一种台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗的制作方法
【专利摘要】一种台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗，以台湾肖楠幼嫩叶片作为外植体，接种到过渡培养基中培养，挑取好的外植体转接到愈伤组织诱导培养基中培养，用愈伤组织再分化出丛生芽，将丛生芽在生根壮苗培养基中培养。对植物生长调节剂搭配比例、筛选出台湾肖楠无菌苗的植物生长调节剂和天然植物添加剂的搭配配方，进行台湾肖楠幼嫩叶片无性快繁。获得大量的无菌苗，保持优良的遗传性状，具有重要意义。比种子播种，常规无性繁殖，极大提高了台湾肖楠种苗的繁殖系数。有利于园林绿化、退耕还林、植树造林。
【专利说明】一种台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及植物的无性组织培养，尤其涉及台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗。
【背景技术】
[0002]台湾肖楠(Calocedrusformosana (Florin) Florin)又称肖楠、黄肉仔、黄肉树，柏科肖楠属常绿大乔木，为台湾特有裸子植物，分部于台湾北部及中部海拔300?1900米的山地，为台湾暖带林(50(Tl800m)的主要造林树种。是台湾针叶树五木之一。台湾肖楠树形为直干长圆锥状，树皮红褐色，刀切后会流出淡红色树脂。材质绵密，不易受白蚁蛀蚀，色泽偏黄褐色，为高级木材。与台湾扁柏、红桧、香杉、台湾杉等同列台湾针叶五木。雌雄同珠，球果木质化，为长椭圆形，种子有两翅。叶为鳞片状，细小但比扁柏细长。由于过去的大力采伐天然林，致使台湾肖楠天然族群量极稀少，且族群有高龄化倾向。
[0003]经查阅相关文献表明台湾肖楠母树稀少，结实不佳，扦插繁殖成活率不高，且生长缓慢。(钟镇德，2000)以不同的育林作业方式，对台湾肖楠开花结实的影响研究表明，以断根、修枝及断根且修枝等方式处理24年生的台湾肖楠母树，但连续两年只促进(Γ2.4%的植株开花，效果不佳。(忠兴郭，2002)以GA3对台湾肖楠开花旺盛期进行处理，93.9%可以开花，但雄花大量提前掉落，造成结实率不高。(郭宝章，1989)进行台湾肖楠扦插繁殖试验，但成活率不到2%，且成活的扦插苗生长缓慢。
[0004]经查阅相关文献，目前在大陆还未见有关台湾肖楠组织培养、扦插等方面的报道。而台湾学者在台湾肖楠组织培养研究方面也未有较大突破，林志谋等(1997)指出未成熟胚添力口 600mg/Lcasein enzymatic hydroIysate>500mg/L yeast extract、0.5mg/L BA 及lmg/L NAA的WPM培养基中可诱导出芽，但出芽率较低。用4?6个月的实生苗茎段及叶片，在WPM+0.05 mg/LNAA+lmg/LBA可诱导腋芽发生，但芽体有玻璃化现象，以相同的外植体接种在WPM +0.01mg/LBA+0.05mg/LTDZ培养基中，不定芽诱导率也仅仅能达到60%。愈伤组织在MS+ lmg/LNAA+0.lmg/LBA培养基中的诱导效果较好，但愈伤组织再分化为丛生芽的效果不好。
[0005]经查阅相关文献进行综合分析认为:目前虽已有台湾方面相关科研人员对台湾肖楠进行了组织培养方面的研究，但总体效果不好，未见完整的组培快繁体系报道，而本发明探索出了利用台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗的最佳培养基配方及培养方法，本发明具有一定的独创性和新颖性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是建立一套用台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗，从而构建了不依靠单纯的种子繁殖或扦插繁殖进行栽培的传统种植模式，利用组培技术繁殖出的种苗最大限度的保持了母本的特性，同时可在短期内获得大量性状一致、脱毒的台湾肖楠无菌苗，为野生台湾肖楠资源的保护、群落的恢复和利用台湾肖楠在大陆地区作为退耕还林、植树造林等的树种及合理利用提供了一种新的技术支撑。
[0007]本发明可通过以下技术实现外植体培育
O将从台湾引进的一棵台湾肖楠种植在基质为腐殖土的盆中，视土壤含水量浇水，置于向阳通风处备用，待需要外植体材料时，用不锈钢剪刀剪取位于顶端新长出的叶片，作为外植体材料来源，外植体采集宜于在晴天的8:0(Γ10:00进行。
[0008]2)无菌苗获取
剪取的外植体材料，置于洗净的烧杯中，滴入1-3滴普通洗洁精，I滴吐温20，盖上纱布并绑扎好，置于自来水下流水冲洗5h ;冲洗后的外植体材料于超净工作台上，先用75%酒精浸泡50s，用无菌水冲洗3次，而后将冲洗后的外植体用灭菌后的镊子放入0.1%的升汞中消毒8min,无菌水冲洗6次,每次1.5min,然后将外植体放入事先准备好的无菌培养皿内，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分，接种前将叶片用无菌不锈钢刀片切成1.5cm的小段，然后将切好的外植体接种到过渡培养基中，(MS (无肌醇)+0.0Γ3.0mg/LNAA+5^7g/L琼脂)。
[0009]待在过渡培养基中培养15?20d时，挑取无污染的外植体进行愈伤组织诱导。
[0010]3)愈伤组织诱导
将过渡培养基中无污染的外植体转接到愈伤组织诱导培养基培(MS+0.01mg/L^3.0mg/LNAA+0.0Γ2.0mg/L2, 4-D+0.θΓ?.0mg/L6-BA+25g/L 蔗糖 +5?7g/L 琼脂)。接种时外植体横放，并轻压外植体材料使之与培养基充分接触；培养室温度25°C，湿度70%，光照强度22001x,每天光照时间12h，7d后可见米白色疏松愈伤组织从切口处长出，待愈伤组织长到1.5cm左右宽时，转入丛生芽诱导培养基培养。
[0011]4)丛生芽诱导与增值
将疏松、嫩绿色、长势良好的愈伤组织转接于再分化培养基上(丛生芽诱导与增殖培养基:
WPM+0.ΟΓ?.0mg/LNAA+0.0lmg/L?2.0mg/LTDZ+0.θΓ?.5mg/LKT+0.0lmg/L?1.5mg/LGAs+30g/L蔗糖+5?7g/L琼脂)。用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触，培养室温度25°C，湿度70%，光照强度22001x，每天光照时间12h，培养30d后，可见丛生芽大量长出，继续培养35d，可得分化良好，长势旺盛的丛生苗。
[0012]5)壮苗培养
截取高Γ5αιι的丛生苗，接种于壮苗培养基上，(生根壮苗培养基:WPM+0.0Γ3.0mg/LNAA+0.0lmg/L?2.0mg/L IBA+ 适量(5-lOmL)香蕉汁 +30g/L 蔗糖 +5?7g/L 琼脂)。培养室温度25°C，湿度70%，光照强度22001x，每天光照时间12h，培养7d后可得健壮的台湾肖楠无菌苗。
[0013]本发明在接种操作过程中，在进行愈伤组织诱导培养接种时，需要先将台湾肖楠外植体横放在培养基上，并轻压外植体材料使之与培养基充分接触；在进行丛生芽诱导时，愈伤组织转接于再分化培养基上，需要用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触。避免了接种材料形状不规则导致的与培养基接触不充分而导致的生长不好甚至死亡。
[0014]本发明的技术方案，具有以下有益效果:相对于传统的种子播种或扦插繁殖，繁殖速度快，从外植体到成苗只需4个月时间；繁殖系数高，不定芽成指数增长；不受外界环境影响，四季均可进行种苗繁育；种苗稳定性好，分离或衰减的情况发生较少；种苗通过组培，全部为脱毒苗，利于高产，少病虫害；投资少，只需少量的原生外植体就可获得大量的无菌苗，经济效益高，可规模化种植，解决种苗来源这一瓶颈，组培苗的野生环境栽培有利于野生居群的恢复，可遏制野生资源的掠夺性采挖，增加退耕还林、植树造林、园林绿化树种，可产生良好的经济、社会和生态效益。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
从台湾引进一盆台湾肖楠备用，用不锈钢剪刀剪取位于顶端新长出的叶片置于洗净的烧杯中，滴入1-3滴普通洗洁精，I滴吐温20，盖上纱布并绑扎好，置于自来水下流水冲洗3-5h，冲洗后的材料于超净工作台上，先用75%酒精浸泡50s，用无菌水冲洗3次，而后将冲洗后的外植体用灭菌后的镊子放入0.1%的升汞中消毒8min，无菌水冲洗6次，每次1.5min，然后将外植体放入事先准备好的无菌培养皿内，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分，用无菌不锈钢刀片切成1.5cm的小段，然后将切好的外植体接种到过渡培养基中，待在过渡培养基中培养15?20d时，挑取无污染的外植体进行愈伤组织诱导，接种时外植体横放，并轻压外植体材料使之与培养基充分接触，培养室温度25 V，湿度70%，光照强度22001x，每天光照时间12h，7d后可见米白色疏松愈伤组织从切口处长出，待愈伤组织长到1.5cm左右宽时，挑取疏松、嫩绿色、长势良好的愈伤组织转接于再分化培养基上，用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触，培养室温度25°C，湿度70%，光照强度22001x，每天光照时间12h，培养30d后，可见丛生芽大量长出，继续培养35d，可得分化良好，长势旺盛的丛生苗；截取高4?5cm的丛生苗，接种于壮苗培养基上，培养室温度25°C，湿度70%，光照强度22001x，每天光照时间12h，培养14d后可得健壮的台湾肖楠无菌苗。
[0016]方案所使用培养基为:外植体培育:腐殖土。
[0017]上述该发明的过渡培养基:
MS (无肌醇)+0.0Γ3.0mg/LNAA+5?7g/L 琼脂。
[0018]该发明的愈伤组织诱导最佳培养基:
MS+0.01mg/L?3.0mg/LNAA+0.01 ?2.0mg/L2, 4-D+0.θΓ?.0mg/L6_BA+25g/L 蔗糖+5?7g/L琼脂。
[0019]该发明的丛生芽诱导与增殖最佳培养基:
WPM+0.ΟΓ?.0mg/LNAA+0.01mg/L?2.0mg/LTDZ+0.θΓ?.5mg/LKT+0.01mg/L?1.5mg/LGAs+30g/L 蔗糖 +5?7g/L 琼脂。
[0020]该发明的生根壮苗最佳培养基:
WPM+0.0Γ3.0mg/LNAA+0.01mg/L?2.0mg/L IBA+ 适量香蕉汁 +30g/L 蔗糖 +5?7g/L 琼脂。
【权利要求】
1.一种台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗，其特征在于:按下列步骤: 1)外植体培育:将台湾肖楠种植于有腐殖土中备用，待需要外植体材料时，用不锈钢剪刀剪取位于顶端新长出的叶片，作为外植体材料来源； 2)无菌苗获取:剪取的外植体材料，置于洗净的烧杯中，滴入1-3滴普通洗洁精，I滴吐温20，盖上纱布并绑扎好，置于自来水下流水冲洗3-5h ;冲洗后的外植体材料于超净工作台上，先用75%酒精浸泡50s，用无菌水冲洗3次，而后将冲洗后的外植体用灭菌后的镊子放入0.1%的升汞中消毒8min，无菌水冲洗6次，每次1.5min,然后将外植体放入事先准备好的无菌培养皿内，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分，接种前将叶片用无菌不锈钢刀片切成1.5cm的小段，然后将切好的外植体接种到过渡培养基中，待在过渡培养基中培养15^20d时，挑取无污染的外植体进行愈伤组织诱导； 3)愈伤组织诱导:将过渡培养基中无污染的外植体转接到愈伤组织诱导培养基培养，接种时外植体横放，并轻压外植体材料使之与培养基充分接触；培养室温度25°C，湿度70%,光照强度22001x，每天光照时间12h，7d后可见米白色疏松愈伤组织从切口处长出，待愈伤组织长到1.5cm左右宽时，转入丛生芽诱导培养基培养； 4)丛生芽诱导与增殖:将疏松、嫩绿色、长势良好的愈伤组织转接于再分化培养基上，用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触，培养室温度25°C，湿度70%，光照强度22001x,每天光照时间12h，培养30d后，可见丛生芽大量长出，继续培养35d，可得分化良好，长势旺盛的丛生苗； 5)壮苗培养:截取高r5cm的丛生苗，接种于壮苗培养基上，WPM为基本培养基，培养室温度25°C，湿度70%，光照强度22001x，每天光照时间12h，培养14d后得健壮的台湾肖楠无菌苗。
2.根据权利要求书I所述的一种台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗，其特征在于:步骤I)中所述的台湾肖楠品种从台湾引进。
3.根据权利要求书I所述的一种台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗，其特征在于:所述步骤2)中过渡培养基，以MS为基本培养基，不添加肌醇和蔗糖，添加5?7g/L琼脂、0.0Γ3.0mg/L的NAA，pH值在常温下调整至6.0,高压灭菌20min。
4.根据权利要求书I所述的一种利用台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗，其特征在于:所述的步骤3)中愈伤组织诱导培养基，以MS为基本培养基，添加0.01mg/L^3.0mg/L的NAA,0.0Γ2.0mg/L2, 4_D、0.θΓ?.0mg/L 的 6_BA、25g/L 的蔗糖、pH 值于常温下调整至 6.0、5^7g/L琼脂,高压灭菌20min。
5.根据权利要求书I所述的一种台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗，其特征在于:所述的步骤4)中再分化培养基，以WPM为基本培养基，添加0.0Γ1.0mg/L的NAA、0.0lmg/L?2.0mg/L 的 TDZ、0.θΓ?.5mg/L 的 KT,0.01mg/L?1.5mg/LGA3、30g/L 的蔗糖、pH 值于常温下调整至6.0、5?7g/L琼脂、高压灭菌20min，接种时用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触。
6.根据权利要求书I所述的一种台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗，其特征在于:所述的步骤5)中壮苗培养基:以WPM为基本培养基，添加0.0Γ3.0mg/L的NAA、0.0lmg/L^2.0mg/L的IBA、5-10mL的香蕉汁、30g/L的蔗糖、pH值于常温下调整至6.0、5?7g/L琼脂、高压灭菌20min。
【文档编号】A01H4/00GK104351051SQ201410584582
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】张翔宇, 陈杰, 阮培均, 吉云, 严显进, 王彩云, 王永 申请人:毕节市中药研究所