苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法

苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法
【专利摘要】本发明公开了一种苹果病毒脱除方法。该方法是将苹果组培苗茎尖接种于含15-25μg/mL病毒醚的培养基中，升温至34-36℃条件下进行恒温热处理。本发明的优点为：植株的存活率高、脱毒效果好、所需时间短，选用的化学药剂不具有寄主选择性，应用前景广阔。
【专利说明】苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种苹果病毒脱除方法，特别涉及一种苹果组培苗热处理结合化学处 理的脱毒方法。

【背景技术】
[0002] 我国栽植的苹果普遍感染多种病毒。苹果花叶病毒（ApMV)、苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV)、苹果茎痘病毒（ASPV)和苹果茎沟病毒（ASGV)是侵染苹果的最常见病毒。苹果感 染ApMV后，叶片上会出现大小不一的鲜黄色或黄白色斑块，形成花叶，还可能出现沿叶脉 褪绿黄化的网纹型症状。ACLSV、ASGV和ASPV在多数苹果栽培品种中呈潜隐性，不表现症 状，只在少数感病品种或指示植物上表现症状。在我国苹果主要栽培区，3种潜隐病毒的带 毒株率高达80%?100%，每年使苹果减产约17%?40%。如果土壤贫瘠、水肥欠缺、管理 不善或利用了对病毒较敏感的砧木和品种时，会使植株衰弱死亡，造成果园残缺不全，甚至 全园毁灭。苹果病毒主要通过嫁接传染，随带毒繁殖材料（如苗木、接穗、营养系砧木等） 远距离传播扩散，迄今尚未发现任何传毒介体。苹果一旦感染病毒，就很难防治。
[0003] 采用脱毒技术，培育无病毒原种，建立用于繁殖接穗和营养系砧木的母本园，栽植 无病毒苗木，是防治病毒病的根本措施。目前用于苹果脱毒的方法主要包括茎尖培养、热处 理和化学处理等。这些方法都存在不足之处，采用茎尖培养的方法，切取的茎尖大小一般为 0. 1-0. 5mm，操作困难，且成活率低；由于苹果对温度较为敏感，热处理脱毒过程中，植株的 成活率与温度呈反比，脱毒率与温度正比，兼顾成活率和脱毒率，就需延长处理时间；苹果 化学处理常用的药剂为病毒醚（Ribavirin)，脱毒的脱除效果与药剂的浓度成正比，且当其 浓度高于25 y g/mL时，将对植株产生严重的药害。目前，一直没有既能够保证成活率，又能 获得很好的脱毒效果的苹果病毒脱除方法。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于，提供一种植株成活率高、脱毒效果好、处理时间短的苹果组培 苗热处理结合化学处理的脱毒方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] 苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法，苹果组培苗生长在含有15-25 y g/ mL病毒醚（Ribavirin)的培养基中，同时在34-36°C的条件下进行恒温热处理。具体是将 苹果组培苗茎尖接种于含15-25 y g/mL病毒醚的培养基中，升温至34-36°C条件下进行恒 温热处理。所述苹果组培苗茎尖可为0. 1-1. 〇cm，优选0. 7cm。
[0007] 所述恒温热处理处理时间为18-25天，优选20天。
[0008] 在温度为36°C，病毒醚（Ribavirin)的浓度为25 ii g/mL的条件下，苹果病毒的脱 除效果最好。
[0009] 所述方法还包括在升温之前先在24°C下培养1天，然后，依次升温培养：28°C培养 1天、30°C培养1天、32°C培养1天。
[0010] 所述含15-25 i! g/mL病毒醚的培养基是在基础培养基中添加病毒醚，使病毒醚终 浓度为15-25 y g/mL，所述基础培养基为MS培养基中添加终浓度为lmg/L6-苄氨基嘌呤和 终浓度为〇. lmg/L萘乙酸得到的培养基。
[0011] 上述病毒醚（Ribavirin,Virazole?)又名病毒唑，化学名为1-@-D-呋喃核糖 基-1H-1，2,4,-三氮唑-3-羧酰胺。
[0012] 所述方法中，整个处理过程中，光照时间12-16小时/天，光照强度1800-2200LUX， 优选光照强度2000LUX，光照时间16小时/天。
[0013] 本发明的优点如下：
[0014] 1.处理植株成活率高。本发明中的热处理温度和化学药剂浓度都较低，对植株的 生长影响较小，植株的死亡率低。
[0015] 2.再生植株的脱毒效果好。本发明将热处理和化学处理结合后，脱毒效率明显高 于单独热处理或化学处理。
[0016] 3.脱毒处理时间短。本发明中苹果试管苗脱毒处理需要的时间为20天，与单独热 处理或化学处理相比时间明显缩短。

【具体实施方式】
[0017] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常 规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中使用的病毒醚（Ribavirin，Virazole?)又名 病毒唑，化学名为1-0 -D-呋喃核糖基-1H-1，2,4,-三氮唑-3-羧酰胺。
[0018] 实施例1、苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法：
[0019] 1、含病毒醚（Ribavirin)培养基的配制：
[0020] 制备苹果的扩繁培养基，配方为MS+lmg/L 6-节氨基噪呤（6-BA)+0. lmg/L萘乙酸 (NAA)，高温灭菌，冷却至60-70°C时，在无菌的环境中，将过滤除菌的病毒醚加入到培养基 中，摇匀，使其终浓度分别为15和25ii g/mL。
[0021] 2、脱毒处理：
[0022] 当苹果组培苗扩繁到所需数量后，选取长势一致的植株，切取0. 7cm的茎尖，分别 将茎尖移入含15和25 y g/mL病毒醚的培养基中，先在室温25°C下放置1天，然后移入光照 培养箱内，依次升温培养：28°C培养1天、30°C培养1天、32°C培养1天，最后将温度分别升 至34°C和36°C，处理20天，该处理过程中，光照强度2000LUX，光照时间16小时/天；然后 统计成活情况，并切取1mm茎尖（包括主芽和> 〇. 5cm的侧芽）移入新鲜的苹果扩繁培养 基中，进行再生培养。再生培养的温度为25°C，光照强度2000LUX，光照时间12小时/天。
[0023]单独热处理的对照：当苹果组培苗扩繁到所需数量后，选取长势一致的植株，切取 〇. 7cm的茎尖，分别将茎尖移入苹果扩繁培养基中，先在室温25°C下放置1天，然后移入光 照培养箱内，依次升温培养：28°C培养1天、30°C培养1天、32°C培养1天，最后将温度分别 升至34°C和36°C，处理20天，该处理过程中，光照强度2000LUX，光照时间16小时/天；然 后统计成活情况，并切取1mm茎尖（包括主芽和>〇. 5cm的侧芽）移入新鲜的苹果扩繁培养 基中，进行再生培养。再生培养的温度为25°C，光照强度2000LUX，光照时间12小时/天。
[0024] 单独化学处理的对照：当苹果组培苗扩繁到所需数量后，选取长势一致的植株，切 取0. 7cm的茎尖，分别将茎尖移入含15和25 y g/mL病毒醚的培养基中，处理60天后，该处 理过程中，光照强度2000LUX，光照时间16小时/天；统计成活情况，并切取1mm茎尖（包 括主芽和3 0.5cm的侧芽）移入新鲜的苹果扩繁培养基中，进行再生培养。再生培养的温 度为25°C，光照强度2000LUX，光照时间12小时/天。
[0025] 上述苹果扩繁培养基为：MS+lmg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA)+0?lmg/L萘乙酸（NAA)。
[0026] 3、再生植株的病毒检测：
[0027] 当再生植株继代培养2次后，采用RT-PCR的方法对再生植株中的病毒进行检测， 计算脱毒效果。上述继代培养的方法为：茎尖再生培养成完整的苹果植株后（约培养60 天），在无菌的条件下，从再生培养后的苹果组培苗上切取约1. 〇cm的茎尖，转入新鲜的苹 果扩繁培养基中进行继代培养，各个处理及其结果如表1-表3所示。
[0028]表1

【权利要求】
1. 苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法，是将苹果组培苗茎尖接种于含 15-25 y g/mL病毒醚的培养基中，升温至34-36°C条件下进行恒温热处理。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述恒温热处理的处理时间为18-25天。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述恒温热处理的处理时间为20天。
4. 根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在升温之 前先在25°C下培养1天，然后，依次升温培养：28°C培养1天、30°C培养1天、32°C培养1天。
5. 根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于：所述含15-25 y g/mL病毒 醚的培养基是在基础培养基中添加病毒醚，使病毒醚的终浓度为15-25 y g/mL，所述基础培 养基为MS培养基中添加终浓度为lmg/L 6-苄氨基嘌呤和终浓度为0. lmg/L萘乙酸得到的 培养基。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述含15-25 yg/mL病毒醚的培养基中 病毒醚的终浓度为25ug/mL，所述恒温热处理的温度为36°C。
【文档编号】A01H4/00GK104429942SQ201410608611
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】胡国君, 董雅凤, 张尊平, 范旭东, 任芳, 周俊 申请人:中国农业科学院果树研究所