一种四倍体矮牵牛的诱变方法
【专利摘要】本发明公开了一种四倍体矮牵牛的诱变方法，该方法为：在二倍体矮牵牛2片子叶完全展开时期，用二甲戊乐灵和秋水仙素的混合药液滴到附着在2子叶之间生长点上，进行变温处理。处理后的植株与对照比较，选择叶片增大，叶片增厚、茎增粗，株高增加，柱头、花药和萼片变大等多个农艺性状发生变化，和解剖学性状如叶背气孔和花粉粒明显变大的植株作为变异植株，最后进行细胞学的鉴定，采集变异植株的幼小花蕾，观察雌蕊柱头体细胞有丝分裂中期分裂相，选择染色体数目2n=28的植株确定为四倍体植株。本发明处理时间短、诱变效率高，鉴定方法对仪器要求低，操作简单易行，具有较好的应用前景。
【专利说明】一种四倍体矮牵牛的诱变方法
【技术领域】
[0001]本发明属于园艺植物育种领域，具体涉及到一种四倍体矮牵牛的诱变方法。
【背景技术】
[0002]植物多倍体是指体细胞中含有三个或三个以上染色体组，因具有巨大性、抗逆性强、结实性低和营养成分高等特点而得到广泛应用，多倍体化不仅能使植株基因活性及酶的差异性增强，而且还增强了植株的生态适应性、对逆境的抗耐性以及提高了光合效率等，对植株的生长量和某些生物产量、营养成分含量和品质有促进作用。研究植物的多倍体具有重要意义，不仅为植物进化提供大量的证据，而且在生产实践上也具有广泛的应用价值，在现代育种中具有广阔前景。
[0003]许多植物都可以通过自然突变产生四倍体，但因其变异率很低，不能满足人们对四倍体品种的需求。所以各国的科学工作者都在不断的探索新的高效诱变四倍体的途径，目前人工诱变主要采取物理诱变法和化学诱变法二种方法。
[0004]人工物理诱变主要是使用X射线、Y射线、紫外线、P射线和中子及Cl重离子为诱变源。吴明珠等早在1983年通过6tlC射线为辐射源获得了甜瓜短蔓多倍体变异株。利用高空环境具有高真空、微重力、高能粒子辐射、超净、无昼夜变化等空间诱变技术，可从中筛选出具有优良特性的变异植株，通过太空搭载诱变已获得一些在生产上大面积的推广的蔬菜品种。空间诱变效果显著，变异类型广泛，可得到各种变异类型，但其诱变效果不稳定、重复性差，难以在育种实践中应用。
[0005]化学方法诱变是目前应用最广泛的方法，主要诱变剂有秋水仙素、吲哚乙酸、萘骈乙烧、完萎脑、苯及其衍生物、有机神制剂、有机萊制剂(富民隆)等。秋水仙素是最常用的化学诱变剂，它与正在有丝分裂的细胞接触后，着丝点连接的姊妹染色体还是能够正常分离，但秋水仙素可抑制微管的聚合过程不能形成纺锤丝，使染色体不能排在赤道板上也不能分向细胞的两极，使细胞不发生分裂不能形成两个子细胞，因而最后就形成了染色体加倍的细胞。通过此方法已成功获得了很多多倍体农作物品种如培养出多倍体苹果、柑橘、葡萄、金丝小枣、西瓜、白菜、黄瓜、番茄、不结球白菜、花椰菜、芹菜、萝卜、金鱼草、百合、香石竹、君子兰等。
[0006]矮牵牛(Petunia hybrida Vilm.)又名碧冬爺为爺科碧冬爺属植物,为一年生草本花卉。矮牵牛花朵硕大，色彩丰富，花型变化颇多，目前矮牵牛在国际上已成为主要的盆花和装饰植物，广泛应用于庭院、露天花坛、广场的美化装饰与绿化，被喻为“世界花坛花卉之王”。我国矮牵牛于20世纪初开始引种栽培，仅在大城市有零星栽培，直到80年代初，开始从美国、荷兰、日本等国引进新品种，作为花坛后起之秀市场对矮牵牛需求越来越大，目前国内广泛种植的优良矮牵牛品种如重瓣“双瀑布”系列、大花“梦幻”系列、多花单瓣“庆典”系列和吊蓝等系列都为二倍体品种，利用多倍体诱变技术获得观赏性更高、抗逆性和适应性强的多倍体品种具有十分良好的应用前景，但对矮牵牛目前尚无多倍体化学诱变的发明报道。
[0007]现有秋水仙素诱导多倍体方法往往存在着幼苗死亡率高，诱导成功率较低(通常都低于10% )，容易形成嵌合体植株。诱变植株倍性细胞学鉴定一般将根尖作为检测对象，检测材料少且根尖切去后对植株生长影响较大，如采用对细胞核内DNA含量进行测定的方法，需要采用流式细胞仪，仪器昂贵、操作程序复杂技术要求高。
【发明内容】
[0008]为了克服现有诱导与鉴定技术的不足，本发明的目的在于提供了一种四倍体矮牵牛的诱变和鉴定方法，采用该方法能提高多倍体的诱变率，倍性鉴定时采用幼小花蕾作为鉴定材料，材料充足对植株生长不会产生影响，对仪器要求不高、操作过程相对简单易行。
[0009]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为:一种四倍体矮牵牛的诱变方法，该方法包括如下步骤:
[0010](I)将矮牵牛种子播种在穴盘中，当幼苗2片子叶完全展开时，将脱脂棉放在2片子叶中间，与生长点紧密接触。2片子叶时期是比较好的时期，早或者晚效果不好，早了多倍体诱导效率低，晚了嵌合体比较多。
[0011](2)将穴盘放置于光照培养箱中，每天早8点和下午3点进行处理，用质量浓度为1%的二甲基亚砜(DMSO)配制的二甲戍乐灵(Pendimethalin)6_60mg/L和秋水仙素质量浓度为0.1% -1%混合药液滴到附着在2子叶之间的脱脂棉上，对子叶展开期的二倍体矮牵牛幼苗进行处理，每天处理2次持续处理3天，采取变温处理，每次处理前3小时光照培养箱温度设定为15°C，处理后温度升高设定为30°C。处理结束继续在光照培养箱中生长5天后，移入温室大棚中。
[0012](3)当诱变植株生长发育进入成株后，与对照初步进行农艺性状如叶片长度与宽度、叶片厚度、茎粗、株高、萼片长度与宽度、柱头和花药大小的比较，接着进行包括叶背气孔和花粉细胞大小比较鉴定，选择多个农艺性状和解剖学性状明显增加的变异植株，并在此基础上进行细胞学鉴定。于晴天早晨8:00-10:00取长度4?7mm的幼蕾，先置于0.002mol.1^8-羟基喹啉水溶液中预处理3小时，蒸馏水冲洗3次后转入卡诺氏固定液固定24小时，蒸馏水冲洗3次在lmol.L-1HCl溶液60°C水浴解离5分钟，蒸馏水冲洗3次用滤纸吸干水，放入45% (体积百分浓度)醋酸溶液配制的1% (质量百分浓度)洋红染色液染色10小时。用镊子将幼蕾移入干净的载玻片上，用刀片切取雌蕊柱头部位，滴1-2滴I %洋红染色液，盖上盖玻片，用滤纸吸去多余洋红染色液。盖玻片上覆盖4-5层滤纸，用铅笔一端垂直敲打10余下，使材料尽量分散压平，最后用大拇指垂直按压，制片在酒精灯烘烤1-2秒。先在低倍镜下寻找有丝分裂中期分裂相视野，然后在10X100倍油镜下进行染色体计数。
[0013]步骤⑵中，所述药液的配制方法为:先配制质量浓度为1%二甲基亚砜溶液，再根据计算结果往里面添加二甲戊乐灵和秋水仙素，其中二甲戊乐灵是质量浓度为33%的乳油，即1000毫升乳油中有330克二甲戊乐灵。
[0014]有益效果:与现有技术相比，本发明所的优点在于:
[0015]1、诱导剂的选择:本发明采用二甲戍乐灵(Pendimethalin)为诱导剂,二甲戍乐灵为二硝基甲苯类除草剂(DNH)，较低浓度下仍与微管蛋白具有高度亲和性能形成复合体，通过干扰纺锤丝形成从而抑制细胞分裂中期的有丝分裂，使染色体加倍，与秋水仙素一起使用可提高诱导率，还可降低秋水仙素使用浓度，减少对幼苗的毒害降低死亡率。使用二甲基亚砜可利于诱变剂渗透发挥诱导作用。
[0016]2、变温处理:处理前设定温度为15°C，可抑制和减缓幼苗生长点有丝分裂活动，处理后提高至30°C加速生长点有丝分裂活动，使更多生长点分生细胞处于有丝分裂期，促使诱变率提高。
[0017]3、本发明中的鉴定方法:多倍体与二倍体植株比较一般具有巨大性，当诱变植株生长发育进入成株后，先进行农艺性状如叶片长度与宽度、叶形指数(叶长/叶宽)、叶片厚度、茎粗、株高、萼片长度与宽度、柱头和花药大小等和解剖学性状如叶背气孔和花粉细胞大小比较，选择多项指标显著增加的变异植株，可减少细胞学鉴定工作量。细胞学倍性鉴定时采用幼小花蕾作为鉴定材料，取样材料充足对植株生长也不会产生影响，体细胞有丝分裂观察对仪器要求不高，一般光学显微镜即可，操作过程相对简单易行。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为叶片比较图；上排为二倍体品种‘梅林’，下排为诱变四倍体；
[0019]图2为株高、茎粗比较图；右为二倍体品种‘梅林’，左为诱变四倍体；
[0020]图3为柱头比较图；左为二倍体品种‘梅林’，右为诱变四倍体；
[0021]图4为萼片比较图；右为二倍体品种‘梅林’，左为诱变四倍体；
[0022]图5为花药比较图；左为二倍体品种‘梅林’，右为诱变四倍体；
[0023]图6为气孔比较(标尺为1um)图；右为二倍体品种‘梅林’，左为诱变四倍体；
[0024]图7为花粉比较(标尺为1um)图；右为二倍体品种‘梅林’，左为诱变四倍体；
[0025]图8为柱头体细胞有丝分裂中期染色体数目比较图；右为二倍体品种‘梅林’2n =14，左为诱变四倍体2n = 28。
【具体实施方式】
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[0026]下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0027]实施例1: 一种四倍体矮牵牛的诱变方法，
[0028]I材料与方法
[0029]1.1材料矮牵牛‘梅林’种子来源于浙江虹越花卉有限公司
[0030]1.2诱变处理
[0031](I)矮牵牛‘梅林’种子播种在穴盘中，穴盘内的基质为草炭土:珍珠岩:田园土按质量比例6:1:1混合，当幼苗2片子叶完全展开时，将脱脂棉放在2片子叶中间，与生长点紧密接触。
[0032](2)将穴盘放置于光照培养箱，光照强度设置为40001x，温度为30°C，每天早8点和下午3点进行处理，用质量浓度为1%的二甲基亚砜(DMSO)配制的二甲戊乐灵(Pendimethalin) 6-60mg/L和秋水仙素质量浓度为0.1% -1 %混合药液滴到附着在2子叶之间的脱脂棉上，确保药液浸润到生长点，每天处理2次持续处理3天。采取变温处理，每次处理前3小时光照培养箱温度设定为15°C，处理后温度升高设定为30°C，并以诱变处理前后恒温30°C和分别单独使用二甲戊乐灵、秋水仙素作为参照。诱变处理结束3小时后去掉脱脂棉，并用喷壶将幼苗冲洗去除残留药液，继续在光照强度设置为40001χ，温度为30°C的光照培养箱中生长5天后，移入温室大棚中。
[0033]上述混合药液的配制方法为:先配制质量浓度为1%二甲基亚砜溶液(二甲基亚砜的液体密度为1.lg/ml),再根据计算结果添加二甲戊乐灵和秋水仙素；其中二甲戊乐灵是在市面买到的二甲戊乐灵，它是质量浓度为33%的乳油，即1000毫升乳油中有330克二甲戊乐灵，可较好溶解于水，秋水仙素要先溶解于乙醇中再加入水溶液。如配制IL混合药液方法是先在水溶液中加入0.909ml 二甲基亚砜，混匀后再加入33%二甲戊乐灵乳油18.2-182ul，再加入秋水仙素1-1Og (先将秋水仙素溶解于10_20ml左右少量乙醇中)，最后用水定容至IL体积，即可。
[0034]1.3多倍体鉴定
[0035]1.3.1农艺性状和解剖学鉴定
[0036]当处理植株生长发育进入成株后，初步进行农艺性状如叶片长度与宽度、叶片厚度、株高、茎粗、萼片、柱头和花药大小的测量，与对照植株进行比较初步。接着进行解剖学鉴定包括叶背气孔和花粉细胞大小比较，观察气孔方法为:用尖头镊子将叶片背面表皮撕下，放置于载玻片上，滴一滴清水在40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜观察叶背保卫细胞长与宽。观察花粉细胞方法为:从开放花朵中取少量成熟花粉，放置于载玻片上，滴一滴质量浓度为I %醋酸洋红溶液染色，5分钟后在40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜测量花粉细胞大小。
[0037]1.3.2细胞学鉴定
[0038]选取多项农艺性状和解剖学性状显著大于对照的诱变植株，在初步鉴定基础上继续进行细胞学鉴定，步骤为于晴天早晨8:00-10:00取长度4?7mm的幼蕾，先置于
0.002mol.1^8-羟基喹啉水溶液中预处理3小时，蒸馏水冲洗3次后转入卡诺氏固定液固定24小时，蒸馏水冲洗3次在lmol.L-1HCl溶液60°C水浴解离5分钟，蒸馏水冲洗3次用滤纸吸干水，放入45% (体积百分浓度)醋酸溶液配制的1% (质量浓度)洋红染色液染色10小时。用镊子将幼蕾移入干净的载玻片上，用刀片切取雌蕊柱头部位，滴1-2滴I %洋红染色液，盖上盖玻片，用滤纸吸去多余洋红染色液。盖玻片上覆盖4-5层滤纸，用铅笔一端垂直敲打10余下，使材料尽量分散压平，最后用大拇指垂直按压，制片在酒精灯烘烤1-2秒。先在低倍镜下寻找有丝分裂中期分裂相视野，然后在10X 100倍油镜下进行染色体计数。
[0039]其中，所述体积百分浓度45%醋酸溶液配制的1% (质量浓度)洋红染色液配制方法为:先加入45ml乙酸再加水55ml，混匀后将洋红粉末I克缓慢倒入100ml45%醋酸溶液中，边煮边搅拌，煮沸冷却后过滤即可使用。
[0040]2.结果与分析
[0041]2.1多倍体与二倍体农艺性状和解剖学比较
[0042]诱变后形成多倍体植株叶片比对照二倍体植株相同节位的叶片明显变大,其中多倍体第4-10片真叶平均长度、宽度分别为5.63厘米、4.97厘米，对照二倍体相应值为4.6厘米、3.05厘米，分别增加了 22.4^^63% (图1)。多倍体植株成熟叶片平均厚度为1.4毫米，相比对照二倍体植株成熟叶片平均厚度为0.95毫米增加47.4%。多倍体植株平均株高为19.5厘米，茎粗0.93厘米，对照二倍体植株株高12.0厘米，茎粗0.43厘米，株高和茎粗分别增加62.5%、116.3% (图2)。多倍体植株柱头平均直径为2.97毫米，比对照二倍体植株柱头直径2.34毫米增加26.9% (图3)。多倍体植株萼片平均长度、宽度分别为1.47厘米、0.41厘米，比对照二倍体植株萼片平均长度、宽度分别为1.32厘米、0.36厘米分别增加11.4%,13.9% (图4)。多倍体植株花药平均长度、宽度分别为3.32毫米、2.48毫米，比对照二倍体植株花药平均长度、宽度分别为2.12毫米、1.82毫米花药分别增加56.6%、36.3% (图 5)。
[0043]多倍体植株气孔平均长度、宽度分别为47.5um、32.5um，比对照二倍体植株气孔平均长度、宽度分别为35um、27.5um，分别增加35.7%U8.2% (图6)。多倍体植株的花粉形态特征多为圆形或近似四边形，直径3 40um，有4个萌发孔，外形皱缩畸形、染色浅或不染色不育花粉比率在38.3% -69.1%之间；对照二倍体的η花粉形态特征一般为圆形或者近似三角形，直径=35um，有3个萌发孔，不育花粉比率较低彡7.9% (图7)。
[0044]2.2细胞学比较
[0045]二倍体雌蕊柱头体细胞有丝分裂中期染色体数目2n = 14 (图8右)，多倍体植株雌蕊柱头体细胞有丝分裂中期染色体数目2n = 28(图8左)，表明为四倍体。
[0046]2.3不同药剂和温度处理诱导效果的比较
[0047]表I不同药剂配方和温度处理诱变效果的比较
[0048]
【权利要求】
1.一种四倍体矮牵牛的诱变方法其特征在于，该方法包括如下步骤: (1)将矮牵牛种子播种在穴盘中，当幼苗2片子叶完全展开时，用吸附液体效果较好的介质放在2片子叶中间，与生长点紧密接触； (2)将穴盘放置于光照培养箱中，每天早8点和下午3点进行变温处理，处理方法为:用质量浓度为1%的二甲基亚砜配制的二甲戊乐灵6-60mg/L和质量浓度为0.1%_1%的秋水仙素混合后得到的药液滴到附着在2片子叶之间的介质上，对子叶展开期的二倍体矮牵牛幼苗进行诱导处理，每天处理2次持续处理3天； (3)将处理结束的幼苗继续在光照培养箱中生长5天后，移入温室大棚中； (4)当诱变植株生长发育进入成株后，初步进行农艺性状、解剖学鉴定，在此基础上进行细胞学鉴定，选择染色体数目2n=28的植株确定为四倍体植株。
2.根据权利要求1所述的四倍体矮牵牛的诱变方法，其特征在于，步骤(2)中，光照培养箱中，光照强度设定为40001x。
3.根据权利要求1所述的四倍体矮牵牛的诱变方法，其特征在于，步骤(2)中，所述变温处理的方法为:每次处理前3小时光照培养箱温度设定为15°C，处理后温度设定为30°C。
4.根据权利要求1所述的四倍体矮牵牛的诱变方法，其特征在于，步骤(2)中，所述药液的配制方法为:先配制质量浓度为1% 二甲基亚砜溶液，再根据计算结果往里面添加二甲戊乐灵和秋水仙素，其中二甲戊乐灵是质量浓度为33%的乳油。
5.根据权利要求1所述的四倍体矮牵牛的诱变方法，其特征在于，步骤(4)中观测的农艺性状有:叶片长度与宽度、叶片厚度、茎粗、株高、萼片长度与宽度、柱头和花药大小。
6.根据权利要求1所述的四倍体矮牵牛的诱变方法，其特征在于，步骤(4)中解剖学观察性状有叶背气孔和花粉细胞的大小，观察气孔方法为:用尖头镊子将叶片背面表皮撕下，放置于载玻片上，滴一滴清水在40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜测量气孔长与宽；观察花粉细胞方法为:从开放花朵中取少量成熟花粉，放置于载玻片上，滴一滴质量浓度为1%醋酸洋红染色，5分钟后在40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜测量花粉细胞大小。
7.根据权利要求1所述的四倍体矮牵牛的诱变方法，其特征在于，步骤(4)中细胞学鉴定方法为:于晴天早晨8:00-10:00取长度Γ7πιπι的幼蕾，先置于0.00211101.171 8-羟基喹啉水溶液中预处理3小时，蒸馏水冲洗3次后转入卡诺氏固定液固定24小时，蒸馏水冲洗3次在I mol.L^1HCl溶液60°C水浴解离5分钟，蒸馏水冲洗3次用滤纸吸干水，放入45% (体积百分浓度)醋酸溶液配制的1% (质量浓度)洋红染色液染色10小时；用镊子将幼蕾移入干净的载玻片上，用刀片切取雌蕊柱头部位，滴1-2滴1%洋红染色液，盖上盖玻片，用滤纸吸去多余洋红染色液；盖玻片上覆盖4-5层滤纸，用铅笔一端垂直敲打10余下，使材料尽量分散压平，最后用大拇指垂直按压，制片在酒精灯烘烤1-2秒；先在低倍镜下寻找有丝分裂中期分裂相视野，然后在1X 100倍油镜下进行染色体计数。
8.根据权利要求7所述的四倍体矮牵牛的诱变方法，其特征在于，所述卡诺氏固定液是由无水乙醇和冰醋酸按体积比3:1制成的。
9.根据权利要求7所述的四倍体矮牵牛的诱变方法，其特征在于，所述体积百分浓度45%醋酸溶液配制的1%(质量浓度)洋红染色液配制方法为:先加入45ml乙酸再加水55ml，混匀后将洋红粉末I克缓慢倒入10ml 45%醋酸溶液中，边煮边搅拌，煮沸冷却后过滤即可
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【文档编号】A01H1/08GK104160953SQ201410387594
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月7日 优先权日:2014年8月7日
【发明者】魏跃, 嵇怡, 樊开青, 刘艳, 张莹, 史红林, 陈啸寅, 颜志明, 王全智, 贾思振, 董慧 申请人:江苏农林职业技术学院