一种异源六倍体花生的创制及鉴定方法
【专利摘要】本发明公开一种花生（ Arachis hypogaea L.）远缘杂交育种方法，具体是一种异源六倍体花生的创制及鉴定方法。首先以栽培种（异源四倍体）为母本，与野生种（二倍体）为父本的种间杂种F1（三倍体）组培植株为材料，利用组织培养的方法进行染色体加倍，培育出异源六倍体花生植株S0，并获得其种子S1。其次利用共显性分子标记和基因组原位杂交技术从S1中创制和鉴定出染色体为60条的异源六倍体花生。通过以上方法的实施，不仅为花生远缘杂交技术利用提供了有效的染色体加倍方法，而且获得了两个异源六倍体花生材料E-4和L-21，为育种利用 A.macedoi 和 A.oteroi 的特异基因奠定了材料基础。
【专利说明】一种异源六倍体花生的创制及鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种花生远缘杂交育种方法，具体是一种异源六倍体花生的创制及鉴 定方法。
【背景技术】
[0002] 花生属包括大约80个种，多数为一年生或多年生二倍体物种。基于形态学、杂交 亲和性等将花生属划分为9个区组，12个染色体组。这些野生物种由于经受各种环境的胁 迫和选择，具有许多优异基因，而花生栽培品种(AracAi1S L )为异源四倍体，且 多数品种在长期的人工驯化与栽培下已逐渐失去或不具备这些优异基因。虽然我国引进 保存了大量的野生花生资源，但由于野生花生与栽培种花生存在不同程度的杂交不亲和障 碍，限制了野生花生资源的利用。
[0003] 随着花生远缘杂交技术研究的深入，部分花生野生种与栽培种花生杂交已成功获 得种间杂种F 1，然而花生野生种与栽培种花生种间杂种F1多为三倍体，高度不育，不能被利 用。此外，小麦等作物远缘杂交育种利用实践表明，育成的种间杂交品种多是含有祖先物种 或外源遗传资源的外源染色体小片段易位或外源等位基因渐渗。如何将花生野生种有利基 因转移至栽培品种，增加栽培种资源的遗传多样性，对创制优良新种质和培育新品种具有 重要意义。
[0004] 对花生野生种与栽培种种间杂种F1三倍体利用通常有两种途径：（1)三倍体途 径，三倍体杂种Fl在合适的自然条件下可以不经人工处理而结实或者直接与栽培亲本杂 交后再自交获得育种可利用的异染色体系，这种途径因多数组合自然条件下不能结实或者 获得有用材料概率低，应用较少。（2)六倍体途径，将三倍体（3x)杂种Fl经秋水仙碱处理 获得六倍体植株，然后自交或与栽培亲本杂交后再自交获得育种可利用的异染色体系，这 种途径既可以有目的的获得有用的异染色体系，又可以获得完整有用研究材料，如整套外 源染色体添加系、代换系等。为开发和利用花生野生种质资源， 申请人:多年从事花生野生资 源及其远缘杂交技术的研究，建立了一套有效的染色体加倍方法，获得了异源六倍体花生。
[0005] 此外，基因组原位杂交技术和分子标记技术为种间杂种鉴定及异源六倍体花生的 获得提供了技术基础。基因组原位杂交是以全基因组DNA作探针的原位杂交，在远缘杂交 育种中，以外源物种全基因组为探针，它可以用来检测外源染色体或染色体片段是否包含 在被检测物种染色质中。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标 记，是DNA水平遗传多态性的直接反映，可以有效地鉴定外源染色添加或渗入。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题：克服【背景技术】中的缺陷，提供一种异源六倍体花生的 创制方法，利用组织培养方法创制了异源六倍体花生；并利用有效的鉴定技术，鉴定了异源 六倍体花生，为转移和利用花生野生种的优良基因提供了技术保障。
[0007] 本发明的技术方案： 一种异源六倍体花生的创制方法，以四倍体栽培品种豫花9331为母本，以二倍体野生 种A oteroi为父本进行杂交，经胚珠和幼胚离体培养得到三倍体F1，以该三倍体组培苗为 材料，在组织培养的条件下进行染色体加倍，获得异源六倍体花生，具体方法如下： (1 )在F1三倍体的组培苗从顶端数第三片叶下切开，取顶芽部分，将其置于固体培养基 中，在25°C恒温光照培养间诱导芽分化14-16天，得到培养苗； (2) 将培养苗转移到由MS、0. 8 mg/L NAA和3%蔗糖为组分的固体生根培养基中，培养 15-30天，直至形成完整植株Stl ; (3) 将完整植株Stl于移栽到实验田中；继续培养观察发现部分侧枝开花后产生了果针， 统计有果针侧枝与无果针侧枝的花粉育性，结果显示有果针侧枝的花粉育性明显高于无果 针侧枝；取花粉育性高的有果针侧枝的部分枝条，用MS基本培养基和0.8 mg/L NAA形成的 液体培养基进行生根培养，然后对根尖进行细胞学观察及染色体计数，结果显示枝条体细 胞染色体为60条；当年收获荚果； (4) 将所得的荚果用5%的次氯酸钠进行消毒处理，取其种子，将种子接种到由1/2 MS 和5%鹿糖组成的固体培养基中，置于25°C恒温光照培养间培养，直至发育成幼苗S1 ;所述 1/2 MS培养基中的元素含量为MS的一半。
[0008] 其中步骤（1)中的固体培养基的组分为MS、0. I mg/L的NAA、0. 4 mg/L的6-BA、 3%的蔗糖和0. 05%的秋水仙素。
[0009] 将所述母本替换为白沙1016,父本替换为A 其他步骤不变。
[0010] 一种异源六倍体花生的鉴定方法，将获得的幼苗S1进行基因组荧光原位杂交和分 子标记分析，具体步骤如下： a、 分别提取母本豫花9331、父本野生种A oteroi和S1植株的基因组DNA ; b、 取幼苗S1的根尖，进行有丝分裂中期制片，然后以A oteroi全基因组的DNA为探 针，对S1进行基因组荧光原位杂交，杂交完成后用DAPI染液滴至玻片上染色3-4 min，再在 荧光显微镜下照相，获得杂交图片，统计染色体数，获得染色体为60条的异源六倍体花生 E_4 ； C、进一步用豫花9331、A O teroi的共显性分子标记E420验证所得的异源六倍体花生 的准确性，用E420对豫花9331、A oteroi和E-4的DNA扩增条带结果显示，E-4同时包含 了豫花9331和A oteroi的遗传物质。
[0011] 所述分子标记E420包括SSR上游引物序列和下游引物序列， SSR 引物上游序列为：TCCATCGTTAGTGGCACTGT ; SSR 引物下游序列为：GTCGACTCCTGCCCAATCTA。
[0012] 所述基因组荧光原位杂交按以下方法进行：先在离心管中配制杂交液，杂交液包 括去离子甲酰胺分析纯7. 5ml、20XSSC缓冲液1. 5微升、50%的硫酸葡聚糖2微升、IOmg/ ml的鲑鱼精DNA 0. 5微升和生物素标记的A oteroi DNA探针2. 5微升、100 mg/ml的白 沙1016封阻DNA 1微升，杂交液混匀后在103°C变性13 min，然后将离心管立即置于-20°C 冰箱的酒精中l〇_15min ;在有丝分裂中期制片，-70°C冰冻揭片，玻片在酒精中脱水6h后， 放置在70%的甲酰胺78°C变性I min 10 s，之后在-20°C下分别在70%、95%、100%的酒精中 梯度脱水各5 min，吹干载玻片； 将所述杂交液滴到载玻片上，盖上盖玻片，于37°C杂交6-8 h;42°C条件下分别用 2 X SSC浸泡10 min、用50%的甲酰胺浸泡10 min、用2 X SSC浸泡10 min，然后在室温下用 IXTNT浸泡5 min;将制片浙干，加上抗生物素FITC，放入37°C暗盒中室温培育30 min，用 IXTNT溶液室温洗涤制片3次，每次5 min，最后将制片吹干。
[0013] 所述的SSC缓冲液由0. 3M的柠檬酸三钠C6H5Na3O7. 2H20和3M的NaCl组成。
[0014] 所述 TNT 溶液由 0? IM 的 Tris-HCl、0. 15 M 的 NaCl、0. 05% 的 Tween-20 组成。
[0015] 本发明的积极有益效果： (1)本发明的六倍体花生创制方法，利用组织培养技术，在适于花生生长的培养基中加 入秋水仙素,成功地将种间杂种三倍体加倍成六倍体花生,为花生远缘杂交利用提供了一 种有效的染色体加倍方法。
[0016] (2)本发明综合利用分子标记和基因组荧光原位杂交技术成功地创制出了两个异 源六倍体花生，为育种利用野生种A ffiacet/oi和A oteroi的有益基因奠定了材料基础。
[0017] (3)本发明得到的异源六倍体花生可作为遗传育种研究的材料，通过与栽培种回 交，创造染色体附加系、代换系或培育新种质。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1用醋酸洋红检测植株Stl有果针侧枝与无果针侧枝上花朵的花粉活力图。
[0019] 图Ia :有果针侧枝上花朵的花粉活力；图Ib :无果针侧枝上花朵的花粉活力。对 比发现有果针枝条花的花粉活力显著较高；图Ic :有果针枝条经培养所产生根尖细胞有丝 分裂中期染色体图片，结果显示2n=60。
[0020] 图2母本豫花9331、父本A oteroi及异源六倍体花生的突光原位杂交鉴定结果。
[0021] 图2a-2b :为豫花9331的DAPI染色结果和45S rDNA和5S rDNA探针检测结果， 可看出豫花9331为42条染色体(实为40条，因栽培种花生的一对大随体染色体，在细胞学 制片中由于次缢痕通常被拉成丝状，一对染色体在影像上表现为4条，故显示为42条）； 图2c-2d ：A oteroi的DAPI染色结果和45S rDNA和5S rDNA探针检测结果，可看出 A oteroi有染色体着丝粒带，有22条染色体(有1对大随体染色体，在细胞学制片中由于 次缢痕通常被拉成丝状，一条染色体在影像上表现为2条，实为20条）； 图2e-2f :2e为E-4的DAPI染色结果和A oteroi全基因组探针杂交检测结果，可看 出E-4为64条染色体(包含两对大随体染色体，实为60条）是六倍体花生，2f?绿色杂交信 号为A oteroi染色体； 图3特异标记E420分别在母本豫花9331、父本A oteroi和异源六倍体E-4的扩增 结果。
[0022] 可看出，母本(豫花9331)在约450bp和330bp处有特异条带，父本(A oteroi)在 约160bp处有特异条带，而E-4在450bp、330bp和160bp处均有特异条带，说明E-4既有来 自母本的染色质，又有来自父本的染色质。
[0023] 图4本发明的异源六倍体花生E-4和L-21的组培苗照片。
【具体实施方式】
[0024] 以下实施例是为了进一步说明本发明，并不表示对本发明的任何限制。文中如果 没有特别说明，其中的百分含量均为重量百分含量。
[0025] 实例1 一种异源六倍体花生的创制方法。
[0026] 材料栽培品种豫花9331 (异源四倍体2n=4x=40)与野生种A oteroi (二倍体 2n=2x=20)的种间杂种F1，由河南省农业科学院经济作物研究所保存。
[0027] 以栽培种豫花9331为母本，以野生种A oteroi为父本进行杂交，得到F1三倍体 (2n=3x=30)，以该三倍体植株为材料，利用组织培养的方法进行染色体加倍，获得异源六倍 体花生，具体方法如下： (1) 在？:三倍体的组培苗从顶端数第三片叶下切开，取顶芽部分，将其置于MS、0. I mg/ L NAA、0.4 mg/L 6-BA、3%蔗糖和0.05%秋水仙素为组分的固体培养基中，在25°C恒温光照 培养间诱导芽分化14-16天，得到培养苗； (2) 将培养苗转移到由MS、0. 8 mg/L NAA和3%蔗糖为组分的固体生根培养基中，培养 15-30天，直至形成完整植株Stl ; (3) 将形成的完整植株Stl于当年的5月1日到5月15日移栽到河南省农科院实验田， 移栽6株，成活5株；于当年的8月1日到8月20日观察发现，其中1株的部分侧枝开花后 产生了果针，统计有果针侧枝与无果针侧枝花粉育性； 方法是选取Stl有果针枝条与无果针枝条的健康当天花粉，将花粉置于载玻片上，加一 滴1%的醋酸洋红染色，片刻后盖上盖玻片，置于显微镜下观察，统计5个视野区域，每种材 料统计两朵花。一般认为，形状规则圆形、染色良好的，是有活力、可育的花粉。结果显示有 果针枝条的花粉育性为62. 67%，而无果针枝条的花粉育性为1. 48%，有果针枝条花粉育性 大幅提高，无果针枝条花粉育性与F1育性接近(表1，图la、lb)。
[0028] 表1豫花9331与A oter心杂种F1、Stl的花粉活力情况
【权利要求】
1. 一种异源六倍体花生的创制方法，其特征在于，以四倍体栽培品种豫花9331为母 本，以二倍体野生种A 为父本进行杂交，经胚珠和幼胚离体培养得到三倍体匕，以 该三倍体组培苗为材料，在组织培养的条件下进行染色体加倍，获得异源六倍体花生，具体 方法如下： (1 )在匕三倍体的组培苗从顶端数第三片叶下切开，取顶芽部分，将其置于固体培养基 中，在25°C恒温光照培养间诱导芽分化14-16天，得到培养苗； (2) 将培养苗转移到由MS、0. 8 mg/L NAA和3%蔗糖为组分的固体生根培养基中，培养 15-30天，直至形成完整植株SQ ; (3) 将完整植株\于移栽到实验田中；继续培养观察发现部分侧枝开花后产生了果针， 统计有果针侧枝与无果针侧枝的花粉育性，结果显示有果针侧枝的花粉育性明显高于无果 针侧枝；取花粉育性高的有果针侧枝的部分枝条，用MS基本培养基和0.8 mg/L NAA形成的 液体培养基进行生根培养，然后对根尖进行细胞学观察及染色体计数，结果显示枝条体细 胞染色体为60条；当年收获荚果； (4) 将所得的荚果用5%的次氯酸钠进行消毒处理，取其种子，将种子接种到由1/2 MS 和5%鹿糖组成的固体培养基中，置于25°C恒温光照培养间培养，直至发育成幼苗Si ;所述 1/2 MS培养基中的元素含量为MS的一半。
2. 如权利要求1所述的创制方法，其特征在于，其中步骤（1)中的固体培养基的组分为 MS、0. 1 mg/L 的 NAA、0. 4 mg/L 的 6-BA、3% 的蔗糖和 0· 05% 的秋水仙素。
3. 如权利要求1或2所述的创制方法，其特征在于，所述母本为白沙1016,父本为A macedoi〇
4. 一种异源六倍体花生的鉴定方法，其特征在于：将权利要求1中获得的幼苗Si进行 基因组荧光原位杂交和分子标记分析，具体步骤如下： a、 分别提取母本豫花9331、父本野生种A oteroi和Si植株的基因组DNA ; b、 取幼苗Si的根尖，进行有丝分裂中期制片，然后以A 全基因组的DNA为探 针，对Si进行基因组荧光原位杂交，杂交完成后用DAPI染液滴至玻片上染色3-4 min，再在 荧光显微镜下照相，获得杂交图片，统计染色体数，获得染色体为60条的异源六倍体花生 E_4 ； C、进一步用豫花9331、A oieroi的共显性分子标记E420验证所得的异源六倍体花生 的准确性，用E420对豫花9331、A oteroi和E-4的DNA扩增条带结果显示，E-4同时包含 了豫花9331和A oieroi的遗传物质。
5. 如权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于：所述分子标记E420包括SSR上游引物 序列和下游引物序列，SSR引物上游序列为：TCCATCGTTAGTGGCACTGT ; SSR 引物下游序列为：GTCGACTCCTGCCCAATCTA。
6. 如权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于：所述基因组荧光原位杂交按以下方法 进行：先在离心管中配制杂交液，杂交液包括去离子甲酰胺分析纯7. 5微升、20 X SSC缓冲 液1.5微升、50%的硫酸葡聚糖2微升、10mg/ml的鲑鱼精DNA 0.5微升和生物素标记的 A. oteroi DNA探针2. 5微升、100 mg/ml的白沙1016封阻DNA 1微升，杂交液混匀后在 103°C变性13 min，然后将离心管立即置于-20°C冰箱的酒精中10_15min ;在有丝分裂中期 制片，-70°C冰冻揭片，玻片在酒精中脱水6h后，放置在70%的甲酰胺78°C变性1 min 10 S，之后在-20°c下分别在70%、95%、100%的酒精中梯度脱水各5 min，吹干载玻片； 将所述杂交液滴到载玻片上，盖上盖玻片，于37°C杂交6-8 h ;42°C条件下分别用 2 XSSC浸泡10 min、用50%的甲酰胺浸泡10 min、用2 XSSC浸泡10 min，然后在室温下用 1XTNT浸泡5 min;将制片浙干，加上抗生物素 FITC，放入37°C暗盒中室温培育30 min，用 IXTNT溶液室温洗涤制片3次，每次5 min，最后将制片吹干。
7. 如权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于：所述的SSC缓冲液由0. 3M的柠檬酸三 钠 C6H5Na307. 2H20 和 3M 的 NaCl 组成。
8. 如权利要求6或7所述的鉴定方法，其特征在于：所述TNT溶液由0.1M的 Tris-HCl、0. 15 Μ 的 NaCl、0. 05% 的 Tween-20 组成。
【文档编号】A01H1/02GK104255433SQ201410453833
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月9日 优先权日:2014年9月9日
【发明者】张新友, 杜培, 李丽娜, 刘华, 黄冰艳, 董文召, 汤丰收, 秦利 申请人:河南省农业科学院