一种获得红掌单倍体植株的方法
【专利摘要】本发明公开了一种获得红掌单倍体植株的方法，属于花卉苗木的遗传育种【技术领域】。方法包括：（1）培养基的配制；（2）花序的选择、低温预处理与消毒；（3）诱导愈伤组织；（4）增殖培养；（5）分化培养；（6）生根培养；（7）移栽炼苗；（8）染色体鉴定；（9）单倍体扩繁等步骤。本发明红掌花序经5-8℃低温预处理24-72h后，能显著提高其无菌花药的获得率和有效愈伤组织的诱导率，从而能有效获得红掌单倍体植株，且操作方法简便、可以作为育种材料进一步从中选育出红掌新品种，缩短育种年限。
【专利说明】一种获得红掌单倍体植株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及花卉苗木的遗传育种【技术领域】，具体涉及一种获得红掌单倍体植株的 方法。
【背景技术】
[0002] 红掌(A aflt/raea/w?)又名安祖花、花烛等，天南星科花烛属，原产哥伦比亚，是一 种多年生、常绿、四季开花、观花观叶兼可的草本植物，可分为切花和盆栽两大类。由于红掌 的花型奇特、颜色鲜艳多彩、生性耐荫、观赏期长等特点，在国内外的市场消费量很大，在全 球热带花卉贸易中仅次于兰花名列第二。
[0003] 单倍体（Haploid)是指具有配子染色体（η)的个体，一般是利用花药、花粉作外殖 体进行组织培养，从小孢子经愈伤组织或胚状体产生植株，或以孤雌生殖、人工引变等方式 产生具有配子体染色全数的植株(单倍体植株)。在育种上利用单倍体具有克服杂种分离、 缩短育种年限和提高获得纯和材料的效率等优点。单倍体育种在粮食和果蔬作物上已研究 较多，并已育成了一些烟草、水稻、小麦等优良品种，但对单倍体观赏植物的研究还处于起 步阶段。目前红掌育种的主要方法还是以传统的杂交育种为主，存在育种周期长、进程慢、 后代不稳定等问题，在国内还未见有关于红掌花药培养单倍体成功的文献报道。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是，针对红掌传统杂交育种存在周期长、进程慢、后代不稳定等问题， 提出一种能克服杂种分离、缩短育种年限、获得高纯度红掌单倍体育种材料的方法，并进一 步可从中选育出红掌的新品种。
[0005] 本发明目的通过以下技术方案得以实现： 一种获得红掌单倍体植株的方法，该方法按以下步骤进行： (1) 培养基的配制：包括花药培养各阶段的培养基，其中， 1) 诱导培养基：1/2MS 基本培养基添加 0· 5-3mg/L 2, 4-D、0. 5-2mg/L 6-BA、30-70g/L 蔗糖、20g/L葡萄糖、6g/L琼脂粉，pH灭菌前5. 8 ; 2) 增殖培养基：MS基本培养基添加1. Omg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH灭菌前5. 8 ; 3) 分化培养基：MS基本培养基添加1. Omg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH灭菌前5. 8 ; 4) 生根培养基：1/2MS基本培养基添加 lg/L活性炭、20g/L蔗糖，pH灭菌前5. 8 ; (2) 花序的选择、低温预处理与消毒：待红掌佛焰苞花序抽出后，从中选择苞片即将开 展的花序，剪下并除去其苞片，用酒精棉擦洗花序表面后放入培养瓶中，于5-8°C低温条件 下处理24-72h ;再将该花序用自来水冲洗3-5min，加少量洗洁精，轻轻搓洗片刻后，用自来 水冲洗掉洗洁精和表面污染物，再在超净工作台上用75%酒精浸泡30s后，用0. 1%升汞溶 液摇晃消毒l〇_15min，倒掉升汞溶液，用无菌水冲洗5次后，备用； (3) 诱导愈伤组织：将低温预处理、消毒的花序用刀片横切，用解剖针剥出花药后，接种 到诱导培养基中诱导培养4个月，其中的无菌花药将诱导产生愈伤组织，且对污染花药要 及时剔除； (4) 增殖培养：将诱导产生的愈伤组织转接到增殖培养基中，经继代培养至愈伤组织进 入增殖期； (5) 分化培养：将快速增殖期的愈伤组织转接种到分化培养基上，诱导分化成芽； (6) 生根培养：当芽长至2cm时，从愈伤组织上切下并转接到生根培养基上诱导生根， 长成幼苗； (7) 移栽炼苗：当幼苗长至4-5cm时，将该幼苗从培养瓶移栽到大棚穴盘中炼苗； (8) 染色体鉴定：当移栽苗新根长出后，取其白色幼嫩根尖0. 3-0. 5 cm，于室温黑暗条 件下，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉浸渍处理2-3 h;清水洗净后于4°C条件下用95%乙醇： 冰醋酸=3 : 1新鲜配制的卡诺固定液固定18-24 h;弃去固定液后将根尖置于37°C水浴 中，用0. 2mol/L HC1酸解15-20 min后，用蒸馏水冲洗3次；切取该根尖的分生组织放在预 先滴一滴石炭酸品红染料的载玻片上，用镊子压碎根尖，弃去残渣，盖上盖玻片后，吸干多 余的染料，在40X 10倍显微镜下拍照、观察、鉴定； (9) 单倍体扩繁：将确定为单倍体的植株进行组培扩繁。
[0006] 本发明具有以下几方面的有益效果： 1、本发明的红掌花序经5-8°C低温预处理24-72小时后，能有效提高无菌花药的获得 率和有效愈伤组织的诱导率。如品种'阿拉巴马（Alabamb)'的花序经过5-8°C低温预处理 24-72h后，无菌花药的获得率平均为49. 73%，而对照为26. 7%，提高了 86. 25% ;有效愈伤诱 导率平均为24. 24%，而对照为13. 47%，提高了 79. 92% ;单倍体诱导率平均为33. 75%，而对照 为20%，提高了 68. 75% ;对品种'燕尾红（Loattails Red)'来说，效果更加明显，无菌花药的 获得率从对照的7. 14%提高到平均25. 43%，有效愈伤诱导率从对照0提高到平均11. 85%， 单倍体诱导率从对照〇提高到平均30%。（见试验例）. (2) 本发明中的红掌花序5-8°C低温预处理24-72h比现有的报道10°C低温预处理3d (杜宝贵，黄丽娟，张志胜等.红掌花药培养.生物技术通讯，2009年增刊：189-195.)能有 效提高花药膨大率和有效愈伤组织的诱导率。l〇°C低温预处理3d后的花药膨大率最高为 17. 33%，花药有效愈伤诱导率最高为1. 67%，而本发明中的花药膨大率最高为87% ;花药有 效愈伤诱导率最高为29%。（见实施例6、7和2) (3) 本发明能有效得到红掌单倍体，而之前的有关报道表明得到的花药再生植株均是 二倍体，并没有得到红掌单倍体。
【具体实施方式】
[0007] 以下通过实施例对本发明作进一步的具体说明，但本发明的内容并不局限于此。
[0008] 实施例1 :(获得红掌品种'阿拉巴马（Alabamb)'单倍体植株的方法1) 该方法按以下步骤进行： (1)培养基的配制：包括花药培养各阶段的培养基，其中， 1) 诱导培养基：1/2MS基本培养基添加0.5mg/L 2,4-D、0.5mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、 20g/L葡萄糖、6g/L琼脂粉，pH灭菌前5. 8 ; 2) 增殖培养基：MS基本培养基添加1. Omg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH灭菌前5. 8 ; 3) 分化培养基：MS基本培养基添加1. Omg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH灭菌前5. 8 ; 4)生根培养基：1/2MS基本培养基添加 lg/L活性炭、20g/L蔗糖，pH灭菌前5. 8 ; (2) 花序的选择、低温预处理与消毒：以红掌品种'阿拉巴马（Alabamb)'为试材，待佛 焰苞花序抽出后，从中选择苞片即将开展的花序，剪下并除去其苞片，用酒精棉擦洗花序表 面后放入培养瓶中，于5°C低温条件下处理24h ;将该花序用自来水冲洗3-5min后，加少量 洗洁精，轻轻搓洗片刻后，用自来水冲洗掉洗洁精和表面污染物，再在超净工作台上用75% 酒精浸泡30s后，用0. 1%升汞溶液摇晃消毒10-15min ;倒掉升汞溶液，用无菌水冲洗5次 后，备用； (3) 诱导愈伤组织：将低温预处理与消毒后的花序用刀片横切，用解剖针剥出花药后， 按每瓶接种30-50粒花药接种到诱导培养基中，在25-27°C自然散射光下培养，共接种10 瓶；其中的无菌花药将诱导产生愈伤组织，污染花药则需及时剔除，共诱导培养4个月，该 例7d后得到的无菌花药率为42. 00%，15d花药膨大率为76. 14%，40d后有效愈伤诱导率为 20. 00% ； (4) 增殖培养：将诱导产生的愈伤组织转接到增殖培养基中，经继代培养至愈伤组织进 入增殖期； (5) 分化培养：将快速增殖期的愈伤组织接种到分化培养基上，诱导分化成芽； (6) 生根培养：当幼苗芽长至2cm时，将其从愈伤组织上切下并转接至生根培养基上， 4d后开始长根，20d后根长至l-2cm，50d后全部生根； (7) 移栽炼苗：当幼苗长至4-5cm时，将该幼苗从培养瓶移栽到大棚穴盘中炼苗； (8) 染色体鉴定：当移栽苗新根长出后，取其白色幼嫩根尖0.3cm，于室温黑暗条件下， 用0. 002 mol/L 8-羟基喹啉处理3 h ;用清水洗净，于4°C条件下用95%乙醇：冰醋酸=3 :1新鲜配制的卡诺固定液固定18 h;弃去固定液后将根尖置于37°C水浴中，用0. 2mol/ L HC1酸解15 min后并用蒸馏水冲洗3次；切取该根尖的分生组织放在预先滴一滴石炭酸 品红染料的载玻片上，用镊子压碎根尖，弃去残渣，盖上盖玻片，吸干多余的染料，在40 X 10 倍显微镜下拍照、观察、鉴定染色体，其中有35%左右的苗为单倍体； (9) 单倍体扩繁：将确定为单倍体的植株进行组培扩繁后，分化形成的新苗均为单倍 体。
[0009] 实施例2 :(获得红掌品种'阿拉巴马（Alabamb)'单倍体植株的方法2): 本例中，步骤（1)诱导培养基配方添加的2,4-D为1.5mg/L，6-BA为lmg/L，蔗糖为 45g/L ;步骤（2)花序于6°C低温条件下处理36h ;步骤（8)取其白色幼嫩根尖0. 4cm，用 0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2.5 h，用卡诺固定液固定20 h，用0.2mol/L HC1酸解17 min ;其余步骤工艺同于实施例1，结果：步骤（3)得到的无菌花药率为59. 42%，花药膨大率 为75. 50%，有效愈伤诱导率为29. 00%，步骤（8)中单倍体苗比例为40%左右。
[0010] 实施例3 :(获得红掌品种'阿拉巴马（Alabamb)'单倍体植株的方法3): 本例中，步骤（1)诱导培养基配方添加的2, 4-D为2. 5mg/L，6-BA为1. 5mg/L，蔗糖 为55g/L ;步骤（2)花序于7°C低温条件下处理48h ;步骤（8)取其白色幼嫩根尖0. 5cm，用 0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2.5 h，用卡诺固定液固定22 h，用0.2mol/L HC1酸解19 min ;其余步骤工艺同于实施例1，结果：步骤（3)得到的无菌花药率为43. 33%，花药膨大率 为60. 82%，有效愈伤诱导率为19. 21%，步骤（8)中单倍体苗的比例为30%左右。
[0011] 实施例4 :(获得红掌品种'阿拉巴马（Alabamb)'单倍体植株的方法4): 本例中，步骤（1)诱导培养基配方添加的2, 4-D为3mg/L，6-BA为2mg/L，蔗糖为70g/ L ;步骤（2)花序于8°C低温条件下处理72h ;步骤（8)取其白色幼嫩根尖0. 4cm，用0. 002 mol/L 8-羟基喹啉处理2 h，用卡诺固定液固定24 h，用0.2mol/L HC1酸解20 min;其余 步骤工艺同于实施例1，结果：步骤（3)得到的无菌花药率为23. 5%，花药膨大率为83. 78%， 有效愈伤诱导率为23%，步骤（8)中单倍体苗的比例为30%左右。
[0012] 实施例5 :(获得红掌品种'燕尾红（Loattails Red)'单倍体植株的方法5): 本例中，步骤（1)诱导培养基配方添加的2, 4-D为0· 5mg/L，6-BA为0· 5mg/L，蔗糖为 30g/L ;步骤（2)以红掌品种'燕尾红（Loattails Red)'为试材，其花序于5°C低温条件下处 理24h;步骤（8)取其白色幼嫩根尖0.3cm，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理3 h，用卡诺固 定液固定18 h，用0. 2mol/L HC1酸解15 min ;其余步骤工艺同于实施例1，结果：步骤（3) 得到的无菌花药率为24. 5%，花药膨大率为70. 61%，有效愈伤诱导率为5%，步骤（8)中单倍 体苗的比例为30%左右。
[0013] 实施例6 :(获得红掌品种'燕尾红（Loattails Red)'单倍体植株的方法6): 本例中，步骤（1)诱导培养基配方添加的2,4-D为1.5mg/L，6-BA为lmg/L，蔗糖为 45g/L;步骤（2)以红掌品种'燕尾红（Loattails Red)'为试材，其花序于6°C低温条件下 处理36h;步骤（8)取其白色幼嫩根尖(λ 4cm，用(λ 002 mol/L 8-羟基喹啉处理2.5 h，用 卡诺固定液固定20 h，用0. 2mol/L HC1酸解17 min;其余步骤工艺同于实施例1，结果：步 骤（3)得到的无菌花药率为33. 3%，花药膨大率为87. 71%，有效愈伤诱导率为13. 49%，步骤 (8)中单倍体苗的比例为35%左右。
[0014] 实施例7 :(获得红掌品种'燕尾红（Loattails Red)'单倍体植株的方法7): 本例中，步骤（1)诱导培养基配方添加的2, 4-D为2. 5mg/L，6-BA为1. 5mg/L，蔗糖为 55g/L;步骤（2)以红掌品种'燕尾红（Loattails Red)'为试材，其花序于7°C低温条件下 处理48h;步骤（8)取其白色幼嫩根尖0.4cm，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2.5 h，用卡 诺固定液固定22 h，用0. 2mol/L HC1酸解19 min ;其余步骤工艺同于实施例1，结果：步骤 (3)得到的无菌花药率为20. 5%，花药膨大率为87. 8%，有效愈伤诱导率为12%，步骤（8)中 单倍体苗的比例为30%左右。
[0015] 实施例8 :(获得红掌品种'燕尾红（Loattails Red)'单倍体植株的方法8): 本例中，步骤（1)诱导培养基配方添加的2, 4-D为3mg/L，6-BA为2mg/L，蔗糖为70g/ L;步骤（2)以红掌品种'燕尾红（Loattails Red)'为试材，其花序于8°C低温条件下处理 72h;步骤（8)取其白色幼嫩根尖0· 5cm，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2 h，用卡诺固定 液固定24 h，用0. 2mol/L HC1酸解20 min ;其余步骤工艺同于实施例1，结果：步骤（3)得 到的无菌花药率为18. 37%，花药膨大率为86. 19%，有效愈伤诱导率为12. 73%，步骤（8)中单 倍体苗的比例为35%左右。
[0016] 试验例(不同品种不同花序预处理对花药诱导培养的影响试验）： 本试验于2011年在杭州进行，红掌参试品种2个为'阿拉巴马（Alabamb)'和'燕尾红 (Loattails Red)'，花序低温预处理设为 5°C /24h、6°C /36h、7°C /48h、8°C /72h 及不预处 理直接消毒接种(对照)共5个，其余步骤工艺均相同。每个处理接种15瓶，每瓶约接30-50 个花药，一个花序约可接5瓶，接种后在25°C左右自然散射光下培养。在培养过程中：每隔 3-5天观察并记录污染花药数一次；40天后统计膨大的花药个数；4个月后统计成活愈伤组 织块数；8个月后瓶苗移栽；12个月后进行染色体鉴定。并按照下述公式计算无菌花药率、 花药膨大率和有效愈伤诱导率： 无菌花药率=无污染瓶数/接种总瓶数X 100%， 花药膨大率=发生膨大的花药数/无菌花药总数X 100%， 有效愈伤诱导率=愈伤成活数/无菌花药总数X 100%。
[0017] 试验结果表明：5-8°C低温预处理24-72h均能有效提高无菌花药的获得率、有 效愈伤组织的诱导率以及单倍体诱导率(见表1)。品种'阿拉巴马（Alabamb)'的花序经 过5-8°C低温预处理24-72h后，无菌花药的获得率平均为49. 73%，而对照为26. 7%，提高了 86. 25% ;有效愈伤诱导率平均为24. 24%，而对照为13. 47%，提高了 79. 92% ;单倍体诱导率平 均为33. 75%，而对照为20%，提高了 68. 75% ;对品种'燕尾红（Loattails Red)'来说，效果 更加明显，无菌花药的获得率从对照7. 14%提高到平均25. 43%，有效愈伤诱导率从对照0提 高到平均11. 85%，单倍体诱导率从对照0提高到平均30%。
[0018] 表1不同品种不同预处理的花药诱导培养结果
【权利要求】
1. 一种获得红掌单倍体植株的方法，其特征在于按以下步骤进行： (1) 培养基的配制：包括花药培养各阶段的培养基，其中， 1) 诱导培养基：1/2MS 基本培养基添加 0· 5-3mg/L 2, 4-D、0. 5-2mg/L 6-BA、30-70g/L 蔗糖、20g/L葡萄糖、6g/L琼脂粉，pH灭菌前5. 8 ; 2) 增殖培养基：MS基本培养基添加1. Omg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH灭菌前5. 8 ; 3) 分化培养基：MS基本培养基添加1. Omg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH灭菌前5. 8 ; 4) 生根培养基：1/2MS基本培养基添加 lg/L活性炭、20g/L蔗糖，pH灭菌前5. 8 ; (2) 花序的选择、低温预处理与消毒：待红掌佛焰苞花序抽出后，从中选择苞片即将开 展的花序，剪下并除去其苞片，用酒精棉擦洗花序表面后放入培养瓶中，于5-8°C低温条件 下处理24-72h ;再将该花序用自来水冲洗3-5min，加少量洗洁精，轻轻搓洗片刻后，用自来 水冲洗掉洗洁精和表面污染物，再在超净工作台上用75%酒精浸泡30s后，用0. 1%升汞溶 液摇晃消毒l〇_15min，倒掉升汞溶液，用无菌水冲洗5次后，备用； (3) 诱导愈伤组织：将低温预处理、消毒的花序用刀片横切，用解剖针剥出花药后，接种 到诱导培养基中诱导培养4个月，其中的无菌花药将诱导产生愈伤组织，且对污染花药要 及时剔除； (4) 增殖培养：将诱导产生的愈伤组织转接到增殖培养基中，经继代培养至愈伤组织进 入增殖期； (5) 分化培养：将快速增殖期的愈伤组织转接种到分化培养基上，诱导分化成芽； (6) 生根培养：当芽长至2cm时，从愈伤组织上切下并转接到生根培养基上诱导生根， 长成幼苗； (7) 移栽炼苗：当幼苗长至4-5cm时，将该幼苗从培养瓶移栽到大棚穴盘中炼苗； (8) 染色体鉴定：当移栽苗新根长出后，取其白色幼嫩根尖0. 3-0. 5 cm，于室温黑暗条 件下，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉浸渍处理2-3 h;清水洗净后于4°C条件下用95%乙醇： 冰醋酸=3 : 1新鲜配制的卡诺固定液固定18-24 h;弃去固定液后将根尖置于37°C水浴 中，用0. 2mol/L HC1酸解15-20 min后，用蒸馏水冲洗3次；切取该根尖的分生组织放在预 先滴一滴石炭酸品红染料的载玻片上，用镊子压碎根尖，弃去残渣，盖上盖玻片后，吸干多 余的染料，在40X 10倍显微镜下拍照、观察、鉴定； (9) 单倍体扩繁：将确定为单倍体的植株进行组培扩繁。
【文档编号】A01H4/00GK104137777SQ201410363151
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】田丹青, 潘晓韵, 葛亚英, 潘刚敏, 沈晓岚, 刘建新, 金亮 申请人:浙江省萧山棉麻研究所