一种基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在于：该百合脱毒方法的步骤如下：1）将无病虫害的百合鳞片通过组培特异性诱导产生胚性愈伤组织；2）将胚性愈伤组织诱导成苗并进行热处理；3）剥离茎尖并对其进行特异性诱导产生胚性愈伤组织；4）再次将胚性愈伤组织诱导成苗并扩繁；5）对步骤4）中的组培苗进行病毒检测，检测合格即为百合脱毒种苗。本发明的百合脱毒方法通过两次胚性愈伤诱导解决了所需脱毒材料多、脱毒苗抗性差及脱毒不彻底的问题，能有效克服百合种植次数较多造成的种性退化问题，具有脱毒效率高、方法操作简单、生产设备要求低的特点，能够满足规模化生产的需要。
【专利说明】一种基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及种植前测试或处理种子的【技术领域】，尤其涉及一种百合种苗脱毒的方 法；具体地说是一种基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法。
【背景技术】
[0002] 随着世界百合生产和种球贸易的扩大，百合的病虫害得到迅速传播，严重影响了 百合的产量和质量，其中，病毒病是近来发生较严重的世界性主要病害之一。随着我国百合 进口、引种数量和种植面积的迅速增加，以及不规范的种植和种球自繁，病毒病开始在我 国各百合种植区发生流行，一般发病率在40%-50%，二代种球的带毒率在90%以上。不仅严 重地影响了百合的产量和质量，甚至成为加速我国百合栽培的种群衰退的重要因素。
[0003] 目前关于百合脱毒技术的研究主要集中在剥茎尖、热处理和化学处理等技术的综 合应用，这些方法虽然能有效脱除百合病毒，但存在所需脱毒材料较多、污染率高、技术难 度操作较大、脱毒种源种性退化严重而造成脱毒苗抗性差等问题，难以满足规模化生产的 要求。例如，专利号为CN201110405600. 2的中国专利"百合种球脱毒方法"，它将百合鳞茎 经过35-40°C高温预处理，然后经过高低温（38/25°C)处理、接着经过消毒剥取茎尖(大小 0. 8-1. 2mm)接种于含有病毒唑浓度为（5-6mg/L)的培养基获得无毒百合鳞茎。该脱毒方法 存在的问题是：脱毒材料需求量大，茎尖消毒易污染、剥离茎尖易褐化，形成的脱毒鳞茎种 性退化严重，抗性较差，虽然能够脱除一部分病毒，但在扩繁及栽培过程中植株长势差，易 二次感染病毒，难以应用于实际生产。此外，专利号为CN201210050972. 2的中国专利"东方 百合种球脱毒方法"，虽然也经历了热处理、剥取茎尖、化学脱毒等方法，但却没有经过愈伤 脱毒以及组培苗剥茎尖，易造成种性严重退化，而且该方法中茎尖剥离不易操作，故难以形 成规模化生产的脱毒种苗。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有百合脱毒技术存在的不足，提供一种可持续化、易操作 且能够规模化生产的基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，该方法能有效提高种苗抗 性，具有茎尖剥取容易、脱毒率高、可大量扩繁等优势。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案解决的： 一种基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在于：该百合脱毒方法的步骤如 下： 1) 将无病虫害的百合鳞片通过组培特异性诱导产生胚性愈伤组织； 2) 将胚性愈伤组织诱导成苗并进行热处理； 3) 剥离茎尖并对其进行特异性诱导产生胚性愈伤组织； 4) 再次将胚性愈伤组织诱导成苗并扩繁； 5) 对步骤4)中的组培苗进行病毒检测，检测合格即为百合脱毒种苗。
[0006] -种基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，该百合脱毒方法的详细步骤如下： 1) 将无病虫害的百合鳞片通过组培特异性诱导产生胚性愈伤组织： 选取完好且无病斑的百合鳞片，用清水冲洗干净后，接着用中性肥皂水浸泡15-20min， 再用流水冲洗〇. 5-2小时；用75%的酒精浸泡30-40s后放入0. l%-0. 2%的升汞中10-15分 钟，再用无菌水冲洗4-6次，然后把鳞片切成0. 5-1. Ocm2的方块放入诱导胚性愈伤的培养 基内进行暗培养，20-35天后转接1次，再继续培养20-35天后形成胚性愈伤组织； 2) 将胚性愈伤组织诱导成苗并进行热处理： 把诱导成功的胚性愈伤组织从外部转接到诱导不定芽培养基上，光照条件下培养 25-35天至小芽长至0. 5cm以上，然后把诱导成芽的组培瓶移到光照培养箱内暗培养15-20 天，光照培养箱内的温度控制在25°C -38°C进行变温热处理； 3) 剥离茎尖并对其进行特异性诱导产生胚性愈伤组织： 把上述经过热处理的百合小苗，剥取0. 5-0. 8cm大小的茎尖生长点接种到茎尖诱导愈 伤培养基上，在25-30°C条件下暗培养2-3个月，使其诱导出胚性愈伤组织，在培养期间每 隔一定时间转接一次； 4) 再次将胚性愈伤组织诱导成苗并扩繁： 把愈伤组织转接到诱导成芽的培养基上，暗培养1-2个月后继代扩繁一次，3-4个月后 即可得到直径〇. 3-1. 5cm的百合小鳞茎； 5) 随机抽取步骤4)中的百合小鳞茎，进行病毒检测： 对步骤4)中完成脱毒处理的百合小鳞茎随机抽取10%-20%，进行RT-PCR反转录病毒检 测，经检测确认不带百合无证病毒、黄瓜花叶病和百合斑驳病毒，即为百合脱毒种苗。
[0007] 步骤1)中用于诱导百合鳞片产生胚性愈伤组织的培养基为：MS+2mg/L6-BA+lmg/ L2,4-D+6%蔗糖+6. 5g/L琼脂，该培养基的pH=5. 8。
[0008] 步骤2 )中将胚性愈伤组织诱导成苗的培养基为：1/2MS+6%糖+0. 7mg/ L6-BA+0. 2NAA。
[0009] 步骤2)中将胚性愈伤组织诱导成苗的培养基的光照条件为：光照强度为 1300-2000Lx，每天的光/暗周期设定为光周期时间大于暗周期时间。
[0010] 步骤2)中将胚性愈伤组织诱导成苗的培养基的光照条件为：光照强度为1500LX， 光/暗时间周期为14-16h/10-8h。
[0011] 步骤2)中的热处理时的温度控制在33°C -38°c高温处理8h-12h、然后25°C -28°c 低温处理16h_12h交替进行。
[0012] 步骤3)中用于诱导茎尖产生胚性愈伤组织的培养基为：MS+2. 5mg/L Picloram +0. 5mg/L NAA+6% 蔗糖 +6. 5g/L 琼脂，该培养基的 pH=5. 8。
[0013] 步骤3)中的转接间隔时间为15-20天。
[0014] 步骤4)中将胚性愈伤组织诱导成苗的培养基为：1/2MS+6%糖+0. 7mg/ L6-BA+0. 2NAA。
[0015] 本发明所述的一种基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，是发明人经过仔细研 究、大量实验验证后获得的优选结果，相比现有技术，本发明的创新点为： 本发明通过采用综合脱毒技术，即两次愈伤组织诱导、热处理、茎尖脱毒相结合的方 法，有效的克服了脱毒材料较多、剥茎尖外植体易污染、种性退化等生产过程中的瓶颈，有 效的获得抗性较强的无毒组培苗。
[0016] 本发明采用鳞片胚性愈伤诱导可有效的去除鳞片所携带的部分病毒；采用胚性愈 伤诱导成组培苗，既避免了百合剥离茎尖过程中的消毒过程，又减少了百合剥离茎尖的材 料；另外采用变温热处理技术可以较好地脱除部分病毒，且热处理后剥取〇. 5-0. 8cm的茎 尖生长点进行培养，此操作简单，污染率地，脱毒效果较好。
[0017] 本发明的百合脱毒方法采用茎尖诱导成胚性愈伤，即提高了百合的种性，又进一 步脱除了百合病毒，该方法流程简单、容易操作，故易于形成规模化生产的脱毒种苗，适宜 推广使用。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0019] 一种基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，该百合脱毒方法的详细步骤如下： 1)将无病虫害的百合鳞片通过组培特异性诱导产生胚性愈伤组织：选取完好且无病斑的百 合鳞片，用清水冲洗干净后，接着用中性肥皂水浸泡15-20min，再用流水冲洗0. 5-2小时； 用75%的酒精浸泡30-40s后放入0. 1%-0. 2%的升汞中10-15分钟，再用无菌水冲洗4-6次， 然后把鳞片切成〇. 5-1. Ocm2的方块放入诱导胚性愈伤的培养基内进行暗培养，20-35天后 转接1次，再继续培养20-35天后形成胚性愈伤组织，用于诱导百合鳞片产生胚性愈伤组 织的培养基为：MS+2mg/L6-BA+lmg/L2,4-D+6%蔗糖+6. 5g/L琼脂，该培养基的pH=5. 8 ;2) 将胚性愈伤组织诱导成苗并进行热处理：把诱导成功的胚性愈伤组织从外部转接到诱导不 定芽培养基上，该胚性愈伤组织诱导成苗的培养基为：l/2MS+6%糖+0. 7mg/L6-BA+0. 2NAA， 光照强度为1300-2000Lx的光照条件下培养25-35天至小芽长至0. 5cm以上，每天的光 /暗周期设定为光周期时间大于暗周期时间，优选方案为光照强度1500Lx，光/暗时间周 期为14-16h/10-8h，然后把诱导成芽的组培瓶移到光照培养箱内暗培养15-20天，光照 培养箱内的温度控制在25°C -38°C进行变温热处理，具体来说，热处理时的温度控制在 33°C -38°C高温处理8h-12h、然后25°C -28°C低温处理16h-12h交替进行；3)剥离茎尖并 对其进行特异性诱导产生胚性愈伤组织：把上述经过热处理的百合小苗，剥取〇. 5-0. 8cm 大小的茎尖生长点接种到茎尖诱导愈伤培养基上，用于诱导茎尖产生胚性愈伤组织的培养 基为：MS+2. 5mg/L Picloram +0. 5mg/L NAA+6% 蔗糖 +6. 5g/L 琼脂，该培养基的 pH=5. 8,在 25-30°C条件下暗培养2-3个月，使其诱导出胚性愈伤组织，在培养期间每隔一定时间转接 一次，转接间隔时间优选为15-20天；4)再次将胚性愈伤组织诱导成苗并扩繁：把愈伤组织 转接到诱导成芽的培养基上，将胚性愈伤组织诱导成苗的培养基为：l/2MS+6%糖+0. 7mg/ L6-BA+0. 2NAA，暗培养1-2个月后继代扩繁一次，3-4个月后即可得到直径0. 3-2cm的百合 小鳞茎；5)随机抽取步骤4)中的百合小鳞茎，进行病毒检测：对步骤4)中完成脱毒处理的 百合小鳞茎随机抽取10%_20%，进行RT-PCR反转录病毒检测，经检测确认不带百合无证病 毒、黄瓜花叶病和百合斑驳病毒，即为百合脱毒种苗。胚性愈伤组织是一种能够产生胚状体 的愈伤组织，它质地较坚实，颜色有乳白色或黄色，表面具有球形颗粒，分裂活性强，可分化 形成新的植株。组培特异性诱导仅是为了说明本发明的百合脱毒方法中采用两次组培诱导 胚性愈伤，而不包含其它含义。
[0020] 本发明中采用的培养基中MS所含成分如下表所示。
【权利要求】
1. 一种基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在于：该百合脱毒方法的步骤 如下： 1) 将无病虫害的百合鳞片通过组培特异性诱导产生胚性愈伤组织； 2) 将胚性愈伤组织诱导成苗并进行热处理； 3) 剥离茎尖并对其进行特异性诱导产生胚性愈伤组织； 4) 再次将胚性愈伤组织诱导成苗并扩繁； 5) 对步骤4)中的组培苗进行病毒检测，检测合格即为百合脱毒种苗。
2. 根据权利要求1所述的基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在于：该百 合脱毒方法的详细步骤如下： 1) 将无病虫害的百合鳞片通过组培特异性诱导产生胚性愈伤组织： 选取完好且无病斑的百合鳞片，用清水冲洗干净后，接着用中性肥皂水浸泡15_20min， 再用流水冲洗〇. 5-2小时；用75%的酒精浸泡30-40s后放入0. l%-0. 2%的升汞中10-15分 钟，再用无菌水冲洗4-6次，然后把鳞片切成0. 5-1. Ocm2的方块放入诱导胚性愈伤的培养 基内进行暗培养，20-35天后转接1次，再继续培养20-35天后形成胚性愈伤组织； 2) 将胚性愈伤组织诱导成苗并进行热处理： 把诱导成功的胚性愈伤组织从外部转接到诱导不定芽培养基上，光照条件下培养 25-35天至小芽长至0. 5cm以上，然后把诱导成芽的组培瓶移到光照培养箱内暗培养15-20 天，光照培养箱内的温度控制在25°C -38°C进行变温热处理； 3) 剥离茎尖并对其进行特异性诱导产生胚性愈伤组织： 把上述经过热处理的百合小苗，剥取0. 5-0. 8cm大小的茎尖生长点接种到茎尖诱导愈 伤培养基上，在25-30°C条件下暗培养2-3个月，使其诱导出胚性愈伤组织，在培养期间每 隔一定时间转接一次； 4) 再次将胚性愈伤组织诱导成苗并扩繁： 把愈伤组织转接到诱导成芽的培养基上，暗培养1-2个月后继代扩繁一次，3-4个月后 即可得到直径〇. 3-1. 5cm的百合小鳞茎； 5) 随机抽取步骤4)中的百合小鳞茎，进行病毒检测： 对步骤4)中完成脱毒处理的百合小鳞茎随机抽取10%-20%，进行RT-PCR反转录病毒检 测，经检测确认不带百合无证病毒、黄瓜花叶病和百合斑驳病毒，即为百合脱毒种苗。
3. 根据权利要求1或2所述的基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在 于：步骤1)中用于诱导百合鳞片产生胚性愈伤组织的培养基为：MS+2mg/L6-BA+lmg/L2， 4-D+6%蔗糖+6. 5g/L琼脂，该培养基的pH=5. 8。
4. 根据权利要求1或2所述的基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在于： 步骤2)中将胚性愈伤组织诱导成苗的培养基为：l/2MS+6%糖+0. 7mg/L6-BA+0. 2NAA。
5. 根据权利要求1或2所述的基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在于： 步骤2)中将胚性愈伤组织诱导成苗的培养基的光照条件为：光照强度为1300-2000LX，每 天的光/暗周期设定为光周期时间大于暗周期时间。
6. 根据权利要求5所述的于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在于：步骤2) 中将胚性愈伤组织诱导成苗的培养基的光照条件为：光照强度为1500LX，光/暗时间周期 为 14-16h/10-8h。
7. 根据权利要求1或2所述的基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在于： 步骤2)中的热处理时的温度控制在33°C -38°C高温处理8h-12h、然后25°C -28°C低温处理 16h_12h交替进行。
8. 根据权利要求1或2所述的基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在于： 步骤3)中用于诱导茎尖产生胚性愈伤组织的培养基为：MS+2.5mg/L Picloram +0.5mg/L NAA+6%蔗糖+6. 5g/L琼脂，该培养基的pH=5. 8。
9. 根据权利要求2所述的基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在于：步骤 3)中的转接间隔时间为15-20天。
10. 根据权利要求1或2所述的基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在于： 步骤4)中将胚性愈伤组织诱导成苗的培养基为：l/2MS+6%糖+0. 7mg/L6-BA+0. 2NAA。
【文档编号】A01H4/00GK104303997SQ201410420844
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年8月25日 优先权日:2014年8月25日
【发明者】孙明伟, 赵统利, 邵小斌, 朱朋波, 汤雪燕, 刘兴满, 明军, 陈翠竹 申请人:连云港市农业科学院