兜兰种子萌发培养基及培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种兜兰种子萌发培养基及培养方法。本发明所述的兜兰种子萌发培养基以1/4MS培养基为基础培养基，并添加有抗坏血酸、活性炭、香蕉泥、赤霉素、琼脂粉和白砂糖，能够缩短兜兰种子的萌发时间，提高种子萌发率。
【专利说明】兜兰种子萌发培养基及培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兰花组织培养【技术领域】，特别是涉及一种兜兰种子萌发培养基及培养 方法。
【背景技术】
[0002] 兜兰，又称"拖鞋兰"、"仙履兰"，是兰科兜兰属（Paphiopedilum)植物的统称。兜 兰是兰科植物中最具特色的一个类群，也是最奇特的观赏兰花，以其独特魅力和许多优异 特性而备受世界花卉爱好者的钟爱。
[0003] 近年来，兰花的组织培养技术及试管苗工厂化生产取得了迅猛的发展，但作为兰 科较原始的兜兰属，其种子没有胚乳，存在萌发率极低、萌发时间长等问题。现有的兜兰 种子萌发培养基通常在1/4MS培养基的基础上，添加质量浓度10 %的椰子汁、0. 5mg/L的 6-BA、0. 5mg/L的NAA、6g/L的琼脂粉、30g/L的蔗糖和2g/L的活性炭。然而，6-BA和NAA为 广谱性植物生长调节剂，主要用于生根、生芽和诱导原球茎，对打破种子休眠作用较差。因 此，采用现有的兜兰种子萌发培养进行培养，难以实现兜兰的快速繁殖，难以满足规模化种 植的需求。
【发明内容】
[0004] 基于此，有必要针对兜兰种子萌发率低的问题，提供一种能提高兜兰种子萌发率 的培养基。
[0005] 此外，有必要针对兜兰种子萌发率低的问题，提供一种能提高兜兰种子萌发率的 培养方法。
[0006] -种兜兰种子萌发培养基，其以1/4MS培养基为基础培养基，并添加有抗坏血酸、 赤霉素、活性炭、香蕉泥、琼脂粉和白砂糖。
[0007] 在其中一个实施例中，抗坏血酸的浓度为80?100mg/L，赤霉素的浓度为40? 60mg/L，活性炭的浓度为1. 8?2g/L，香蕉泥的浓度为40?50g/L，琼脂粉的浓度为6? 7g/L，白砂糖的浓度为25?30g/L。
[0008] 在其中一个实施例中，抗坏血酸的浓度为l〇〇mg/L，赤霉素的浓度为50mg/L，活性 炭的浓度为2g/L，香蕉泥的浓度为50g/L，琼脂粉的浓度为6g/L，白砂糖的浓度为30g/L。
[0009] 在其中一个实施例中，所述兜兰种子萌发培养基的pH值为6. 0。
[0010] 一种兜兰种子萌发培养方法，包括以下步骤：
[0011] 1)取生长健康、授粉140?150天的果荚，用质量浓度为70?75 %的酒精浸泡 25?30秒，再用质量浓度为0. 10?0. 12%的氯化汞溶液消毒18?25分钟，再用无菌水 清洗干净后，切开果荚，取出种子；
[0012] 2)种子用浓度为0. 05?0. lmol/L的Κ0Η溶液浸泡处理8?10分钟，用无菌水清 洗干净后，再用频率为50?60KHz、功率为80?90W的超声波处理25?30分钟，然后接种 到本发明所述的兜兰种子萌发培养基中，于暗培养条件下培养至种子萌发，然后于光暗周 期为12h光照/12h黑暗、光照强度为1800?20001ux的条件下培养至长成小苗。
[0013] 在其中一个实施例中，步骤3)中，所述的兜兰种子萌发培养基上铺设有灭菌滤 纸，所述的灭菌滤纸经本发明所述的兜兰种子萌发培养基浸泡处理。
[0014] 本发明的兜兰种子萌发培养基中，采用1/4MS培养基，通过降低大量元素的离子 浓度，有利于兜兰种子萌发，提高萌发率；此外，通过抗坏血酸、赤霉素、活性炭和香蕉泥联 合作用于种子，能有效促进种子萌发，提高种子萌发率。其中，抗坏血酸为抗氧化剂，对种 子无毒副作用，可与褐化所产生的氧化产物--醌类物质发生作用，使其重新还原为酚类 物质，从而降低褐化程度，提高种子萌发率；赤霉素能够调节种子的生理状态，通过转录介 导因子影响种子中的α-淀粉酶基因，促进α-淀粉酶mRNA的形成和α-淀粉酶的合成， 提高α-淀粉酶的水平，从而促进α-淀粉酶水解淀粉，增加种子萌发所需的碳源，打破种 子的休眠，促进种子萌发，显著缩短萌发时间；活性炭能够有效吸附种子产生的酚类、醌类 物质，抑制褐化，提高种子萌发率；香蕉泥富含氨基酸、激素和酶等多种种子萌发所需物质， 可弥补兜兰种子没有胚乳的缺陷，为其提供营养物质，从而提高萌发率，并使原球茎生长健 壮；琼脂作为固体培养平台，为植材提供养分、水分与透气的效用，并以白砂糖作为碳源，在 萌发时间和萌发率不受影响的前提下，降低了培养基的制备成本。
[0015] 本发明的兜兰种子萌发培养基中，抗坏血酸的浓度优选为80?100mg/L，若其用 量过少，则抗氧化作用不明显；赤霉素的浓度优选为40?60mg/L，若其用量过少，难以促进 种子萌发，若其用量过多，则会造成外植体疯长，玻璃化严重；活性炭的浓度优选为1. 8? 2g/L，若其用量过少，不能充分吸附酚类和醌类物质，褐化抑制效果差，若其用量过多，则除 了吸附酚类和醌类物质外，还会吸附培养基中的营养物质，影响种子萌发和外植体生长；香 蕉泥的浓度优选为40?50g/L，若其用量过少，则难以满足兜兰种子萌发所需的营养。
[0016] 本发明的兜兰种子萌发培养基，将pH值控制在6.0,呈弱酸性环境，有利于兜兰种 子的萌发，从而提高萌发率，缩短萌发时间。
[0017] 本发明所述的兜兰种子萌发培养基，通过生化手段，在培养基中添加抗坏血酸，阻 止酚类物质氧化成褐色的醌类物质；通过生理手段，在培养基中添加赤霉素和香蕉泥，调节 种子生理状况，打破种子休眠，促进种子萌发；并通过物理手段，在培养基中添加活性炭，吸 收酚类、醌类物质，减少组织褐化，从而提高种子萌发率。本发明的兜兰种子萌发培养基，通 过生化、生理和物理三方面的协同作用，能显著提高兜兰种子的萌发率。
[0018] 本发明所述的兜兰种子萌发培养方法，采用了本发明的兜兰种子萌发培养基，再 通过化学、生理等多方面的同时作用，相互促进，能够显著提高兜兰种子萌发率，种子萌发 率高达60%，缩短兜兰种子萌发时间，并降低外植体褐化率。在获取无菌种子后对种子进行 Κ0Η溶液浸泡和超声波处理，以打破种子休眠，促进种子萌发。其中，化学方面，采用Κ0Η溶 液浸泡，能溶解抑制种子萌发的物质、腐蚀种皮，使种子更容易萌发，提高萌发率，采用Κ0Η 溶液而非常用的NaOH溶液，因为Κ0Η的吸水性比NaOH低，能更好地保持种子的水分；而生 理方面，采用超声波处理，则可使酶的活性增加，破除种子的休眠。种子经Κ0Η溶液浸泡和 超声波处理后，接种到本发明所述的兜兰种子萌发培养基中进行暗培养，能够调节种子生 理活动，打破种子休眠，促进种子萌发。种子发芽后及时转移到光暗交替环境下进行培养， 以避免原球茎生长膨大、颜色变白，而不能转绿成苗。此外，采用酒精和氯化汞对果荚进行 灭菌处理，能够同时杀灭细菌和真菌，达到最佳灭菌效果。
[0019] 本发明的兜兰种子萌发培养方法中，采用Κ0Η溶液对种子作浸泡处理时，Κ0Η溶液 的浓度优选为〇. 05?0. lmol/L，浸泡时间优选为8?10分钟，若Κ0Η溶液浓度过高或浸泡 时间过长，会对兜兰种子造成伤害甚至使之失活，若Κ0Η溶液浓度过低或浸泡时间过短，则 促进种子萌发的效果不明显；对种子进行超声波处理时，频率优选为50?60KHz，功率优选 为80?90W，处理时间优选为25?30分钟，若超声波处理的频率、功率过高或处理时间过 长，会造成种子生理紊乱，破坏种子生理结构，影响种子萌发甚至造成种子失活，若超声波 处理的频率、功率过低或处理时间过短，则促进种子萌发的效果不明显；种子暗培养至种子 萌发，若暗培养时间过长，会导致外植体黄化，生长不正常和外植体玻璃化，若暗培养时间 过短，则促进种子萌发的效果不明显。
[0020] 此外，通过在种子萌发培养基上铺设经培养基浸泡的灭菌滤纸，能够防止种子陷 入培养基中窒息而降低种子萌发率。
【具体实施方式】
[0021] 实施例一：本发明所述的兜兰种子萌发培养基的制备
[0022] 根据表1所示的1/4MS培养基配方以及表2所示的兜兰种子萌发培养基配方，制 备本发明所述的兜兰种子萌发培养基。
[0023] 按配制llOOmL培养基的量，分别称取1/4MS培养基中的各成分以及活性炭、香蕉 泥、琼脂粉、白砂糖，置于三角瓶中，加入适量纯化水，搅拌溶解，定容至lOOOmL，并调节pH 值至6.0。将三角瓶封口，置于高压灭菌锅中，于121°C灭菌20min，然后置于超净工作台中 自然冷却，得到灭菌培养基母液，备用。
[0024] 按配制llOOmL培养基的量，分别称取抗坏血酸和赤霉素，加入适量纯化水溶解， 混勻，定容至lOOmL，在超净工作台中过滤灭菌，备用。
[0025] 在超净工作台中，待灭菌培养基母液冷却至60°C后，加入灭菌后的抗坏血酸和赤 霉素溶液，混匀，制得llOOmL兜兰种子萌发培养基。
[0026] 取滤纸，裁剪成与组织培养瓶相匹配的大小，置于高压灭菌锅在121°C下灭菌 20min，灭菌后放到超净工作台中，并用所制得的兜兰种子萌发培养基浸泡，备用。
[0027] 取所制得的兜兰种子萌发培养基，分装至组织培养瓶中，晾凉，待其凝固后在其表 面铺设经培养基浸泡后的无菌滤纸，然后将组织培养瓶封口，备用。
[0028] 表1 1/4MS培养基的成分及其用量
[0029]
【权利要求】
1. 一种兜兰种子萌发培养基，其特征在于：以1/4MS培养基为基础培养基，并添加有抗 坏血酸、赤霉素、活性炭、香蕉泥、琼脂粉和白砂糖。
2. 根据权利要求1所述的兜兰种子萌发培养基，其特征在于：抗坏血酸的浓度为80? 100mg/L，赤霉素的浓度为40?60mg/L，活性炭的浓度为1. 8?2g/L，香蕉泥的浓度为40? 50g/L，琼脂粉的浓度为6?7g/L，白砂糖的浓度为25?30g/L。
3. 根据权利要求2所述的兜兰种子萌发培养基，其特征在于：抗坏血酸的浓度为 100mg/L，赤霉素的浓度为50mg/L，活性炭的浓度为2g/L，香蕉泥的浓度为50g/L，琼脂粉的 浓度为6g/L，白砂糖的浓度为30g/L。
4. 根据权利要求1至3的其中之一所述的兜兰种子萌发培养基，其特征在于：所述兜 兰种子萌发培养基的pH值为6. 0。
5. -种兜兰种子萌发培养方法，包括以下步骤： 1) 取生长健康、授粉140?150天的果荚，用质量浓度为70?75%的酒精浸泡25? 30秒，再用质量浓度为0. 10?0. 12%的氯化汞溶液消毒18?25分钟，再用无菌水清洗干 净后，切开果荚，取出种子； 2) 种子用浓度为0. 05?0. lmol/L的K0H溶液浸泡处理8?10分钟，用无菌水清洗干 净后，再用频率为50?60KHz、功率为80?90W的超声波处理25?30分钟，然后接种到权 利要求1所述的兜兰种子萌发培养基中，于暗培养条件下培养至种子萌发，然后于光暗周 期为12h光照/12h黑暗、光照强度为1800?20001ux的条件下培养至长成小苗。
6. 根据权利要求5所述的兜兰种子萌发培养方法，其特征在于：步骤3)中，所述的兜 兰种子萌发培养基上铺设有灭菌滤纸，所述的灭菌滤纸经权利要求1所述的兜兰种子萌发 培养基浸泡处理。
【文档编号】A01G31/00GK104186295SQ201410514229
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】陈永得 申请人:佛山市顺德区今日景艺生物科技有限公司