一脯氨酸、碳源和凝胶剂得到的固体培养基，pH为6.0。更优地，所述诱导培养基中2，4 一二氯苯氧乙酸的浓度为2.0mg/L，酸水解酪蛋白的浓度为500mg/L，L 一脯氨酸的浓度为1.38g/L。
[0020]较佳地，所述继代培养基为在N6基本培养液的基础上添加2，4 一二氯苯氧乙酸、酸水解酪蛋白、L 一脯氨酸、甘露醇、碳源和凝胶剂得到的固体培养基，pH为6.0 ;更优地，所述继代培养基中2，4 一 D的浓度为1.5mg/L，酸水解酪蛋白的浓度为500mg/L，L 一脯氨酸的浓度为690mg/L，甘露醇的浓度为20g/L。
[0021]较佳地，所述生根培养的培养基为在1/2MS培养液的基础上添加生根粉、烯效矬、碳源和凝胶剂得到的固体培养基，PH为6.0 ;较优地，所述生根培养基中生根粉的浓度为lmg/L,烯效娃的浓度为0.5mg/Lo
[0022]以上培养基中的所述碳源为蔗糖，其浓度为30g/L，所述凝胶剂为琼脂粉，浓度为5g/L,以上培养液均在121 °C高压灭菌15min。
[0023]较佳地，所述玉米单倍体幼胚的来源为以玉米孤雌生殖诱导系EDI为父本，优良自交系18-599R为母本，杂交授粉10-14d后玉米幼穗中的籽粒。
[0024]玉米遗传再生及再生的受体材料主要有幼胚和非幼胚类型，其中前者包括幼胚或幼胚诱导的胚性愈伤组织，后者包括茎尖组织直接分化再生和成熟胚、叶片、茎段、胚芽鞘等诱导的胚性愈伤组织。幼胚和幼胚诱导的胚性愈伤组织是玉米再生及转化中最常用的受体材料，其遗传转化程序简单、成熟，植株再生能力较强，培养过程比较容易。胚芽鞘和成熟胚的优点在于不受季节限制，但其诱导和再生效率明显较低，且转化效率低。相较于胚芽鞘和成熟胚，玉米幼胚在授粉后10~15d即可进行取材培养，且再生能力最强，能够形成较好的适合遗传转化的II型愈伤组织，可以在时间上缩短育种周期。而胚芽鞘和成熟胚的取材时间明显晚于幼胚，再生能力也不如幼胚，因此幼胚优于其他组织。
[0025]本发明具有以下积极的效果:
[0026](I)为实现发明目的，本发明使用单倍体玉米幼胚作为实验材料，结合光照筛选、染色体压片技术、流式细胞仪检测技术，遗传再生成单倍体植株，来达到建立玉米单倍体遗传再生体系的目的，该方法从形态、组织和细胞水平上实现玉米单倍体的鉴定，为单倍体遗传转化打下基础，实现缩短育种周期的效果。
[0027](2)本发明的方法操作简单可行，与二倍体幼胚、单倍体花药、小孢子培养和其他玉米组织培养的方法相比，玉米单倍体幼胚的组织培养具有明显时间优势和突破性特点，可实现缩短育种周期，另外玉米幼胚的再生能力明显高于其他部位，具有提高转化效率的优势，对于玉米基因工程方面的理论研究以及遗传育种实践均具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为EDI与18-599R杂交果穗幼胚诱导培养及产生的胚性愈伤组织；
[0029]图2为愈伤组织的光照观察结果；
[0030]图3为单倍体和二倍体愈伤组织染色体压片观察结果；
[0031]图4为单倍体和二倍体愈伤组织流式细胞仪检测结果；
[0032]图5为三次倍性鉴定的筛选结果；
[0033]图6为幼胚中的单倍体检测结果；
[0034]图7为准单 倍体II型愈伤组织的分化与成苗结果；
[0035]图8为准单倍体II型愈伤组织的分化与成苗率；
[0036]图9为炼苗并获得的单倍体植株。
【具体实施方式】
[0037]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步的详细说明。
[0038]一、材料
[0039]母本:玉米优良自交系18-599R
[0040]父本:玉米孤雌生殖诱导系EDI
[0041]以上父本和母本均由四川农业大学玉米研究所提供，材料于2012年10月种植于
云南省西双版纳。
[0042]二、培养基组成及浓度
[0043]诱导培养基:N6基本培养液+2，4 — 二氯苯氧乙酸(2，4 — D) (2.0mg/L) +酸水解酪蛋白500mg/L+L —脯氨酸1.38g/L ；
[0044]继代培养基:N6基本培养液+2，4 — 二氯苯氧乙酸(2，4 — D) (1.5mg/L) +酸水解酪蛋白500mg/L+L —脯氨酸690mg/L+甘露醇20g/L ；
[0045]分化培养基:N6基本培养液+激动素(KT) (0.5mg/L) +6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)(0.5mg/L) + 脱落酸(ABA) (0.5mg/L) +2, 4 一二氯苯氧乙酸(2，4_D) (lmg/L) + 萘乙酸(NAA)(0.lmg/L) ++ 酸水解酪蛋白 100mg/L+L —脯氨酸 690mg/L ；[0046]生根培养基:1/2MS基本培养液+生根粉(ABT) (lmg/L) +烯效唑(0.5mg/L)；
[0047]以上培养基均含30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉，以水为溶剂，pH6.0，且均在121 °C高
压灭菌15min。
[0048]其中，N6基本培养液的组成如表1所示:
[0049]
【权利要求】
1.一种玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)首先获取玉米单倍体幼胚，取授粉后10-14d的玉米幼穗，从玉米幼穗的籽粒中挑取玉米幼胚；随后将玉米幼胚接种于诱导培养基，(26±2)°C暗培养20d，后得到愈伤组织； (2)其次进行第一次继代培养和第一次倍性鉴定，具体为将所述愈伤组织接种于继代培养基上进行光暗周期培养，光照强度2000-25001X，光照时间14h+暗培养10h，筛选未变色的愈伤组织作为拟单倍体I愈伤组织；随后将所述的拟单倍体I愈伤组织继代培养数次，筛选出准单倍体愈伤组织； (3)再次进行分化培养和生根培养，得到完整的玉米单倍体植株。
2.根据权利要求1所述的玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于:所述“将所述的拟单倍体I愈伤组织继代培养数次，筛选出准单倍体愈伤组织”包括第二次继代培养和第二次倍性鉴定，具体为将所述拟单倍体I愈伤组织接种于继代培养基上培养，培养完成后进行第二次倍性鉴定，筛选出拟单倍体II愈伤组织后继续进行继代培养，得到准单倍体愈伤组织；其中所述第二次倍性鉴定为染色体压片观察鉴定。
3.根据权利要求2所述的玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于:所述“将所述的拟单倍体I愈伤组织继代培养数次，筛选出准单倍体愈伤组织”还包括第三次继代培养和第三次倍性鉴定，具体为将所述拟单倍体II愈伤组织接种于继代培养基上培养，培养完成后进行第三次倍性鉴定，筛选出准单倍体愈伤组织；其中所述第三次倍性鉴定具体为流式细胞仪检测鉴定。
4.根据权利要 求1所述的玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于:所述分化培养的培养基是在N6基本培养液中添加酸水解酪蛋白、L-脯氨酸、2，4 一二氯苯氧乙酸、激动素、6-苄氨基腺嘌呤、脱落酸、萘乙酸、碳源和凝胶剂得到的固体培养基； 其中所述碳源为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖中的一种或几种，所述凝胶剂为琼脂、卡拉胶中的一种；其他组分的浓度分别如下: 酸水解酪蛋白为400~lmg/L, L-脯氨酸为600~800mg/L,激动素为0.2~lmg/L,6-节氨基腺嘌呤为0.5~2mg/L,脱落酸为0.2~lmg/L, 2，4 一二氯苯氧乙酸为0.2~Img/L,萘乙酸为0.1~lmg/L。
5.根据权利要求3所述的玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于:所述酸水解酪蛋白的浓度为500mg/L,所述L-脯氨酸的浓度为690mg/L,所述激动素的浓度为0.5mg/L,所述6-节氨基腺嘌呤的浓度为0.5mg/L,所述脱落酸的浓度为0.5mg/L,所述2，4 一二氯苯氧乙酸的浓度为lmg/L，所述萘乙酸的浓度为0.lmg/L ο
6.根据权利要求1所述的玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于:所述诱导培养基在N6基本培养液的基础上添加2，4 一二氯苯氧乙酸、酸水解酪蛋白、L 一脯氨酸、碳源和凝胶剂得到的固体培养基，pH为6.0。
7.根据权利要求1所述的玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于:所述继代培养基为在N6基本培养液的基础上添加2，4 一二氯苯氧乙酸、酸水解酪蛋白、L 一脯氨酸、甘露醇、碳源和凝胶剂得到的固体培养基，PH为6.0。
8.根据权利要求1所述的玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于:所述生根培养的培养基为在1/2MS培养液的基础上添加生根粉、烯效唑、碳源和凝胶剂得到的固体培养基，pH 为 6.0。
9.根据权利要求1所述的玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于:所述玉米单倍体幼胚的来源为以玉 米孤雌生殖诱导系EDI为父本，优良自交系18-599R为母本，杂交授粉10-14d后玉米幼穗中的籽粒。
【文档编号】A01H4/00GK104026017SQ201410277784
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】林海建, 陈琦, 殷丽琴, 张志明, 沈亚欧, 潘光堂, 钟成, 兰海, 周树峰, 江舟, 刘丽 申请人:四川农业大学