一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法
【专利摘要】一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法,通过提取抗病性强的植株花粉,对母本植株进行杂交授粉,获得杂交果实后,将合子胚、珠心胚分离开,保留合子胚,并对合子胚采用人工培养基培养,避免了合子胚的败育,具有抗溃疡病有性后代植株,具有操作性强、简单实用、效果显著等优点。
【专利说明】一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及一种获得柑橘杂交后代的方法,具体涉及一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法。
【【背景技术】】
[0002]柑橘在目前已成为世界上第一大水果,每年总产已超过I亿吨,占世界水果总产的25%左右,是世界第三大贸易农产品。全球有100多个国家和地区生产柑橘。我国是柑橘的原产中心之一,也是柑橘的生产大国,种植面积及产量均居世界第一。柑橘溃疡病(citrus bacterial cankerdisease, CBO))是一种世界性病害,是国际、国内植物检疫对象,该病起源于亚洲,分布于世界多个国家和地区,又称为亚洲病害。近年来,各地区该病害发生有加重趋势,给柑橘产业带来了巨大损失。
[0003]由于不同柑橘种类和品种对溃疡病的抗性差异大,枸橼的果实果肉硬,酸涩苦,口感粗糙,商品性差但抗病;而冰糖橙少子,香甜多汁,商品性好但易感病。从柑橘溃疡病抗性遗传上讲,用抗病品种作母本的杂交后代,多数表现为抗病或介于双亲之间,用感病品种作母本的杂交后代几乎都表现为感病。因此,通过常规杂交育种的方式,以枸橼为父本,冰糖橙为母本,期望得到对柑橘溃疡病有抗性且商品性良好的杂交后代。
[0004]然而柑橘有多胚现象,即在种子发育过程中或成熟种子中出现两个或两个以上的胚,这些胚中除一个是由受精卵发育的合子胚,其余都是由珠心细胞发育来的珠心胚。珠心胚的旺盛生长,往往在合子胚的发育过程中侵入胚囊,阻碍合子胚的发育,使合子胚在发育的早期阶段就败育或退化,由于柑橘种子多胚性和育种周期长,柑橘杂交育种一直较难取得成功。
【
【发明内容】
】
[0005]本发明针对上述问题,提供一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法,通过将杂交授粉后果实种子中合子胚、珠心胚分离开,之后对合子胚进行培养以获得具有抗溃疡病的柑橘杂交后代。
[0006]本发明提供的一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法,其包括以下步骤:
[0007]SOl:杂交授粉:提取父本花粉;对母本花朵进行去雄处理后,授以父本花粉;将授粉后的母本花朵进行套袋密封处理;8?12天之后去掉密封袋,喷保花保果剂;
[0008]S02:提取合子胚:母本花朵进行杂交授粉90?110天后,采收幼果待用;将采收的幼果进行消毒处理后,取出果实种子;之后将拨开果实种子果皮,将果实种子内的合子胚、珠心胚分离开,去掉珠心胚,保留合子胚;
[0009]S03:合子胚培养、获得胚培苗:将获取的合子胚放入Murashge and Tucker (以下简称MT)+GA3(赤霉素)lmg/L培养基后,放入密封的培养器中,在温度为26°C?28°C、湿度为75%?85%的无光条件下培养5?7天,待合子胚生出根后在有光条件下继续培养,25?35天之后将合子胚转入MT+GA3(赤霉素)lmg/L+3%蔗糖培养基中进行培养获得胚培苗;
[0010]S04:炼苗、移栽:待胚培苗长出至少3片真叶后,将密封的培养器打开进行炼苗,7?15天后,清洗掉胚培苗根部残留的培养基,移栽至装有基质的营养钵中。
[0011]特别的,所述步骤SOl采用人工点授法,首先将获取的I份父本花粉与5?8份滑石粉混合均匀获得稀释花粉,将获得的稀释花粉装入瓶中,之后采用一端具有弹性部件的杆状件沾取稀释花粉,每沾取一次点授3?5多母本花朵。
[0012]特别的,所述步骤S02中对幼果消毒时首先将幼果果实表面用75%酒精进行第一次消毒,之后将幼果放于酒精灯上灼烧进行第二次消毒,直至果实表皮变黑。
[0013]特别的,所述步骤S03中对于在无光环境下未生根的合子胚,将其转入MT+IBA0.5mg/L的培养基中进行诱导生根,生根后转入MT+GA3(赤霉素)lmg/L+3%蔗糖培养基中进行培养获得胚培苗。
[0014]特别的,所述步骤S04中,所述基质为MT+GA3lmg/L+3%蔗糖培养基。
[0015]相较于现有技术,本发明通过将合子胚、珠心胚分离开后,避免了合子胚的败育,采用人工培养基对合子胚进行培养,可在短期内获得大量具有抗溃疡病有性后代植株,具有操作性强、简单实用、效果显著等优点。
【【具体实施方式】】
[0016]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下通过实验对本发明进一步详细说明。
[0017]实验中采用母本:冰糖橙(CitrussinensisOsbeck),父本:枸橼(Citrusmedica),定植于国家柑橘种质资源圃。
[0018]本发明所提供的一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法,具体包括以下步骤:
[0019]S01:杂交授粉:
[0020]1.采集枸橼花瓣未开放的花朵,用镊子摘取掉花瓣,将花药摘下放置于垫有纸张的培养皿上,之后将培养皿放置于温度为22?25°C的环境下,I?2天后花药裂开散粉,将花粉用筛子筛去杂物后,将获得的枸橼花粉装在暗色瓶内,密封后放于冰箱内备用;
[0021]2.将获取的I份父本花粉与5?8份滑石粉混合均匀获得稀释花粉,将获得的稀释花粉装入瓶中,在冰糖橙花药成熟但花朵未开放时,用镊子将花瓣去除,再将花药或将花丝去掉,之后采用一端具有弹性部件的杆状件沾取稀释花粉,在冰糖橙花朵柱头上轻轻一抹,每沾取一次点授3?5多冰糖橙花朵,采用此方法可以使父本花粉送粉到柱头,进一步使坐果准确可靠,果实发育整齐;此次对4500朵花进行人工授粉,采收时,结果424个,采用本发明所提供的授粉方式坐果率为9.42%,一般柑橘坐果率为2.5%?5%,可见采次授粉坐果率较高;
[0022]3.用羊皮纸做成防雨小袋,将授粉后的冰糖橙柱头套袋,之后用回形针封住袋口,授粉8?12天之后去掉防雨小袋,喷保花保果剂。
[0023]S02:提取合子胚:
[0024]1.冰糖橘花朵于授粉90?110天后,采摘100个果实,此时果实种子中的种子没有发育成熟,合子胚尚未败育;
[0025]2.将采收的幼果放在消过毒的工作台上,之后将果实表面用75%酒精进行第一次消毒,然后将幼果放于酒精灯火焰上直至果实表皮变黑,此时消毒完成,然后用消过毒的手术刀沿幼果果实赤道面将果实切开成两半,注意不碰伤种子,此次共取得269粒果实种子;
[0026]3.将获取的果实放于显微镜下,采用消过毒的手术刀将种子剥开部分种皮,之后采用消过毒的镊子和手术刀将每粒种子的合子胚、珠心胚逐一分离开,共获得1644个合子胚。
[0027]S03:合子胚培养、获得胚培苗:整个合子胚培育过程温度保持在26V?28°C、湿度保持在75%?85%。
[0028]将获取的合子胚放入MT+GA3 (赤霉素)lmg/L的培养基后,放入密封的培养器中,在无光条件下培养5?7天,待合子胚生出根后在有光条件下继续培养,25?35天之后将合子胚转入MT+GA3(赤霉素)lmg/L+3%蔗糖的培养基中进行培养获得胚培苗;对于在无光环境下未生根的合子胚,继续培养观察5?7天,生根后在有光条件下继续培养,25?35天之后将合子胚转入MT+GA3(赤霉素)lmg/L+3%蔗糖的培养基中进行培养获得胚培苗;对于仍未生根的合子胚将其将其转入MT+IBA0.5mg/L的培养基中进行诱导生根,生根后转入MT+GA3lmg/L+3%蔗糖的培养基中进行培养获得胚培苗;将就不生根的合子胚转入MT+IBA0.5mg/L培养基中,能较好的促进生根。
[0029]S04:炼苗、移栽:
[0030]待胚培苗长出至少3片真叶后,将密封的培养器打开进行炼苗,使胚培苗生长环境温度、湿度与外界环境一致,7?15天后,清洗掉胚培苗根部残留的培养基,移栽至装有新鲜MT+GA3lmg/L+3%蔗糖培养基的营养钵中。炼苗后移栽至营养钵中的苗为432株,最终存活146棵植株苗。
[0031]在整个培养过程中,需适时对培养基进行观察,并定期更换培养基,避免培养基因时间过久发霉,而引起合子胚或胚培苗因霉菌感染而导致死亡;且整个过程中所使用的器具必须进行高度灭菌处理。
[0032]本发明采用便于观察调控的悬浮培养方式,培养基MT各成分如表I。
[0033]表I培养基MT各成分及含量
[0034]
【权利要求】
1.一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法,其特征在于,包括以下步骤: 501:杂交授粉:提取父本花粉;对母本花朵进行去雄处理后,授以父本花粉;将授粉后的母本花朵进行套袋密封处理,8?12天之后去掉密封袋,喷保花保果剂; 502:提取合子胚:母本花朵进行杂交授粉90?110天后,采收幼果待用;将采收的幼果进行消毒处理后,取出果实种子;之后将拨开果实种子果皮,将果实种子内的合子胚、珠心胚分离开,去掉珠心胚,保留合子胚; 503:合子胚培养、获得胚培苗:将获取的合子胚放入MT+GA3lmg/L培养基后,放入密封的培养器中,在温度为26°C?28°C、湿度为75%?85%的无光条件下培养5?7天,待合子胚生出根后在有光条件下继续培养,25?35天之后将合子胚转入MT+GA3lmg/L+3%蔗糖培养基中进行培养获得胚培苗; 504:炼苗、移栽:待胚培苗长出至少3片真叶后,将密封的培养器打开进行炼苗,7?15天后,清洗掉胚培苗根部残留的培养基,移栽至装有基质的营养钵中。
2.根据权利要求1所述的一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法,其特征在于,所述步骤SOl采用人工点授法,首先将获取的I份父本花粉与5?8份滑石粉混合均匀获得稀释花粉,将获得的稀释花粉装入瓶中,之后采用一端具有弹性部件的杆状件沾取稀释花粉,每沾取一次点授3?5多母本花朵。
3.根据权利要求1所述的一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法,其特征在于,所述步骤S02中对幼果消毒时首先将幼果果实表面用75%酒精进行第一次消毒,之后将幼果放于酒精灯上灼烧进行第二次消毒,直至果实表皮变黑。
4.根据权利要求1所述的一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法,其特征在于,所述步骤S03中对于在无光环境下未生根的合子胚,将其转入MT+IBA0.5mg/L的培养基中进行诱导生根,生根后转入MT+GA3lmg/L+3%蔗糖的培养基中进行培养获得胚培苗。
5.根据权利要求1所述的一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法,其特征在于,所述步骤S04中,所述基质为MT+GA3lmg/L+3%蔗糖培养基。
【文档编号】A01H1/02GK104126499SQ201410349079
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】陈仕贵, 陈扬, 朱丽娜, 张子烨, 崔勇 申请人:湖南农业大学