一种获得连翘属与六道木叶属属间杂种的方法
【专利摘要】本发明公开了一种获得连翘属与六道木叶属属间杂种的方法，具体步骤如下：1)以连翘属的连翘为母本，以六道木叶属的翅果连翘为父本，进行属间人工杂交，收取杂交后的种子；2)种植种子获得杂交后代材料，参照父本和母本进行形态学观察统计，并采用AFLP分子标记进行杂种鉴定，选取连翘属与六道木叶属属间杂种。本发明利用连翘属连翘与六道木叶属翅果连翘进行远缘杂交，实现了连翘属与六道木叶属属间基因交流，获得了属间杂交新种质。在本发明基础上，可丰富连翘属植物的遗传信息，为利用属间杂交进行连翘新品种培育成为可能，同时可进行近缘属亲缘关系研究。
【专利说明】-种获得连翘属与六道木叶属属间杂种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物育种领域，具体涉及一种获得连翘属与六道木叶属属间杂种的方 法。
【背景技术】
[0002] 连翅属（Forsythia)植物均为早春观花落叶灌木，先叶或同叶开放，花黄色，钟 状，花柱二型，蒴果（中国植物志，1992)。
[0003] 19世纪，西方国家从东方引进连翘属植物，进行了广泛的选择育种，培育出一批 品种，由于抗逆性强和早春花朵繁密，这些品种在温带地区获得广泛栽培应用（Rosati et al. ,2007)。德国G0ttin.gen植物园发现自然杂交种金钟连翅（ForsythiaXintermedia)， 成为现代连翘品种的主要亲本，新品种大量出现（Wyman，1961)。连翘常规杂交和自然突变 选择育种工程主要集中于美国、加拿大、波兰和德国等国家。主要目标性状集中在抗寒性 (用卵叶连翘和东北连翘作为育种亲本）、株型和花部性状的改良等方面。
[0004] 作为观赏植物，连翘属植物自身也存在一些不足，如：花期集中于4月到5月，群体 花期仅25天左右；花色单一，仅有黄色系品种；花无香味等。传统的连翘属内杂交育种无 法解决这些问题。六道木叶属翅果连翅（Abeliophyllum distichum)花白色或粉色，淡香 (Suk-Pyo Hong&Mae-Ja Han，2002)，与连翘花色差异明显，与连翘亲缘关系相对较近。采用 翅果连翘与连翘进行属间杂交，有望丰富连翘的花色、花期等性状。同时对探讨连翘与近缘 属远缘杂交亲和性、基因交流机制具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 针对目前连翘属植物花色单一、花期集中的现状，本发明的目的是提供一种获得 连翘属与六道木叶属属间杂种的方法，以改良连翘属植物观赏特性。
[0006] 本发明提供的一种获得连翘属与六道木叶属属间杂种的方法，具体步骤如下：
[0007] 1)选长花柱的连翘属的连翘为母本，选短花柱的六道木叶属的翅果连翘为父本， 进行属间人工杂交，收取杂交后的种子；
[0008] 2)种植种子获得杂交后代材料，参照父本和母本进行形态学观察统计，并采用 AFLP分子标记进行杂种鉴定，选取连翘属与六道木叶属属间杂种。
[0009] 六道木叶属的翅果连翘为异型花柱，选取短花柱的植株作为本发明的母本。同样 连翘属的连翘也为异型花柱，选取长花柱的植株作为本发明的父本。
[0010] 其中，步骤1)所述属间人工杂交，包括如下步骤：
[0011] a采集短花柱的六道木叶属翅果连翘的鲜花粉；
[0012] b将长花柱的连翘属连翘去雄；
[0013] c将步骤a采集的花粉授粉到步骤b连翘属连翘的柱头上并套袋；
[0014] d种子发育成熟后采收。
[0015] 其中，步骤c所述授粉的时间为上午11-12时，每天1次，重复3次。
[0016] 其中，步骤c所述套袋，授粉后套硫酸纸袋，花柱萎蔫后换成网袋。
[0017] 其中，步骤d所述采收，为待种子发育成熟后采摘、阴干。采收到的种子室温干燥 条件保存。
[0018] 其中，步骤2)所述种植种子，具体步骤如下：
[0019] 种子采用l〇〇mg/L赤霉素浸种处理6h后，点播于装有泥炭的穴盘内，覆膜，置于温 室，萌发后获得杂交后代材料。
[0020] 其中，步骤2)所述进行形态学观察统计，为连续3年进行表型观察统计。
[0021] 其中，步骤2)所述进行形态学观察统计，针对茎、叶、枝条、花的表型。
[0022] 其中，步骤2)所述采用AFLP分子标记进行杂种鉴定，所用的引物对为：
[0023] E38/M47
[0024] 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact- 3，（如 SEQ ID No. 1 所不）
[0025] 下游引物 Μ47 :5，-gatgagtcctgagtaacaa- 3'（如 SEQ ID No. 4 所不）
[0026] E38/M55
[0027] 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不）
[0028] 下游引物 Μ55 :5, -gatgagtcctgagtaacga- 3'（如 SEQ ID No. 7 所示）
[0029] E40/M52
[0030] 上游引物 E4〇 :5，-gactgcgtaccaattcagc- 3，（如 SEQ ID No. 2 所不）
[0031] 下游引物 Μ52 :5，-gatgagtcctgagtaaccc- 3，（如 SEQ ID No. 6 所不）
[0032] 和 / 或 E44/M49
[0033] 上游引物 E44 :5，-gactgcgtaccaattcatc-3，（如 SEQ ID No. 3 所不）
[0034] 下游引物 M49 :5' -gatgagtcctgagtaacag- 3'（如 SEQ ID No. 5 所示）。
[0035] 其中，步骤2)所述选取连翘属与六道木叶属属间杂种的标准为：形态学的表型特 征介于父母本之间，并出现父母本不具有的新性状，具有父母本的特有AFLP条带。
[0036] 本发明还提供所述获得连翘属与六道木叶属属间杂种的方法在育种中的应用。
[0037] 本发明还提供用于连翘属与六道木叶属属间杂种AFLP分子标记鉴定的引物对， 其为：
[0038] E38/M47
[0039] 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact- 3，（如 SEQ ID No. 1 所不）
[0040] 下游引物 Μ47 :5，-gatgagtcctgagtaacaa- 3'（如 SEQ ID No. 4 所不）
[0041] E38/M55
[0042] 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不）
[0043] 下游引物 Μ55 :5' -gatgagtcctgagtaacga- 3'（如 SEQ ID No. 7 所示）
[0044] E40/M52
[0045] 上游引物 E4〇 :5，-gactgcgtaccaattcagc- 3，（如 SEQ ID No. 2 所不）
[0046] 下游引物 Μ52 :5，-gatgagtcctgagtaaccc- 3，（如 SEQ ID No. 6 所不）
[0047] 和 / 或 E44/M49
[0048] 上游引物 E44 :5，-gactgcgtaccaattcatc-3，（如 SEQ ID No. 3 所不）
[0049] 下游引物 M49 :5' -gatgagtcctgagtaacag- 3'（如 SEQ ID No. 5 所示）。
[0050] 本发明提供的利用杂交授粉获得连翘与翅果连翘属间杂种的方法，有如下优点和 有益效果：
[0051] (1)本发明利用连翘属连翘与六道木叶属翅果连翘进行远缘杂交，实现了连翘属 与六道木叶属属间基因交流，获得了属间杂交新种质。
[0052] (2)在本发明基础上，可丰富连翘属植物的遗传信息，为利用属间杂交进行连翘新 品种培育成为可能，同时可进行近缘属亲缘关系研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0053] 图1为本发明实施例1连翘（左）、杂种（中）与翅果连翘（右）当年生枝条的对 比照片。
[0054] 图2为本发明实施例1连翘（左）、杂种（中）与翅果连翘（右）叶片的对比照 片。
[0055] 图3为本发明实施例1连翘（左）、杂种（中）与翅果连翘（右）二年生枝条的对 比照片。
[0056] 图4为引物E38/M47在亲本及子代中的分离检测（70-110bp)。
[0057] 图5为引物E38/M55在亲本及子代中的分离检测（80_130bp)。
[0058] 图6为引物E40/M52在亲本及子代中的分离检测（70-120bp)。
[0059] 图7为引物E44/M49在亲本及子代中的分离检测（45-80bp)。
【具体实施方式】
[0060] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0061] 实施例1
[0062] 1、连翘与六道木叶属属间杂交后代材料的获得
[0063] 1. 1材料选择
[0064] 选择连翘属的连翘和近缘属六道木叶属的翅果连翘。
[0065] 1. 2杂交方法及杂种获得
[0066] 2011年春，在国家花卉工程中心小汤山苗圃，以长花柱连翘为母本进行人工去雄 并套袋隔离，采集短花柱翅果连翘的新鲜花粉，于上午11-12时授粉，每天一次，授粉3次； 杂交后待柱头萎蔫后，换成网袋。种子自然成熟后采集，阴干，干燥室温条件下保存。
[0067] 种子用100mg/L赤霉素水溶液浸种处理6h后点播于装有泥炭的穴盘内，覆膜，萌 发后获得属间杂交后代植株。
[0068] 2、连翘与翅果连翘杂种的鉴定
[0069] 表型鉴定：将杂交父母本及杂交后代于7月份露地定植，进行常规养护管理。翌年 春，对父母本及后代进行形态学测定与统计，连续进行3年。
[0070] 结果见图1-3,表明：杂交后代的株型、冠幅、株高、枝条、叶等形态特征介于双 亲之间，具有父母本综合性状。连翘（母本）：连翘生长势强、当年生枝中空，节间长 5. 4cm±0. 01cm、叶片长卵圆形，粗锯齿、多三裂叶，叶片大小6. 05cmX4. 04cm ;翅果连翘 (父本）：生长势弱、当年生枝髓实心，节间长3. 42cm±0. 02cm、叶片阔卵圆形，全缘，无三裂 叶，叶片大小5. 14cmX3. 56cm ;杂交后代：生长势居中、当年生枝中空、老枝具片状髓，当年 生枝节间长3. 46cm±0. 01cm、叶片卵圆形，粗锯齿，多三裂叶，叶片大小5. 36cmX 3. 86cm。
[0071] AFLP分子鉴定：设计了 4对多态性良好的引物对：E38/M47、E38/M55、E40/M52、 E44/M49 (引物序列参见表1，2)，对亲本及子代进行选择性扩增，并对特异性条带进行统计 分析。
[0072] 表1 AFLP分析所用接头和引物序列
[0073]
【权利要求】
1. 一种获得连翘属与六道木叶属属间杂种的方法，其特征在于，具体步骤如下： 1) 选长花柱的连翘属的连翘为母本，选短花柱的六道木叶属的翅果连翘为父本，进行 属间人工杂交，收取杂交后的种子； 2) 种植种子获得杂交后代材料，参照父本和母本进行形态学观察统计，并采用AFLP分 子标记进行杂种鉴定，选取连翘属与六道木叶属属间杂种。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述属间人工杂交，包括如下步骤： a采集短花柱的六道木叶属翅果连翘的鲜花粉； b将长花柱的连翘属连翘去雄； c将步骤a采集的花粉授粉到步骤b连翘属连翘的柱头上并套袋； d种子发育成熟后米收。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c所述授粉的时间为上午11-12时，每 天1次，重复3次。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c所述套袋，授粉后套硫酸纸袋，花柱萎 蔫后换成网袋。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d所述采收，为待种子发育成熟后采摘、 阴干。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述种植种子，具体步骤如下： 种子采用l〇〇mg/L赤霉素浸种处理6h后，点播于装有泥炭的穴盘内，覆膜，置于温室， 萌发后获得杂交后代材料。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤2)所述进行形态学观察统计，针 对茎、叶、枝条、花的表型。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述采用AFLP分子标记进行杂种鉴 定，所用的引物对为： E38/M47 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不） 下游引物M47:5'-gatgagtcctgagtaacaa-3'（如SEQIDNo·4所示） E38/M55 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不） 下游引物 Μ55 :5' -gatgagtcctgagtaacga-3'（如 SEQ ID No. 7 所示） E40/M52 上游引物 E40 :5' -gactgcgtaccaattcagc-3'（如 SEQ ID No. 2 所示） 下游引物 Μ52 :5' -gatgagtcctgagtaaccc-3'（如 SEQ ID No. 6 所示） 和 / 或 E44/M49 上游引物 E44 :5，-gactgcgtaccaattcatc-3，（如 SEQ ID No. 3 所不） 下游引物 M49 :5' -gatgagtcctgagtaacag-3'（如 SEQ ID No. 5 所示）。
9. 权利要求1-8所述获得连翘属与六道木叶属属间杂种的方法在育种中的应用。
10. 用于连翘属与六道木叶属属间杂种AFLP分子标记鉴定的引物对，其为： E38/M47 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不） 下游引物 M47 :5' -gatgagtcctgagtaacaa-3'（如 SEQ ID No. 4 所示） E38/M55 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不） 下游引物 M55 :5' -gatgagtcctgagtaacga-3'（如 SEQ ID No. 7 所示） E40/M52 上游引物 E40 :5' -gactgcgtaccaattcagc-3'（如 SEQ ID No. 2 所示） 下游引物 M52 :5' -gatgagtcctgagtaaccc-3'（如 SEQ ID No. 6 所示） 和 / 或 E44/M49 上游引物 E44 :5' -gactgcgtaccaattcatc-3'（如 SEQ ID No. 3 所不） 下游引物 M49 :5' -gatgagtcctgagtaacag-3'（如 SEQ ID No. 5 所示）。
【文档编号】A01H1/04GK104145807SQ201410366170
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】潘会堂, 申建双, 张启翔, 石超, 程堂仁, 王佳, 孙明 申请人:北京林业大学