一种小麦幼穗遗传转化受体的培养方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种小麦幼穗遗传转化受体的培养方法及应用，涉及转基因【技术领域】。所述方法主要包括以下几个步骤：1、幼穗的取材。2、幼穗的接种前处理。3、幼穗的接种及培养。4、将获得胚性愈伤组织转接到分化培养基中，培养至出苗。5、将所得的2-4cm高的幼苗转接到生根培养基中培养至获得健壮的组培苗。6、根据小麦的类型，将获得冬性小麦组培苗在4℃进行春化处理，春小麦组培苗不进行春化处理，最后将组培苗炼苗后移栽于土中。整个培养过程涉及三种培养基，分别是诱导培养基、分化培养基及生根壮苗培养基。
【专利说明】一种小麦幼穗遗传转化受体的培养方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及转基因【技术领域】，尤其涉及一种小麦幼穗遗传转化受体的培养方法及 应用。
【背景技术】
[0002] 小麦是世界上的主要粮食作物之一，培育高产、优质、抗逆新品种对发展国民经济 至关重要。目前小麦新品种的培育依然主要靠常规育种。由于常规杂交育种费时费力，而 且预见性差，致使小麦育种水平难有突破性提高，育种进展缓慢。近年来，利用现代基因工 程技术，将特定的外源基因导入小麦中定向改良小麦品种，为小麦遗传育种提供了一条新 途径。转基因技术作为杂交育种的主要补充手段，已经在水稻、玉米、大豆、棉花和油菜等作 物中取得了巨大成功，然而小麦转基因研究进展比较缓慢。影响小麦基因工程育种速度缓 慢的主要原因有，小麦属于异源六倍体植物，基因组庞大，重复序列多，植株再生能力差，遗 传转化比较困难等。
[0003]自1992年以来人们尝试利用多种转化方法和多种外植体转化小麦，转化 方法包括基因枪、农杆菌、花粉管通道、超声波法、离子束注入法、激光微束穿刺法和 PEG(Polyethylene glycol)法等，外植体包括幼胚、成熟胚、幼穗、盾片和花药愈伤组织 等，探讨了农杆菌介导的植株水平转化，取得了一定进展，促进了功能基因向小麦中的转 化。目前小麦的转化方法虽然众多但转化效率却并不乐观，其首要问题在于稳定的小麦再 生体系的建立较困难。虽然通过小麦根、茎、叶、花药、胚、穗等各种外植体均可实现植株再 生，但实践证明，相同外植体的诱导分化效果既受外植体类型和基因型的影响，也因培养基 的成分与浓度的不同而有变化。小麦成熟胚由于具有量大、生长一致、取材方便且不受取材 季节和环境条件限制等优点是开展小麦遗传转化较为方便的外植体。然而，愈伤组织质量 差、易发芽等问题，其愈伤组织诱导率和植株的再生能力远不及幼胚和幼穗，限制了成熟胚 在小麦遗传转化中的应用。目前幼穗和幼胚是小麦遗传转化中使用最多的外植体。尽管幼 胚的植株再生能力很强，但具有很强的基因型依赖性，在很大程度上限制了转基因技术在 小麦上的应用。
[0004] 一些研究表明，以小麦幼穗为外植体进行离体培养一般比常用的幼胚外植体更理 想，可获得较高的植株再生频率。舒理慧等研究表明，在小麦护颖分化期，其幼穗离体培养 诱导率和分化率最高；郑企成等也指出，用合适时期的幼穗作外植体诱导出的愈伤组织，其 再生能力比常用的幼胚外植体更理想，不仅再生频率高，而且在长期继代培养过程中能保 持较高的再生能力；陈梁鸿等在比较幼穗和幼胚为受体的转化试验中观察到，幼穗的转化 效果优于幼胚，幼穗较幼胚更耐继代，更形成再生植株；林刚等研究激素对小麦愈伤组织， 诱导和植株再生的影响时发现，幼穗的愈伤组织诱导率和植株再生频率高于幼胚和成熟 胚；刘录祥等（2001)统计分析了近90个基因型幼胚及幼穗愈伤组织诱导和植株再生频率 分布的资料，认为以小麦幼穗为外植体将有可能克服或减轻小麦基因型障碍。
[0005] 小麦幼穗由于取材方便、消毒方法简便，只需常规的春化技术就能做到周年提供， 并且对小麦幼穗进行离体培养可获得较高的绿苗分化率，因此是很好的外植体。因此，为了 克服基因型的障碍，促进转基因小麦的规模化应用，建立适于目的基因转化的幼穗组织培 养体系是利用幼穗为外植体进行小麦遗传转化的关键。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种小麦幼穗遗传转化受体的培养方法及应用，该方法适用 于进行小麦转基因，可成功获得小麦转基因植株。
[0007] 为达到上述目的，本发明的采用如下技术方案：
[0008] -种小麦幼穗遗传转化受体的培养方法，其过程包括以下主要步骤：1、幼穗的取 材：选取温室或田间种植的生长一致的小麦单茎，麦穗处在小穗分化期（幼穗生长至长度 为1. 0cm?1. 5cm左右时）。2、幼穗的接种前处理：徒手剥取田间采集的幼穗茎杆的外层叶 鞘，仅余内层叶鞘包裹幼穗以防止污染，在超净工作台上，喷洒75%乙醇对幼穗进行杀菌， 将处理后的幼穗用经75%乙醇处理的纱布包裹，以确保杀菌效果。3、幼穗的接种及培养： 用已灭菌的镊子沿着处理后幼穗的内层叶鞘顺时针方向剥出幼穗，露出生长锥后，用镊子 尖将幼穗夹断为〇. 5cm左右的小段，接入诱导培养基中培养，25°C恒温暗培养，每15d继代 一次。4、暗培养30天以后，将获得胚性愈伤组织转接到分化培养基中，置于25°C，光照强度 为4000-60001ux、光照时间为16h/d的条件下，培养至出苗。5、将所得的2-4cm高的幼苗转 接到生根培养基中培养至获得健壮的组培苗。6、根据小麦的类型，将获得冬性小麦组培苗 在4°C进行春化处理，春小麦组培苗不进行春化处理；最后将组培苗炼苗后移栽于土中。
[0009] 所述诱导培养基成分及配比如下：MS基本培养基+2,4_二氯苯氧乙酸丁酯（2， 4-D)2mg ?L_1+鹿糖（Sucrose) 30g吨―1-琼脂粉（Agar) 7g ?L-1 ;用蒸馈水将上述培养基定容 至1L ;灭菌前调该培养基的pH至5. 8 ;在121°C，即0. 1?0. 15MPa高压蒸汽下灭菌20分 钟；
[0010] 所述分化培养基成分及配比如下：MS基本培养基+萘乙酸（NAA)O. 2mg? 1^+激 动素（KT)lmg? 1^+6-苄氨基腺嘌呤（6-BA)lmg? 1^+ 硝酸银（AgN03) 10mg? 1^+ 蔗糖 (Sucrose) 30g?I71-琼脂粉（Agar) 7g?I71 ;用蒸馈水将上述培养基定容至IL;灭菌前调该 培养基的pH至5. 8 ;在121 °C，即0. 1?0. 15MPa高压蒸汽下灭菌20分钟；
[0011] 所述生根培养基成分及配比如下：1/2MS培养基+萘乙酸（NAA)O. 2mg?1^+多效 唑0? 3mg ? 1^+鹿糖（Sucrose) 30g ? 1^+琼脂粉（Agar) 7g ? I71 ;用蒸馈水将上述培养基定 容至IL;灭菌前调该培养基的pH至5.8 ;在121°C，即0. 1?0. 15MPa高压蒸汽下灭菌20 分钟。
[0012] 所述MS基本培养基成分如表1所示：
[0013] 表1 MS基本培养基成分附表
[0014]
【权利要求】
1. 一种小麦幼穗遗传转化受体的培养方法及应用，其特征在于：幼穗的取材时期选在 麦穗处于小穗分化期（幼穗生长至长度为1. Ocm?1. 5cm左右时）。
2. 根据权利要求1所陈述的一种小麦幼穗遗传转化受体的培养方法及应用，其特征在 于：幼穗在接种前要进行消毒处理，具体过程是：徒手剥取田间采集的幼穗茎杆的外层叶 鞘，仅余内层叶鞘包裹幼穗以防止污染，在超净工作台上，喷洒75%乙醇对幼穗进行杀菌， 将处理后的幼穗用经75%乙醇处理的纱布包裹，以确保杀菌效果。
3. 根据权利要求1和2所陈述的一种小麦幼穗遗传转化受体的培养方法及应用，其特 征在于：用已灭菌的镊子沿着处理后幼穗的内层叶鞘顺时针方向剥出幼穗，露出生长锥后， 用镊子尖将幼穗夹断为0. 5cm左右的小段，接入诱导培养基中培养。
4. 根据权利要求1、2和3所陈述的一种小麦幼穗遗传转化受体的培养方法及应用，其 特征在于：幼穗的培养基分为诱导培养基、分化培养基及生根壮苗培养基。
5. 根据权利要求4所陈述的诱导培养基，其特征在于：诱导培养基的成分是:MS基 本培养基+2,4-二氯苯氧乙酸丁酯（2,4-D)2mg 蔗糖（Sucrose) 琼脂粉 (Agar)7g ? I71 ;用蒸馏水将上述培养基定容至IL ;灭菌前调该培养基的pH至5. 8 ;在 121°C，即0. 1?0. 15MPa高压蒸汽下灭菌15分钟。
6. 根据权利要求4所陈述的分化培养基，其特征在于：分化培养基的成分是:MS基本 培养基+萘乙酸（NAA)O. 2mg七1-激动素（KT) lmg .1^+6-苄氨基腺嘌呤（6-BA) lmg吨-1+ 硝酸银（AgN03) 10mg ? 1^+鹿糖（Sucrose) 30g ? 1^+琼脂粉（Agar) 7g ? I71 ;用蒸馈水将上 述培养基定容至IL;灭菌前调该培养基的pH至5.8 ;在121°C，即0. 1?0. 15MPa高压蒸汽 下灭菌20分钟。
7. 根据权利要求4所陈述的生根培养基，其特征在于：生根培养基的成分是：1/2MS 培养基 + 萘乙酸（NAA) 0? 2mg ? 1^+ 多效唑 0? 3mg ? 1^+ 蔗糖（Sucrose) 30g ? 1^+ 琼脂 粉（Agar) 7g ? I71 ;用蒸馏水将上述培养基定容至IL ;灭菌前调该培养基的pH至5. 8 ;在 121°C，即0. 1?0. 15MPa高压蒸汽下灭菌15分钟。
【文档编号】A01H4/00GK104429957SQ201410692788
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】吉万全, 刘新伦, 田增荣, 栗聪, 李伟艳, 张磊 申请人:西北农林科技大学