使用AXMI-011控制半翅目昆虫的制作方法

文档序号:14685581发布日期:2018-06-14 17:53

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发明领域

本发明涉及分子生物学领域。提供的是编码杀有害生物蛋白质的新基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列在制备杀有害生物配制品和在生产转基因的抵抗有害生物的植物中有用。

发明背景

工程化用于生产来自于细菌苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)(Bt)的杀虫毒素的转基因作物2010年在全世界种植了5800多万公顷(詹姆斯(JamesC)(2010)《商业化生物技术/转基因作物的全球状况》(GlobalStatusofCommercializedBiotech/GMCrops):2010.ISAAA摘要号42.纽约州伊萨卡:ISAAA)。Bt作物的优点包括减少使用有害的杀虫剂和一些重要农业有害生物的区域性抑制(卡里尔(Carrière)等人(2003)《美国国家科学院院刊》(ProcNatlAcadSciUSA)100:1519-1523;卡塔内奥(Cattaneo)等人(2006)《美国国家科学院院刊》(ProcNatlAcadSciUSA)103:7571-7576;黄(Huang)等人(2005)《科学》(Science)308:688-690;吴(Wu)(2008)《科学》(Science)321:1676-1678;以及哈奇森(Hutchison)等人(2010)《科学》(Science)330:222-225)。

树液吸食性昆虫,其包括蚜虫、粉虱、盲蝽和椿象,已经成为主要的农业有害生物。半翅目通过食用作物导致直接损害,并且在某些情况下,通过植物病毒的传播间接损害。目前的管理几乎仅仅依赖于传统的化学杀虫剂的应用。尽管表达来自Bt的毒素的转基因作物的发展提供了对一些有害生物有效的植物保护,市售的Bt毒素对树液吸食性昆虫表现很小的毒性。

这些昆虫最初被认为仅仅是不重要的或次要的有害生物,已成为主要的有害生物,部分原因是在农业实践方面的改变,如增加使用转基因的和经典性筛选的抗主要有害生物的植物品种,以及化学杀虫剂应用减少。

盲蝽的几个物种(草盲蝽属(Lygusspp.))是主要的农业有害生物,包括西部牧草盲蝽、豆荚草盲蝽(Lygushesperus)骑士、牧草盲蝽、美洲牧草盲蝽(Lyguslineolaris)(蝼蛄(PalisotdeBeauvois))、以及绿盲蝽(Lyguselisus)。豆荚草盲蝽和美洲牧草盲蝽是整个美国和加拿大广泛的农艺和园艺作物的主要有害生物(埃斯基韦尔(Esquivel)和莫维利(Mowery)(2007)《环境昆虫》(Environ.Entomol.)36:725-730;惠勒(WheelerA.G.,Jr.)《盲蝽(半翅目:盲蝽科):害虫、天敌、机会主义者的生物学》(BiologyofthePlantBugs(Hemiptera:Miridae):Pests,Predators,Opportunists)。康斯托克出版公司(ComstockPublishingAssociates);美国纽约州伊萨卡:2001;斯科特(ScottD.R.)(1977)《美国昆虫学会通报》(Bull.Entomol.Soc.Am.)23:19-22;扬(YoungO.P.)(1986)《美国昆虫学会纪事》(Ann.Entomol.Soc.Am.)79:747-762)。草盲蝽属据报道以117种非作物植物和超过25种栽培植物为食。

椿象包括具有至关重要意义的有害生物复合体,影响全球12个主要作物(麦弗逊(McPhersonJ.E.),麦弗逊(McPhersonR.M.)《美国北部墨西哥的经济重要的椿象》(StinkBugsofEconomicImportanceinAmericaNorthofMexico).CRC出版社;美国佛罗里达州博卡拉顿:2000)。椿象的50多个紧密相关种影响作物包括水果、蔬菜、坚果、纤维和谷物。最丰富和重要的物种包括绿蝽((例如)Acrosternumhilare);稻绿蝽(Nezaraviridula(L.));和棕色蝽((例如)Euschistusservus)。椿象在美国棉花中造成损失估计在2005年为$6400万,在2008年为$3100万,而在大豆(大豆属美林(GlycinemaxL.Merrill)的损失达到$1300万(雷伊-琼斯(Reay-JonesF.P.F.)(2010)《环境昆虫》(Environ.Entomol.)39:944-955)。

蚜虫是专一的韧皮部食用者和温带农业中经济上最重要的有害生物之一(布莱克曼(BlackmanR.L.)(2000年)《世界农作物上的蚜虫,识别与信息指南》(AphidsontheWorldsCrops,AnIdentificationandInformationGuide),JohnWiley&Sons公司;纽约州纽约市)。蚜虫导致几乎所有农作物的重大经济损失,而且占估计由昆虫有害生物造成的农业产量损失的13%的很大一部分(埃姆登(vanEmdenH.)、哈灵顿(HarringtonR).《蚜虫作为农作物有害生物》(AphidsasCropPests).CABI出版社;英国伦敦:2007,p.717;法利亚(FariaC.A.)、瓦克斯(WackersF.L.)、普里查德(PritchardJ.)、巴雷特(BarrettD.A.)、Turlings(TurlingsT.C.).《Bt转基因玉米对蚜虫的高敏感性增强鳞翅目有害生物寄生蜂的性能》(HighsusceptibilityofBtmaizetoaphidsenhancestheperformanceofparasitoidsoflepidopteranpests).PLoSOne.2007;2:e600)。

水稻的两个主要有害生物,稻褐飞虱(BPH)(褐稻虱)和稻黑尾叶蝉(黑尾叶蝉属),造成水稻植物严重的生理损害,并且是经济重要的水稻东格鲁病毒、草矮病毒和齿叶矮缩病毒的载体(持田(Mochida)等人(1979)《筛选水稻抗病品种/品系对褐飞虱(Nilparvatalugens(飞虱科))的一些考虑》(SomeConsiderationsonScreeningResistantCultivars/LinesofRicePlanttotheBrownPlanthopper,NilparvataLugens(Stal)(Hom.,Delphacidae))。菲律宾洛斯巴尼奥斯:IRRI,pp.1-9;萨克塞纳(Saxena,R.C.)和可汗(Khan,Z.R.)(1989)《农业动物回顾》(Agri.Zool.Rev.),3,97-132)。一个在东南亚水稻增产发明的关键制约因素是水稻褐飞虱(BPH),其导致“蝉枯(hopperburn)”并且是病毒性疾病的载体。几个因素,包括稻飞虱的发展抵抗常见杀虫剂的能力和在稻田中的滥用杀虫剂造成的捕食与被捕食的关系的生态失衡,导致BPH死灰复燃。



技术实现要素:

提供了赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀有害生物活性的组合物和方法。特别地,提供了杀死或控制半翅目有害生物群体,特别是稻飞虱有害生物群体的方法。该方法包括使杀有害生物有效量的包含半翅目毒素(特别是飞虱毒素)的多肽接触半翅目有害生物。在不同实施例中,半翅目毒素包含SEQIDNO:3或4的氨基酸序列,或其杀有害生物有效的变体或片段。在一些实施例中,用于保护植物或其细胞免受半翅目有害生物群体,尤其是稻飞虱有害生物的方法包括在植物或其细胞中表达编码SEQIDNO:3或4的核酸序列,或其变体或片段,其中该核酸可操作地连接到能在植物细胞中指导该核酸表达的启动子。

进一步包括了在植物中增加产量的方法,该方法包括在大田种植植物或其种子,这些植物或种子在其基因组中稳定整合了包含可操作地连接到能在植物中指导该核酸表达的启动子的DNA构建体,其中该核酸编码SEQIDNO:3或4,或其杀有害生物有效的变体或片段。

本发明的组合物和方法可用于具有增强有害生物抗性或耐受性的生物体的生产中。这些生物体和组合物包括用于理想的农业用途的生物体。

详细说明

本发明描绘了用于调节生物体,尤其是植物或植物细胞的有害生物抗性或耐受性的方法。“抗性”是指有害生物(例如,昆虫)在吸收或与本发明多肽的接触后被杀死。“耐受性”是指有害生物的运动、摄食、繁殖、或其它功能方面的损害或降低。这些方法涉及用编码本发明的杀有害生物蛋白质的核苷酸序列转化生物。特别地,本发明的核苷酸序列可用于制备具有杀有害生物活性的植物和微生物。本文所描述的方法可用于控制或杀灭半翅目有害生物群体和用于生产对半翅目有害生物具有杀有害生物活性的组合物。

“杀有害生物毒素”或“杀有害生物蛋白质”是指一种毒素,该毒素对一种或多种半翅目有害生物有毒性活性,包括但不限于,草盲蝽,如西部牧草盲蝽(豆荚盲蝽)、牧草盲蝽(美洲牧草盲蝽)、和绿盲蝽(Lyguselisus);蚜虫,如桃蚜(Myzuspersicae)、棉蚜(Aphisgossypii),樱桃蚜或黑樱桃蚜虫(Myzuscerasi)、大豆蚜(AphisglycinesMatsumura);褐稻飞虱(褐稻虱)、稻黑尾叶蝉(黑尾叶蝉属)、白背飞虱(Sogatellafurcifera)和棕色的小褐飞虱(灰飞虱);以及椿象,如绿蝽(拟绿蝽)、棕色大理石纹蝽(茶翅蝽)、南方喜绿蝽(Nezaraviridula)、稻蝽(美洲稻蝽)、森林红蝽(Pentatomarufipes)、欧洲蝽(Rhaphigasternebulosa)、以及盾椿象(Troilusluridus)。杀有害生物蛋白质包括本披露的全长核苷酸序列推导的氨基酸序列,以及比全长序列短的氨基酸序列,这是由于可替换的下游起始位点的使用,或者由于加工产生具有杀有害生物活性的一个较短的蛋白质。加工可能发生在蛋白质被表达的生物体内,或在吸收蛋白质后的有害生物内。

在特定的实施例中,杀有害生物蛋白质包含如SEQIDNO:3或4所述的Axmi011蛋白质,以及其变体和片段。

因此,本文提供了用于杀灭或控制半翅目有害生物群体的方法,该方法包括使有害生物接触,或使有害生物暴露于包含本发明的杀有害生物毒素的组合物。

分离的核酸分子及其变体和片段

本发明的一个方面涉及分离的或重组的核酸分子,这些核酸分子包含编码杀有害生物蛋白质和多肽或其生物学活性部分的核酸序列,以及涉及以下核酸分子,这些核酸分子足以用作杂交探针来鉴定编码具有序列同源性区域的蛋白质的核酸分子。本文也包括了在本文其它地方定义的严格定义下能与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本文所用术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如,重组DNA、cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。该核酸分子可以是单链的,或是双链的,但优选地是双链的DNA。

“分离”或“重组”的核酸序列(或DNA)在此用于表示不再处于其天然环境中的核酸序列(或DNA),例如体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。在一些实施例中,分离的或重组的核酸是不含有天然侧接生物体基因组DNA中核酸(即位于该核酸5′端和3′端的序列)的序列(优选地蛋白编码序列),该生物体为该核酸来源。就本发明而言,当“分离的”用于表述核酸分子时,不包括分离的染色体。例如,在不同的实施例中,编码核酸分子的分离的δ-内毒素可包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列,该核苷酸序列天然侧接细胞基因组DNA中的核酸分子,该细胞为该核酸来源。在不同的实施例中,基本上无细胞材料的δ-内毒素蛋白包括具有小于约30%、20%、10%或5%(干重)的非δ-内毒素蛋白(在此又称之为“污染蛋白”)的蛋白制剂。

本发明编码蛋白质的核苷酸序列包含SEQIDNO:1和2所示的序列及其变体、片段和互补体。“互补体”是指与一个给定的核苷酸序列充分互补的核苷酸序列以至于它可以与该给定的核苷酸序列杂交,从而形成稳定的双链。用于杀有害生物蛋白质的相应的氨基酸序列是由SEQIDNO:3或4所示的核苷酸序列编码。

本发明还包括核酸分子,这些核酸分子是编码杀有害生物蛋白质的核苷酸序列的片段。“片段”是指编码杀有害生物蛋白质的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码杀有害生物蛋白质的具有生物活性的部分,或者它可以是用作使用下述方法的杂交探针或PCR引物的片段。作为编码杀有害生物蛋白质的核酸序列的片段的核酸分子,根据所期望的用途可包括至少大约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400个连续核酸,或高达存在于本文披露的编码杀有害生物蛋白质的全长核苷酸序列中的核苷酸数目。“连续的”核苷酸是指彼此紧邻的核苷酸残基。本发明的核苷酸序列片段编码蛋白片段,该蛋白片段保留杀有害生物蛋白质的生物学活性并且,因此,保留的杀有害生物活性。因此,这里也包括披露的多肽的生物活性片段。“保留活性”是指片段将具有杀有害生物蛋白质的杀有害生物活性的至少大约30%、至少大约50%、至少大约70%、80%、90%、95%或或更高。在一个实施例中,杀有害生物活性是杀鞘翅目活性。在另一个实施例中,杀有害生物活性是杀鳞翅目活性。在另一个实施例中,杀有害生物活性是杀线虫活性。在另一个实施例中,杀有害生物活性是杀双翅目活性。在另一个实施例中,杀有害生物活性是杀半翅目活性。用于测定杀有害生物活性的方法是本技术领域中所熟知的。参见,例如,Czapla与Lang(1990)《经济昆虫杂志》(J.Econ.Entomol.)83:2480-2485;安德鲁斯(Andrews)等人(1988)《生物化学杂志》(Biochem.J.)252:199-206;马罗内(Marrone)等人(1985)《经济昆虫杂志》(J.ofEconomicEntomology)78:290-293;以及美国专利号5,743,477;以及Heong等人(2013)《稻飞虱在毒理学和杀虫剂的抗药性监测的研究方法》(Researchmethodsintoxicologyandinsecticideresistancemonitoringofriceplanthoppers),第二版,菲律宾洛斯巴尼奥斯:国际水稻研究所,将其内容以其整体通过引用特此结合。

编码杀有害生物蛋白质的核苷酸序列的片段编码本发明蛋白质的生物活性部分,该片段编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300个连续的氨基酸,或达到本发明全长杀有害生物蛋白质中存在的所有氨基酸的数量。在一些实施例中,片段是蛋白质水解切割性片段。例如,蛋白质水解切割性片段可以具有涉及SEQIDNO:3或4的至少大约30个氨基酸、至少大约40个氨基酸、至少大约50个氨上基酸、至少大约100个氨基酸、至少大约120、大约130、大约140、大约150、大约160个氨基酸的N-端或C端截短。在一些实施例中,本文包含的片段是C-端结晶化区域去除的结果,例如,通过蛋白质水解,或通过在编码序列中终止密码子的插入。在一些实施例中,本文包含的片段是N-端信号肽(例如,SEQIDNO:4)去除的结果。N-端截短可以在N-端进一步包含蛋氨酸。

本发明优选的杀有害生物蛋白质是由与SEQIDNO:1-2的核苷酸序列足够一致性的核苷酸序列编码,或者杀有害生物蛋白质是与SEQIDNO:3或4所示的氨基酸序列足够一致的。“足够一致”是指氨基酸或核苷酸序列,使用标准参数利用本文描述的对齐程序,相比参考序列具有至少大约60%或65%序列同一性、大约70%或75%序列同一性、大约80%或85%序列同一性、大约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高的序列同一性。在本技术领域的普通技术人员都会认识到,这些值通过考虑密码子的简并性、氨基酸相似性,阅读框定位等,可以适当调整以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的百分比同一性,对这些序列进行了比对,以达到最佳比较效果。两个核酸的百分比同一性是这些序列共有相同位置的数目的函数(即,百分比同一性=相同位置的数目/位置总数(例如,重叠位置)x100)。在一个实施例中,两个序列具有相同长度。在另一个实施例中,百分比同一性跨整个参考序列(例如,本文披露的SEQIDNO:1-3中任一个的序列)来计算。使用与以下所述类似的技术,无论允许或不允许缺口,可以确定两个序列之间的百分比同一性。在计算百分比同一性时,典型地对精确匹配进行计算。一个缺口(即一个比对中的一个位置,其中一个残基在一个序列中存在但是在另一个序列中不存在)被视为具有不相同残基的一个位置。

两个序列之间的百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的一个非限制性的实例是卡林(Karlin)和阿尔丘尔(Altschul)(1990)《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:2264中的算法,如在卡林(Karlin)和阿尔丘尔(Altschul)(1993)《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.Am.)90:5873-5877中修订的)。这样一种算法被并入BLASTN和BLASTX程序,该程序是在阿尔丘尔(Altschul)等人(1990)《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)215:403。可以用BLASTN程序(分值=100,字长=12)进行BLAST核苷酸检索,以获得与本发明的杀有害生物性类似核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序(分值=50,字长=3)进行BLAST蛋白质检索,以获得与本发明的杀有害生物蛋白质同源的氨基酸序列。为了获得缺口比较对齐的目的,可以利用GappedBLAST(在BLAST2.0中),如Altschul等人描述在(1997)《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)25:3389。(Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389)所述可利用GappedBLAST。作为替代方案,可用PSI-Blast进行迭代检索以检测分子间的远源关系。参见上文阿尔丘尔(Altschul)等人(1997)。当利用BLAST、GappedBLAST以及PSI-Blast程序时,可使用相应程序(例如,BLASTX和BLASTN)的默认参数。对齐也可以通过检查手动进行。

用于比较序列的数学算法的另一非限制性实例是ClustalW算法(希金斯(Higgins)等人(1994)《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)22:4673-4680)。ClustalW比较序列并比对氨基酸或DNA序列的整体,并且因此可以提供关于完整氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法已被用于几种商业上可获得的DNA/氨基酸分析软件包中,例如载体NTI程序组(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)的ALIGNX模块。在使用ClustalW比对氨基酸序列后,可以评估百分比氨基酸同一性。可用于分析ClustalW比对的软件程序的非限制性实例是GENEDOCTM。GENEDOCTM(KarlNicholas)允许评价多个蛋白质之间氨基酸(或DNA)的相似性和同一性。用于比较序列的数学算法的另一个非限制性的实例是米勒和迈尔斯(1988)生物科学中的计算机应用4:11-17(MyersandMiller(1988)CABIOS4:11-17)的算法。这样的算法被结合到ALIGN程序(2.0版)中,它是GCG威斯康辛遗传学软件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage),版本10(可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥市9685斯克兰顿路(ScrantonRd.)的阿赛乐德公司(Accelrys,Inc.))的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时,可以使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分为12和缺口罚分为4。

除非另行说明,GAP版本10使用内得勒曼(Needleman)和文施(Wunsch)的算法(Needleman和Wunsch(1970)《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)48(3):443-453,将使用下列参数来确定序列同一性和相似性:核苷酸序列的同一性%和相似性%使用GAP权重=50,长度权重=3,以及nwsgapdna.cmp打分矩阵;氨基酸序列的同一性%权重或相似性%使用GAP权重=8,长度权重=2,以及BLOSUM62打分程序。也可采用等效程序。“等效程序”是指任何序列比对程序,当与GAP版本10产生的相应比对相比时,其对任何两个相关序列的对比产生相同的核苷酸残基匹配和相同的百分序列同一性。

本发明也包含各种核酸分子。编码核苷酸序列的杀有害生物蛋白质的“变体”包括本文披露的编码杀有害生物蛋白质但因为遗传密码的简并性而保守性不同的那些序列,和如上述讨论的足够一致性的那些。通过使用众所周知的分子生物学技术,例如聚合酶链式反应(PCR)和如下文概述的杂交技术,可以识别天然存在的等位基因变体。不同的核苷酸序列还包括通过合成衍生的核苷酸序列,这些通过合成衍生的核苷酸序列如通过使用定点诱变产生,但是仍编码如下文讨论的本发明披露的杀有害生物蛋白质。本发明所包括的不同蛋白质具有生物活性,即其继续拥有天然蛋白质所需的生物活性,即,杀有害生物活性。“保留活性”是指变体将具有天然蛋白质杀有害生物活性的至少大约30%、至少大约50%、至少大约70%或至少大约80%。用于测定杀有害生物活性的方法是本技术领域中所熟知的。参见,例如,Czapla与Lang(1990)《经济昆虫杂志》(J.Econ.Entomol.)83:2480-2485;安德鲁斯(Andrews)等人(1988)《生物化学杂志》(Biochem.J.)252:199-206;马罗内(Marrone)等人(1985)《经济昆虫杂志》(J.ofEconomicEntomology)78:290-293;以及美国专利号5,743,477;以及Heong等人(2013)《稻飞虱在毒理学和杀虫剂的抗药性监测的研究方法》(Researchmethodsintoxicologyandinsecticideresistancemonitoringofriceplanthoppers),第二版,菲律宾洛斯巴尼奥斯:国际水稻研究所,将其内容以其整体通过引用特此结合。

本技术领域的技术人员将进一步理解可以通过本发明的的核苷酸序列的突变而引入变化,以此导致编码的杀有害生物蛋白质的氨基酸序列的变化,而不改变蛋白质的生物活性。因此,分离的核酸分子的变体可以通过将一个或多个核苷酸取代、添加、缺失引入到本文披露的相应的核苷酸序列中来创造,以至于一个或多个氨基酸取代、添加或缺失被引入到编码的蛋白质。通过标准技术,例如定点诱变和PCR-介导的诱变,可以引入突变。这些核苷酸序列变体也包括在本发明中。

例如,保守的氨基酸取代可以在一个或多个预测的不重要氨基酸残基上进行。“不重要”氨基酸残基是可以从杀有害生物蛋白质的野生型序列改变,而没有改变生物活性,其中“重要”氨基酸残基是生物活性必需的。“保守的氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似的侧链的氨基酸残基的家族已在本技术领域中定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸:碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸),酸性侧链(例如,天冬氨酸、谷氨酸),不带电的极性侧链(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸),非极性侧链(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸),β-分支侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

氨基酸取代可以在保留功能的非保守区域进行。在一般情况下,不会对保守氨基酸残基,或驻留在保守基序的氨基酸残基进行这样的取代,其中这些残基对于蛋白质活性是重要的。保守的并且可能是蛋白质活性必不可少的残基的实例包括,例如,在对本发明的序列相似或相关的毒素的比对中包含的所有蛋白质之间一致的残基(例如,在同源蛋白质的比对中一致的残基)。保守的但可以允许保守的氨基酸取代并仍然保留活性的残基的实例包括,例如,与本发明的序列相似或相关的毒素的比对中包含的所有蛋白质之间仅具有保守性取代的残基(例如,在比对的同源性蛋白质中包含的所有蛋白质之间仅具有保守性取代的残基)。然而,在本技术领域的技术人员能理解功能性变异在保守性氨基酸残基中可以有轻微的保守或非保守的改变。

可替代地,通过沿着全部或部分的编码序列随机引入突变,例如通过饱和诱变,可以产生变体核苷酸序列,并且在得到的突变体中,可以筛选能够赋予杀有害生物活性的突变体以鉴别保留活性的突变体。诱变之后,可以重组表达编码的蛋白质并且可以通过标准的试验技术测定该蛋白质的活性。

使用例如PCR、杂交等方法可以鉴定相应的杀有害生物序列,这样的序列与本发明的序列基本上一致。参见,例如,Sambrook与Russell(2001)《分子克隆:实验手册》(MolecularCloning:ALaboratoryManual.)(冷泉港实验室出版社,纽约州冷泉港),以及Innis等人(1990)《PCR方案:方法和应用的指南》(PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications)(学术出版社(AcademicPress),纽约)。

在杂交方法中,可以使用杀有害生物的核苷酸序列的全部或部分来筛选cDNA或基因组文库。用于构建这些cDNA和基因组文库的方法是本领域普遍已知的,且披露在上文萨姆布鲁克和拉塞尔,2001(SambrookandRussell,2001)中。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸,且可以标有可检测的基团(例如32P)或其他任何可检测的标记,例如其他的放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。可以通过基于本文披露的已知杀有害生物蛋白质编码核苷酸序列,对合成寡核苷酸标记来制造用于杂交的探针。另外,可以使用基于在核苷酸序列或编码的氨基酸序列中保守的核苷酸或氨基酸残基设计的简并引物。探针典型地包括核苷酸序列区域,该核苷酸序列区域在严格条件下与本发明编码杀有害生物蛋白质的核苷酸序列的至少大约12、至少大约25、至少大约50、75、100、125、150、175、或200个连续核苷酸或其片段或变体杂交。杂交探针的制备的方法是本技术领域普遍已知的,并且披露在上文萨姆布鲁克和拉塞尔,2001(SambrookandRussell,2001)中,其通过引用结合在此。

例如,本文所披露的完整杀虫序列,或其一个或多个部分,可以被用作能够特异地与相应杀有害生物蛋白质类似序列和信使RNA杂交的探针。为了实现在多种条件下的特异性杂交,这些探针包含唯一的、且优选至少约10个核苷酸长或至少约20个核苷酸长的序列。这些探针可以用于通过PCR扩增来自选定生物体的对应杀有害生物序列。该技术可以用于从目的生物体分离附加的编码序列,或者作为确定生物体中是否存在编码序列的诊断性试验。杂交技术包括板化DNA文库的杂交筛选(斑块或克隆;参见,例如,萨姆布鲁克(Sambrook)等人(1989)《分子克隆:实验室手册》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第2版,冷泉港实验室出版社,纽约州冷泉港)。

因此,本发明包括用于杂交的探针,以及能够与本发明的核苷酸序列的所有或部分进行杂交的核苷酸序列(例如,至少大约300个核苷酸、至少大约400、至少大约400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、或达到本文披露的全长核苷酸序列)。可以在严格条件下进行这些序列的杂交。“严格条件”或“严格杂交条件”意指这样的条件,在该条件下探针将会与其靶序列杂交,其可检测程度高于与其它序列杂交的可检测程度(例如,至少高于

背景技术:
两倍)。严格条件是序列依赖的并且在不同情况下将是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性,可以鉴别出与探针100%互补的靶序列(同源探测)。作为替代方案,严格条件可调整以允许序列中的一些错配,使得检测出更低的相似度(异源探测)。通常,探针长度小于大约900个核苷酸,优选长度小于450个核苷酸。

典型地,严格条件将是以下条件,其中盐浓度在pH为7.0到8.3时为低于约1.5MNa离子,通常为大约0.01到1.0M钠离子浓度(或其他盐)并且短探针(例如,10到50个核苷酸)的温度为至少约30℃且长探针(例如,大于50个核苷酸)的温度为至少约60℃。也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现严格性条件。示例性低严格条件包括用30%-35%甲酰胺的缓冲溶液、1MNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸钠)于37℃杂交,以及在1X至2XSSC(20XSSC=3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中于50℃至55℃冲洗。示例性中等严格条件包括在40%-45%甲酰胺、1.0MNaCl、1%SDS中于37℃杂交,以及在0.5X至1XSSC中于55℃至60℃冲洗。示例性高严格条件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中于37℃杂交,以及在0.1XSSC中于60℃至65℃冲洗。冲洗缓冲液可以包含大约0.1%至大约1%SDS。通常杂交持续时间小于约24小时,通常约4至约12小时。

特异性典型地是指杂交后冲洗的功能,关键因素是最终冲洗解决方案的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交,Tm可以从梅尼克斯和沃尔(1984)分析生物化学138:267-284(MeinkothandWahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284)的等式大致估算:Tm=81.5℃+16.6(logM)+0.41(GC%)-0.61(%形式)-500/L;式中,M是单价阳离子的摩尔浓度,GC%是DNA中的鸟甙和胞嘧啶核苷酸的百分率,%形式是甲酰胺在杂交溶液中的百分率,并且L是碱基对中的杂交的长度。Tm是温度(在确定的离子强度和pH下),在此温度下,50%的互补靶序列与完全相配的探针杂交。每错配1%,Tm降低约1℃;因而,可调整Tm、杂交和/或冲洗条件至与预期同一性的序列杂交。例如,如果获得同一性≥90%的序列,Tm可以降低10℃。通常,严格条件被选择为比在确定的离子强度和pH下的特异序列及其补足物的热力学熔点(Tm)低大约5℃。然而,高度严格条件可以在比热力学熔点(Tm)低1℃、2℃、3℃或4℃下采用杂交和/或洗涤;中等严格条件可以在比热力学熔点(Tm)低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下采用杂交和/或洗涤;低严格条件可以在比热力学熔点(Tm)低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下采用杂交和/或洗涤。使用等式、杂交、洗涤组合物以及预期的Tm,普通专业技术人员将会理解,杂交和/或洗涤液条件严格性的变化属本质性描述。如果预期的错配度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液),优选是增加SSC浓度以便可以使用更高温度。核酸杂交的广泛指南可见于迪杰森(1993)生物化学和分子生物学实验技术一核酸探针杂交第2章第I部分(纽约爱思唯尔出版社)(Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartI,Chapter2(Elsevier,NewYork));以及奥苏贝尔等人编(1995)现代分子生物学技术,第2章(纽约格林出版社与威立交叉科学出版社)(Ausubeletal.,eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,Chapter2(GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork)。参见阿尔丘尔(Altschul)等人(1989)《分子克隆:实验室手册》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第2版,冷泉港实验室出版社,纽约州冷泉港)。

分离的蛋白质及其变体和片段

杀有害生物蛋白质也包括在本发明中。“杀有害生物蛋白质”是指具有在SEQIDNO:3或4中所示的氨基酸序列的蛋白质。生物活性部分的片段及其变体还被提供,并且可以被用于实践本发明的方法。“分离的蛋白”或“重组蛋白”是用于指一个蛋白,该蛋白不再在它的自然环境中,例如在体外或在一个重组细菌或植物宿主细胞中。

“片段”或“生物活性部分”包括多肽片段,这些多肽片段包含与SEQIDNO:3或4所示的氨基酸序列具有足够同一性的氨基酸序列,并且表现出杀有害生物活性。杀有害生物蛋白质的生物活性部分可以是多肽,即,例如,10、25、50、100、150、200、250、300、350或更多的氨基酸长度。这样的生物活性部分可以通过重组技术制备并用于杀有害生物活性的评估。用于测定杀有害生物活性的方法是本技术领域中所熟知的。参见,例如,Czapla与Lang(1990)《经济昆虫杂志》(J.Econ.Entomol.)83:2480-2485;安德鲁斯(Andrews)等人(1988)《生物化学杂志》(Biochem.J.)252:199-206;马罗内(Marrone)等人(1985)《经济昆虫杂志》(J.ofEconomicEntomology)78:290-293;以及美国专利号5,743,477;以及Heong等人(2013)《稻飞虱在毒理学和杀虫剂的抗药性监测的研究方法》(Researchmethodsintoxicologyandinsecticideresistancemonitoringofriceplanthoppers),第二版,菲律宾洛斯巴尼奥斯:国际水稻研究所,将其内容以其整体通过引用特此结合。如本文使用的,片段包括SEQIDNO:3或4的至少8个连续的氨基酸。但是本发明包括其它的片段,例如蛋白质中大于约10、20、30、50、100、150、200、250、300或更多的氨基酸长度的任何片段。

“变体”是指具有与SEQIDNO:3或4的氨基酸序列有至少约60%、65%、约70%、75%、约80%、85%、约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的蛋白质或多肽。变体也包括被与SEQIDNO:1-2的核酸分子或其互补链在严格条件下杂交的核酸分子编码的多肽。变体包括由于突变在氨基酸序列中不同的多肽。本发明所包括的变体蛋白质具有生物活性,即其继续拥有天然蛋白质预期的生物活性,即,保留杀有害生物活性。在一些实施例中,变体相对于天然蛋白质具有改善的活性。用于测定杀有害生物活性的方法是本技术领域中所熟知的。参见,例如,Czapla与Lang(1990)《经济昆虫杂志》(J.Econ.Entomol.)83:2480-2485;安德鲁斯(Andrews)等人(1988)《生物化学杂志》(Biochem.J.)252:199-206;马罗内(Marrone)等人(1985)《经济昆虫杂志》(J.ofEconomicEntomology)78:290-293;以及美国专利号5,743,477;以及Heong等人(2013)《稻飞虱在毒理学和杀虫剂的抗药性监测的研究方法》(Researchmethodsintoxicologyandinsecticideresistancemonitoringofriceplanthoppers),第二版,菲律宾洛斯巴尼奥斯:国际水稻研究所,将其内容以其整体通过引用特此结合。

细菌基因,例如本发明的axmi基因,通常在开放阅读框的起始点附近拥有多个蛋氨酸起始密码子。通常,在一个或多个这些起始密码子处的翻译起始将导致功能蛋白质的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而,细菌例如芽孢杆菌(Bacillussp.)也识别GTG作为起始密码子,并且在GTG密码子处起始翻译的蛋白质在第一氨基酸包括蛋氨酸。在很少的情况下,在细菌系统中的翻译可以在TTG密码子起始,尽管在这个情况下TTG编码蛋氨酸。此外,通常不确定这些密码子中的哪个先天地在细菌中被天然地利用。因此可以理解使用一个替代的蛋氨酸密码子也可以导致杀有害生物蛋白质的产生。这些杀有害生物蛋白质被包括在本发明中,并且可能在本发明的方法中被利用。应该理解的是,当在植物中表达时,有必要改变备用起始密码子为ATG以正确翻译。

在本发明的不同实施例中,杀有害生物蛋白质包括从本文披露的全长核苷酸序列推断的氨基酸序列,以及由于备用的下游起始位点的使用短于全长序列的氨基酸序列。

本发明的多肽或其变体或片段的抗体,也被包括。用于生产抗体的方法是本技术领域所熟知的(参见,例如,Harlow和Lane(1988)抗体:实验室手册,冷泉港实验室,纽约州冷泉港(HarlowandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY);美国专利号4,196,265)。

因此,本发明的一个方面涉及特异性地结合至一个或多个本发明的蛋白质或肽分子及其的同系物,融合物或片段的抗体、单链抗原结合分子、或其它的蛋白质。在一个具体地优选实施例中,该抗体特异性地结合至具有在SEQIDNO:3或4所示的氨基酸序列或其片段。在另一个实施例中,该抗体特异性地结合至融合蛋白,该融合蛋白包含选择自SEQIDNO:3或4所示的氨基酸序列或其片段的氨基酸序列。

本发明的抗体可用于定量或定性地检测本发明的蛋白质或肽分子,或用于检测蛋白质的翻译后修饰。如本文使用的,如果结合是不被非相关分子的存在竞争性地抑制,则成抗体或肽据说“特异性地结合”至本发明的蛋白质或肽分子。

改变的或改善的变体

应当认识到杀有害生物蛋白质的DNA序列可以通过各种方法来改变,并且这些改变可导致以下DNA序列编码蛋白,这些蛋白具有与由本发明的杀有害生物蛋白质编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列。这种蛋白可以以各种方式改变,包括SEQIDNO:3或4中的一个或多个氨基酸的氨基酸取代、缺失、截短、和插入,包括多达约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155、或更多的氨基酸取代、缺失或插入。这样操作的方法是本技术领域中所公知的。例如,杀有害生物蛋白质的氨基酸序列变体可以通过DNA中的突变制备。这可能是通过几种突变形式中的一种和/或在直接的进化中完成。在一些方面,在氨基酸序列中编码的改变将不会本质上影响蛋白质的功能。这样的变体将拥有预期的杀有害生物活性。然而,应了解杀有害生物蛋白质授予杀有害生物活性的能力可以被在本发明的组合物上使用这样的技术所改善。例如,可以在DNA的复制过程中表现出高比例的碱基错误插入的宿主细胞中表达杀有害生物蛋白质,如XL-1Red(Stratagene公司,加利福利亚州拉霍亚)。在这样的菌株中繁殖后,可以分离DNA(例如通过制备质粒DNA、或在载体中通过PCR和克隆扩增产生的PCR片段),在非突变菌株中培养杀有害生物蛋白质突变体,以及鉴别具有杀有害生物活性的突变基因,例如通过进行一个实验以测试杀有害生物活性。通常,该蛋白质被混合并用于饲喂试验。参见,例如马罗内(Marrone)等人(1985)《经济昆虫杂志》(J.ofEconomicEntomology)78:290-293。这样的试验可包括使一种或多种有害生物接触植物并确定该植物的存活和/或导致有害生物死亡的能力。导致毒性增加的突变的实例被描述在史涅夫(Schnepf)等人(1998)《微生物分子生物学评论》(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62:775-806。

可替代地,也可能对许多蛋白质的氨基或羧基端的蛋白质序列进行改变而本质上不影响活性。这可以包括通过现代分子生物学方法引入插入、缺失或改变,该现代生物学方法是例如PCR,包括PCR扩增,该PCR扩增凭借在PCR扩增中利用的寡核苷酸中包含氨基酸编码序列来改变或延伸蛋白质编码序列。或者,添加的蛋白质序列可以包括整个蛋白质的编码序列,例如在本技术领域中通常用来产生蛋白融合的那些。这样的融合蛋白质通常被用来(1)增加感兴趣的蛋白质的表达(2)引入结合结构域、酶活性、或抗原表位以促进蛋白质纯化、蛋白质检测或其它本技术领域已知的实验用途(3)靶标分泌或蛋白质翻译至亚细胞细胞器,例如革兰氏阴性菌的细胞周质间隙、或真核生物的内质网,后者通常导致蛋白质的糖基化。

本发明变体核苷酸和氨基酸序列也包括从突变和重组基因程序例如DNA改组衍生的序列。通过这样的程序,一个或多个不同的杀有害生物蛋白质编码区域可以被用来创造拥有预期的特性的新的杀有害生物蛋白质。以这种方式,从包含具有基本的序列同一性并可以在体外或体内同源重组的序列区域的相关序列多核苷酸群产生重组多核苷酸文库。例如,使用该方法,编码感兴趣的结构域的序列基序可以在本发明的杀有害生物基因和其它已知的杀有害生物基因之间改组,以获得编码具有改善的感兴趣特性的蛋白质的新基因,例如增加杀虫活性。用于这样的DNA改组的策略是本技术领域已知的。参见,例如,施特默尔(Stemmer)(1994)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91:10747-10751;施特默尔(Stemmer)(1994)《自然》(Nature)370:389-391;Crameri等人(1997)《自然生物技术》(NatureBiotech.)15:436-438;摩尔(Moore)等人(1997)《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)272:336-347);张等人(1997)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94:4504-4509;Crameri等人(1998)《自然》(Nature)391:288-291;以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

结构域交换或改组是产生改变的杀有害生物蛋白质的另一种机制。结构域可以在杀有害生物蛋白质之间进行交换,导致杂合或嵌合毒素具有改进的杀有害生物活性或目标光谱。用于产生重组蛋白并测试它们的杀有害生物活性的方法在本技术领域已熟知(参见,例如,Naimov等人(2001)《应用与环境微生物》(Appl.Environ.Microbiol.)67:5328-5330;deMaagd等人(1996)《应用与环境微生物》(Appl.Environ.Microbiol.)62:1537-1543;Ge等人(1991)《分子生物学杂志》(J.Mol.Chem.)266:17954-17958;史涅夫(Schnepf)等人,(1990)《分子生物学杂志》(J.Mol.Chem.)265:20923-20930;Rang等人,91999)《应用与环境微生物》(Appl.Environ.Microbiol.)65:2918-2925)。

载体

在感兴趣的植物中用于表达的表达盒中可以提供本发明的杀有害生物序列。“植物表达盒”意指能够引起来自植物细胞中的开放阅读框的蛋白质表达的DNA构建体。典型地这些包括启动子和编码序列。这些构建体通常还含有3'端非翻译区。这些构建体可以含有“信号序列”或“前导序列”,以促进肽向某些细胞内结构的共翻译或翻译后转运,这些结构为例如叶绿体(或其它质体)、内质网或高尔基体。

“信号序列”是指已知的或可能导致穿过细胞膜的共翻译或翻译后肽转运的序列。在真核细胞中,其典型地涉及向高尔基体中的分泌,有些会导致糖基化。细菌的杀虫毒素通常是合成的毒素,其实在目标有害生物的肠内水解蛋白激活(Chang(1987)《酶学方法》(MethodsEnzymol.)153:507-516)。在本发明一些实施例中,信号序列是位于天然的序列中,或可能是从本发明的序列衍生而来。“前导序列”是指在翻译时产生足以触发肽链向亚细胞细胞器共翻译转运的氨基酸序列的序列。因而,其包括通过进入内质网、液泡通道、包括叶绿体、线粒体等质体而靶向转运和/或糖基化的前导序列。

“植物转化载体”是指对于有效转化植物细胞必需的DNA分子。这样的分子可以包括一个或多个植物表达盒,且可以组织成一个以上“载体”DNA分子。例如,二元载体是使用2个非连续DNA载体编码转化植物细胞的所有必需的顺式和反式作用功能的植物转化载体(海伦斯和姆林内克斯(2000)植物科学发展趋势,5:446-451)(HellensandMullineaux(2000)TrendsinPlantScience,5:446-451)。“载体”是指设计成在不同的宿主细胞之间进行转移的核酸构建体。“表达载体”是指能在外来细胞中结合、整合和表达异源DNA序列或片段的载体。该盒将包括可操作地连接至本发明的序列的5’和/或3’调节序列。“可操作地连接”是指启动子和第二序列之间的功能连接,其中启动子序列启动并介导与第二序列相对应的DNA序列的转录。通常,可操作地连接意味着连接的核酸序列是毗邻的,且在需要连接两个蛋白编码区时这些连接的核酸序列是毗邻的并处在同一阅读框中,但并非总是如此。此外,盒可以含有至少一个附加基因以被共转化为生物体。作为替代方案,附加基因可以设置于多表达盒上。

在各种实施例中,本发明的核苷酸序列是可操作地连接至启动子,例如,植物启动子。“启动子”是指作用是引导下游编码序列转录的核酸序列。这些元件,连同其他转录和翻译调控核酸序列(也称“控制序列”),都是表达目的DNA序列所必需的。

这样的表达盒设有多个限制位点,用于在调控区的转录调控作用下插入杀有害生物序列。

该表达盒将包括在植物中5'-3'方向转录、转录和翻译起始区(即,启动子),本发明的DNA序列、以及翻译和转录终止区(即终止区)的功能。启动子可以是对于本发明的植物宿主和/或DNA序列天然的或类似的、或外来的或异源的。此外,启动子可以是天然的序列或者可选择地合成的序列。当启动子是对于植物宿主“天然”或“同源”的,它是指启动子在被导入所述启动子的天然植物中发现。当启动子是对于本发明的DNA序列“外来的”或“异源的”,它是指启动子对于本发明的可操作连接的DNA序列不是天然的或天然存在的启动子。

终止区域可以对转录起始区是天然的,可以对感兴趣的可操作地连接的DNA序列是天然的,可以对植物宿主是天然的,或者可能从另一来源衍生而来(即,对于启动子、感兴趣的DNA序列、植物宿主、或其任意组合外来的或异源的)。合适的终止区可以从根癌农杆菌的Ti-质粒得到,例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也参见Guerineau等人(1991)《分子基因与遗传学杂志》(J.Mol.Gen.Genet.262:141-144;Proudfoot(1991)《细胞》(Cell)64:671-674;Sanfacon等人(1991)《基因开发》(GenesDev.)5:141-149;MMogen等人(1990)《植物细胞》(PlantCell)2:1261-1272;Munroe等人(1990)《基因》(Gene)91:151-158;Ballas等人(1989)《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)17:7891-7903;以及Joshi等人(1987)《核酸研究》(NucleicAcidRes.)15:9627-9639。

在适当情况下,可优化一种或多种基因以增加在转化宿主细胞中的表达。也就是说,可以使用宿主细胞优选的密码子合成基因以改进表达,或者可以根据宿主优选的密码子使用频率用密码子合成基因。通常,基因的GC含量将增加。参见,例如,Campbell与Gowri(1990)《植物生理学》(PlantPhysiol.)92:1-11来讨论宿主优选的密码子使用。用于合成植物优选基因的方法是本技术领域已知的。参见,例如,美国专利号5,380,831与5,436,391,美国专利申请号20090137409,以及Murray等人(1989)《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)17:477-498,通过引用在此结合。

在一个实施例中,将杀有害生物蛋白质靶向定位在叶绿体中进行表达。以此方式,当杀有害生物蛋白质不是直接插入到叶绿体中时,表达盒将另外含有编码转运肽的核酸以引导杀有害生物蛋白质至叶绿体。这些转运肽是本领域已知的。参见,例如,VonHeijne等人(1991)《植物分子生物学导报》(PlantMol.Biol.Rep.Rep.)9:104-126;Clark等人(1989)《分子生物学杂志》(J.Mol.Chem.264:17544-17550;Della-Cioppa等人(1987)《植物生理学》(PlantPhysiol.)84:965-968;Romer等人(1993)《生物化学与生物物理研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)196:1414-1421;以及Shah等人(1986)《科学》(Science)233:478-481。

可以优化靶向定位至叶绿体的杀有害生物基因,以在叶绿体中表达,以说明在植物核和该细胞器之间的密码子使用差异。以此方式,可以使用叶绿体偏好的密码子合成目的核酸。参见例如,美国专利号5,380,831,其通过引用结合在此。

植物转化

本发明的方法涉及将核苷酸构建体引入植物。“引入”是指将核苷酸构建体提供给植物,其方式为使得构建体能够到达植物细胞的内部。本发明的方法不要求使用某个具体方法将核苷酸构建体引入植物,只要求核苷酸构建体能够到达植物的至少一个细胞的内部。本领域已知的用于将核苷酸构建体引入植物的方法包括但不限于稳定转化法、瞬间转化法以及病毒介导法。

“植物”指整个植物、植物器官(例如,叶、茎、根等)、种子、植物细胞、无性繁殖体、胚及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

“转基因植物”或“转化植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指已经将外源核酸序列或DNA片段结合到或整合到植物细胞中的植物。这些核酸序列包括那些外源的或者未转化的植物细胞中不存在的序列,以及那些或许是内源的或者未转化的植物细胞中或许已经存在的序列。“异源”通常是指如下核酸序列,其对于所在细胞或天然基因组的一部分不是内源的,且已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微映像等添加到细胞中。

本发明中的转基因植物表达了本文所披露的一个或多个新型毒素序列。在不同的实施例中,转基因植物进一步包括一个或多个抗虫性附加基因(例如,Cry1,诸如Cry1A、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1E以及Cry1F族中的成员;Cry2,诸如Cry2A族中的成员;Cry9,诸如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E以及Cry9F族中的成员;等等)。本领域的技术人员将会理解,转基因植物可以包括能够表达目的农艺性状的任何基因。

植物细胞的转化可以通过本领域内已知的多种技术之一实现。本发明的杀有害生物基因可以被修饰,以获得或增强在植物细胞中的表达。典型地,表达这样的蛋白的构建体会含有启动子以驱动基因转录,并含有3’非翻译区以使转录终止和多腺苷酸化。这些构建体的组织是本领域中公知的。在某些情况下,设计基因可以是有用的,使得分泌由此产生的肽,或以其他方式将其靶向定位在植物细胞内。例如,基因可利用工程方法加工使其含有信号肽,以促进肽向内质网的转移。还可以优选地加工植物表达盒,使之含有内含子,从而其表达需要内含子的mRNA加工。

“植物表达盒”典型地将被插入到“植物转化载体”。此植物转化载体可以包括实现植物转化所需要的一种或多种DNA载体。例如,本领域的通常作法是使用包括一个以上的连续DNA片段的植物转化载体。这些载体在本领域通常称为“二元载体”。二元载体以及带有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导转化,其中实现高效转化所需的DNA片段的大小和复杂度都是非常大的,且将功能分离到分离的DNA分子上是有利的。二元载体典型地含有质粒载体、可选标记和“目的基因”;质粒载体含有T-DNA转移(例如左边界和右边界)所需的顺式作用序列;可选标记设计成能在植物细胞中表达;“目的基因”指该基因设计成能在植物细胞中表达,以期形成一代转基因植物。此质粒载体上还存在细菌复制所需要的序列。顺式作用序列以适宜方式排列,使其能向植物细胞内有效转移并在细胞中表达。例如,可选择的标记基因和杀有害生物基因位于左右边界之间。通常,第二质粒载体含有反式作用因子,这些反式作用因子介导从农杆菌到植物细胞的T-DNA转移。此质粒通常含有毒性作用(病毒基因),使植物细胞被农杆菌属感染,并且通过在边界序列切割转移DNA以及使病毒介导DNA转移,这一点是在本领域了解的(海伦斯和姆林内克斯(2000)植物科学趋势,5:446-451)(HellensandMullineaux(2000)TrendsinPlantScience,5:446-451)。几种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等等)可以用于植物转化。对于通过其他方法转化植物,例如显微映像、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等等,第二质粒载体并非必要。

一般来说,植物转化方法涉及将异源DNA转移进入靶植物细胞(例如不成熟的或成熟的胚、悬浮培养物、无差别的愈伤组织、原生质,等等),接着是应用适当的选择(取决于可选择的标记基因)的最大阈值水平以从一组未转化成形的细胞团块恢复转化植物细胞。典型地,将外植体转移到新供应的相同培养基中,并常规培养。随后,在放置于补充最大阈值水平的选择试剂的再生培养基上之后,使转化细胞分化成嫩芽。然后将嫩芽转移到选择性生根培养基中,用于回收生根的嫩芽或小植株。转基因植株然后成长为成熟的植物并产生可育种子(例如Hiei等人(1994)《植物杂志》(ThePlantJournal)6:271-282;Ishida等人(1996)《自然生物技术》(NatureBiotechnology)14:745-750)。典型地,将外植体转移到新供应的相同培养基中,并常规培养。用于产生转基因植物的技术与方法的一般说明可参见艾尔斯和帕克(1994)植物科学评论性综述13:219-239(AyresandPark(1994)CriticalReviewsinPlantScience13:219-239)以及博米尼尼和裘哈(1997)玉米42:107-120(BommineniandJauhar(1997)Maydica42:107-120)。由于转化物质含有许多细胞;在任何一片目的愈伤组织或组织或细胞群中同时存在转化细胞和未转化细胞。杀死未转化细胞并允许转化细胞增殖产生转化植物培养物。通常,去除未转化细胞的能力限制转化植物细胞的快速恢复和转基因植物的成功生成。

转化方法和将核苷酸序列引入植物的方法可以进行靶向定位以便转化的植物或植物细胞的类型,即单子叶植物或双子叶植物而变化。可通过许多方法中的一种来生成转基因植物,这些方法包括但不限于显微注射、电穿孔、直接基因转移、通过农杆菌将异源DNA引入植物细胞(农杆菌介导转化)、用粘附于颗粒的异源外源DNA轰击植物细胞、弹道的颗粒加速、气溶胶束转化(美国公布申请号20010026941、美国专利号4,945,050、国际公布号WO91/00915、美国公布申请号2002015066)、Lec1转化以及转化DNA的其他不同的非微粒直接介导方法。

转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见,例如,Svab等人(1990)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:8526-8530;Svab与Maliga(1993)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:913-917;Svab与Maliga(1993)《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBOJ.)12:601-606。该方法依赖于基因枪递送含有选择标记的DNA,且通过同源重组将DNA靶向定位到质体基因组中。另外,通过对核编码的、质体定位RNA聚合酶的组织偏爱型表达,实现沉默质体载行转基因的反式激活,可以完成质体转化。这样的系统已经被报道于McBride等人(1994)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91:7301-7305。

异源的外来DNA整合到植物细胞中后,然后在培养基中选择时应用最大阈值水平,以杀死未转化细胞,并通过定期地转移到新鲜培养基中,分离和繁殖能在该选择处理中存活并推定已转化的细胞。通过连续传代和用合适选择挑战,可以鉴别和繁殖经质粒载体转化的细胞。然后,可以用分子和生物化学方法来确认异源的目的基因是否整合到转基因植物的基因组中。

可根据常规方法将已经转化的细胞培养成植物。参见,例如,McCormick等人(1986)《植物细胞报告》(PlantCellReports)5:81-84。之后这些植物生长,并且用相同的转化品系或不同的品系对它授粉,并且所得的杂种具有鉴定的所需表型特征组成型表达。可以培养两代或多代,以确保理想表型特征的表达得到稳定维持和遗传,然后收获种子,以确保已经实现了理想表型特征的表达。以此方式,本发明提供了具有稳定地结合到在其基因组中的本发明核苷酸构建体(例如本发明的表达盒)的转化种子(也称作“转基因种子”)。

植物转化的评估

将异源的外来DNA引入植物细胞后,通过不同的方法,例如分析核酸或蛋白质以及与整合的基因有关的代谢物,可以确认异源基因在植物基因组中的转化或整合。

PCR分析是在移植到土壤中之前的早期阶段,筛选转化的细胞、组织或芽是否存在所结合的基因的快速方法(萨姆布鲁克和拉塞尔,2001,分子克隆:实验手册,纽约冷泉港冷泉港实验室出版社)(SambrookandRussell,2001.MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。使用对目的基因或农杆菌载体背景等具有特异性的寡核苷酸引物进行PCR。

可以通过基因组DNA的Southern印迹分析确认植物转化(上文萨姆布鲁克和拉塞尔,2001(SambrookandRussell,2001))。一般而言,从转化体中提取总DNA,用合适的限制酶消化,在琼脂糖凝胶上分级分离,并转移到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后根据标准技术(上文萨姆布鲁克和拉塞尔,2001(SambrookandRussell,2001)),用例如放射标记的32P靶DNA片段探测膜或“印迹”,以确认所引入的基因在植物基因组中的整合。

做Northern印迹分析时,按照本领域常规使用的标准程序(上文萨姆布鲁克和拉塞尔,2001(SambrookandRussell,2001)),将RNA从转化体的特定组织中分离,在甲醛琼脂糖凝胶中分级分离,印迹到尼龙滤膜上。然后使用本技术领域已知的方法(上文萨姆布鲁克和拉塞尔,2001(SambrookandRussell,2001)),通过使滤膜与源自于杀有害生物基因的放射性探针杂交,检测杀有害生物基因编码的RNA的表达。

蛋白质印迹、生物化学检验等可对转基因植物进行,使用结合到存在于杀有害生物蛋白质的一个或多个表位上的抗体通过标准程序(上文萨姆布鲁克和拉塞尔,2001(SambrookandRussell,2001))以确认杀有害生物基因编码的蛋白质的存在。

植物中的杀有害生物活性

本发明的另一个方面,可以产生表达具有杀有害生物活性的杀有害生物蛋白质的转基因植物。上述通过实例的方式描述的方法可以被用来产生转基因植物,但该产生转基因植物细胞的方式对本发明不是决定性的。本技术领域已知的或描述的方法例如农杆菌介导的转化、基因枪转化、和非颗粒介导的方法可以根据实验者的判断力来使用。表达杀有害生物蛋白质的植物可以通过本技术领域中描述的通用方法来分离,例如通过愈伤组织转化、转化愈伤的选择、以及从这样的转基因愈伤产生可育的植物。在这样的过程中,可以使用任何基因作为可选择的标记,只要它在植物中的表达赋予鉴别和选择转化细胞的能力。

已经开发了很多标记用于植物细胞,例如抵抗氯霉素、氨基糖苷G418、潮霉素等等。编码涉及叶绿体代谢物的产物的其它基因也可以被用作可选择的标记。例如,对植物除草剂例如草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮提供抗性的基因可以发现特定用途。这样的基因已经被报道(斯托克(Stalker)等人(1985)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)263:6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因);以及Sathasivan等人(1990)《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)18:2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。另外,本文披露的基因可用作评估细菌或植物细胞转化的标记。用于在植物、植物器官(例如,叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚胎或其子代中检测转基因的存在的方法在本技术领域中是熟知的。在一个实施例中,转基因的存在是通过测试杀有害生物活性来检测。

表达杀有害生物蛋白质的可育植物可以用于杀有害生物活性测试,并且选择显示出最佳活性的植物用于进一步育种。方法是本技术领域可用的以测定有害生物活性。通常,该蛋白质被混合并用于饲喂试验。参见,例如马罗内(Marrone)等人(1985)《经济昆虫杂志》(J.ofEconomicEntomology)78:290-293。

本发明可以用于任何植物种的转化,包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的实例包括但不限于玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜、芸苔属、苜蓿、黑麦、粟类、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、可可、茶叶、香蕉、油桃、无花果、番石榴、芒果、橄榄、木瓜、腰果、澳洲坚果、杏、燕麦、蔬菜、观赏植物以及针叶树。

蔬菜包括但不限于番茄、莴苣、青豆、菜豆、豌豆以及香瓜属的成员(例如黄瓜、哈密瓜以及甜瓜)。观赏植物包括但不限于杜鹃花、锈球花、芙蓉、玫瑰、郁金香、黄水仙、矮牵牛、康乃馨、一品红以及菊花。优选地,本发明的植物是作物植物(例如,玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科的植物、胡椒、土豆、棉花、稻谷、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜等等)。

在杀有害生物控制方面的用途

用于采用包括本发明的核苷酸序列或其变体的菌株在有害生物控制或工程化其他生物作为杀有害生物剂的一般方法是本技术领域已知的。参见例如,美国专利号5,039,523和EP0480762A2。

含有本发明的核酸序列或其变体的芽孢杆菌菌株、或遗传学上被改变成包含本发明的杀有害生物基因和蛋白质的微生物可用于保护农作物和产品防御有害生物。在本发明的一方面,当细胞应用于一种或多种目标有害生物的环境时,生产毒素(杀有害生物剂)的生物体的完整的即未裂解的细胞使用延长细胞中生产的毒素的活性的试剂处理。

可替代地,杀有害生物剂是通过将杀有害生物基因引入到细胞宿主来产生。杀有害生物基因的表达直接或间接地导致杀有害生物剂在细胞内生产和保持。在本发明的一个方面,当细胞应用于一种或多种目标有害生物的环境时,然后在延长在细胞中生产的毒素的活性的条件下处理这些细胞。产生的产物保留了毒素的毒性。这些天然封装的杀有害生物剂然后可依照常规技术配制用于具有目标有害生物的环境,例如,土壤、水和植物的叶子。参见,例如EPA0192319,并在此引用参考。可替代地,可配制表达本发明的基因的细胞以至于允许应用生成的物质作为杀有害生物剂。

本发明的活性成分通常是以组合物的形式应用,并且可以同时或相继地与其他化合物应用于要处理的作物区或植物。这些化合物可以是肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、杀虫皂、休眠油、聚合物、和/或定时释放或生物可降解的载体配制品,其允许单一应用该配制品后一个靶标区域的长期给药。它们还可以是选择性除草剂、化学杀虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀有害生物剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、或几种这些制剂的混合物,如果需要的话,进一步与农业上可接受的载体、表面活性剂或应用促进佐剂习惯一起应用于本制剂技术领域中。合适的载体和佐剂可以是固体或液体,并对应在配制技术中通常所用的物质,例如天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。同样地,这些配制品可以制备成可食用的“诱饵”或塑造成有害生物“陷阱”,以允许杀有害生物配制品的靶标有害生物摄食或消化。

应用本发明的活性成分或包含本发明的细菌菌株产生的至少一种杀有害生物蛋白质的本发明的农艺化学组合物的方法包括叶应用、种子包衣和土壤应用。应用的数量和应用比例取决于被对应有害生物侵染的强度。

该组合物可以配制成粉剂、粉尘、小球、颗粒、喷雾剂、乳剂、胶体、溶液、或诸如此类,并且可以通过常规方法如干燥、冷冻干燥、匀浆、提取、过滤、离心、沉降、或浓缩包含该多肽的细胞培养物来制备。在包含至少一种这样的杀有害生物多肽的所有这些组合物中,多肽可以以约1%的至约99%浓度(重量)存在。

半可以通过本发明的方法在给定的区域杀死半翅目有害生物或减少其数量,或者可以预防性地应用于环境区域以防止易感有害生物的侵染。优选是有害生物摄取或接触杀有害生物有效量的多肽。“杀有害生物有效量”是指能够对至少一种有害生物致死,或显著地减少有害生物生长、摄食、或正常的生理发育的杀有害生物剂的量。此量将根据这些因子改变,例如,待控制的特定的目标有害生物、特定的环境、位置、植物、作物、或待处理的农业现场、环境条件、以及杀有害生物有效的多肽组合物的方法、比率、浓度、稳定性、和应用的数量。这些配制品还可以相对于气候条件、环境考虑和/或应用的频率和/或有害生物侵染的严重性而变化。

所述的杀有害生物剂组合物可通过配制细菌细胞、晶体和/或孢子悬液,或具有预期的农业上可接收的载体的分离蛋白质组分而制成。这些组合物可以在施用前以适当方法如冻干、冷冻干燥、脱水、或在水性载体、介质或适合的稀释剂如生理盐水或其他缓冲液中配制。配制的组合物可以是以粉尘或颗粒材料的形式,或在油(植物或矿物)中的悬浮液的形式,或水或油/水乳剂的形式,或作为可湿性粉剂的形式,或与合适农业应用的任何其他载体材料组合的形式。合适的农业载体可以是固体或液体,并且在本技术领域中是熟知的。术语“农业上可接受的载体”涵盖了那些通常在杀有害生物剂配制技术中所用的所有的佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等;这些是在杀虫剂制剂领域的技术人员熟知的。这些配制品可与一种或多种固体或液体佐剂混合并通过各种方法,例如使用常规制剂技术和合适的佐剂通过均匀混合、搅拌和/或研磨杀有害生物组合物以制备。合适的配制品和应用方法被描述在美国专利号6,468,523中,通过引用在此结合。

半翅目有害生物,包括但不限于,草盲蝽,如西部牧草盲蝽(豆荚盲蝽)、牧草盲蝽(美洲牧草盲蝽)、和绿盲蝽(Lyguselisus);蚜虫,如桃蚜(Myzuspersicae)、棉蚜(Aphisgossypii),樱桃蚜或黑樱桃蚜虫(Myzuscerasi)、大豆蚜(AphisglycinesMatsumura);褐稻飞虱(褐稻虱)、稻黑尾叶蝉(黑尾叶蝉属)、白背飞虱(Sogatellafurcifera)和棕色的小褐飞虱(灰飞虱);以及椿象,如绿蝽(拟绿蝽)、棕色大理石纹蝽(茶翅蝽)、南方喜绿蝽(Nezaraviridula)、稻蝽(美洲稻蝽)、森林红蝽(Pentatomarufipes)、欧洲蝽(Rhaphigasternebulosa)、以及盾椿象(Troilusluridus)。在一些实施方案中,半翅目有害生物是稻飞虱有害生物,如褐飞虱。

增加植物产量的方法

提供了增加植物产量的方法。该方法包括:提供植物或植物细胞,该植物或植物细胞表达编码本文披露的杀有害生物多肽序列的多核苷酸,并且种植植物或其种子在大田,该大田感染了(或易感染)该多肽对其具有杀有害生物活性的有害生物。在一些实施例中,本文描述的Axmi011多肽具有抗半翅目有害生物的杀有害生物活性,并且该大田感染了该半翅目有害生物。在不同的实施例中,半翅目有害生物是稻飞虱有害生物,如褐飞虱(褐稻虱)。如本文所定义的,植物的“产量”是指植物生产的生物量的质量和/或数量。“生物量”是指任何测得的植物产品。生物量产量的增加是测量的植物产品的产量的任何提高。增加植物产量有几个商业应用。例如,增加植物叶片的生物量可以增加绿叶蔬菜的产量供人类或动物消费。此外,增加的叶生物量可用于增加植物源性制药或工业产品的产量。产量的增加可以包括任何统计上显著的增加,包括但不限于,相比不表达杀有害生物序列的植物在产量上增加至少1%、至少3%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少70%、至少100%、或更多。在具体方法上,植物产量的提高是由于表达本文披露的杀有害生物蛋白质的植物的有害生物抗性增加。杀有害生物蛋白质的表达导致有害生物感染或摄食能力降低。

植物也可以用一种或多种化学组合物,包括一种或多种除草剂、杀虫剂或杀真菌剂处理。典型的化学组合物包括:水果/蔬菜除草剂:莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草铵磷、氯吡延命菊、百草枯、戊炔草胺、稀禾定、氟丙嘧草酯、氯吡、茚嗪氟草胺;水果/蔬菜杀虫剂:涕灭威、苏云金杆菌、西维因、呋喃丹、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿维菌素、氟氯氰菊酯/高效氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、高效氯氟氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、氟酰脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、螺螨酯、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、溴氰虫酰肼、杀铃脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氟虫酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、腈吡螨酯(cyenopyrafen)、噻虫胺、噻虫嗪、斯诺托姆(spinotoram)、硫双威、氟啶虫酰胺、灭虫威、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、茚虫威、苯线磷、吡丙醚、苯丁氧化物;水果/蔬菜杀真菌剂:唑嘧菌胺、嘧菌酯、苯噻菌胺酯、啶酰菌胺、克菌丹、多菌灵、百菌清、铜、氰霜唑、环氟菌胺、霜脲氰、环唑醇、嘧菌环胺、苯醚甲环唑、烯酸吗啉、二氰蒽醌、咪唑菌酮、环酰菌胺、氟啶胺、咯菌腈、氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、灭菌丹、三乙膦酸、异菌脲、异丙菌胺、异皮姆、醚菌酯、代森锰锌、双块酉先菌胺、甲霜灵/精甲霜灵、代森联、苯菌酮、腈菌唑、戊菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、霜霉威、丙环唑、丙森锌、碘喹唑酮、丙硫菌唑、唑菌胺酯、嘧霉胺、喹氧、螺环菌胺、硫、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯;谷物除草剂:2,4-D、酰啼磺隆、溴苯腈、氟酮唑草-E、绿麦隆、氯磺隆、块草酸-P、二氯吡啶酸、麦草畏、禾草灵-M、吡氟草胺、精恶唑禾草灵、双氟横草胺、氟卡巴腙-NA、氟噻草胺、氟啶嘧磺隆-M、氟草烟、弗勒泰蒙、草甘膦、碘甲磺隆、碘苯腈、异丙隆、MCPA、甲磺胺磺隆、甲磺隆、二甲戊乐灵、唑啉草酯、丙氧基卡巴腙、苄草丹、甲氧磺草胺、磺酰磺隆、噻吩磺隆、肟草酮、醚苯磺隆、苯磺隆、氟乐灵、三氟甲磺隆;谷物杀真菌剂:嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、环氟菌胺、环唑醇、嘧菌环胺、醚菌胺、氟环唑、苯锈、丁苯吗啉、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟喹唑、氟唑菌酰胺、异皮姆、醚菌酯、叶菌唑、苯菌酮、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鲜胺、丙环唑、碘喹唑酮、丙硫菌唑、唑菌胺酯、喹氧、螺环菌胺、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯;谷物杀昆虫剂:乐果、λ-三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、顺式氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、毒死蜱、抗蚜威、灭虫威、氟啶虫胺腈;玉米除草剂:莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S-)噻吩草胺、草铵膦、草甘膦、异氟草、(S-)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰氨磺隆、苯唑草酮、特波三酮、嘧啶肟草醚、噻酮磺隆、氟噻草胺、比莎留锋(Pyroxasulfon);玉米杀昆虫剂:克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、高效氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、甲螨酯、氟虫酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、丁基嘧啶磷、乙虫腈、溴氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素;玉米杀真菌剂:嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、环唑醇、醚菌胺、氟环唑、种衣酯、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、异皮姆、叶菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙环唑、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、肟菌酯;水稻除草剂:丁草胺、敌稗、四唑喃磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草、杀草隆、四唑酸草胺、咪唑横隆、苯噻草胺、恶嗪草酮、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、杀草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酸草胺、氯吡嘧磺隆、噁嗪草酮、双环磺草酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚,丙炔恶草酮、乙氧嘧磺隆、丙草胺、甲基磺草酮、特糠酯酮、恶草灵、精恶唑禾草灵、比密苏凡(Pyrimisulfan);水稻杀昆虫剂:二嗪磷、仲丁威、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫胺、乙虫腈、氟虫酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、溴氰虫酰胺、多杀菌素、斯诺托姆(spinotoram)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、高效氯氰菊酯、毒死蜱、醚菊酯、克百威、丙硫克百威、氟啶虫胺腈;水稻杀真菌剂:嘧菌酯、多菌灵、环丙酰菌胺、双氯氰菌胺、苯醚甲环唑、克瘟散、嘧菌腙、庆大霉素、己唑醇、恶霉灵、异稻瘟净(IBP)、稻瘟灵、异噻菌胺、春雷霉素、代森锰锌、苯氧菌胺、肟醚菌胺、戊菌隆、噻菌灵、丙环唑、丙森锌、咯喹酮、戊唑醇、甲基托布津甲基、參酰菌胺、三环唑、肟菌酯、井冈霉素;棉花除草剂:敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、吡氟禾草灵、草甘膦、达草灭、二甲戊乐灵、嘧草硫醚、三氟啶磺隆、吡喃草酮、草铵膦、丙炔氟草胺、噻苯隆;棉花杀昆虫剂:乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死稗、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿维菌素、啶虫脒、甲维盐、吡虫啉、茚虫威、λ-氯氟氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氟虫酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氟虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、斯诺托姆(spinotoram)、γ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、砜虫啶;棉花杀昆虫剂:嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、铜、环唑醇、苯醚甲环唑、醚菌胺、氟环唑、咪唑菌酮、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、异菌脲、吡唑萘菌胺、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰、苯氧菌胺、吡噻菌胺、啶氧菌酯、甲基代森锌、丙硫菌唑、唑菌胺酯、五氯硝基苯、戊唑醇、氟醚唑、甲基硫菌灵、肟菌酯;大豆除草剂:甲草胺、苯达松、氟乐灵、氯嘧磺隆、氯酯磺草胺、精恶唑禾草灵、氟磺胺草醚、吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊乐灵、吡喃草酮、草铵膦;大豆杀昆虫剂:λ-氯氟氰菊酯、灭多威、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氟虫酰胺、氯虫酰胺、溴氰虫酰胺、多杀菌素、斯诺托姆(spinotoram)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀铃脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯;大豆杀真菌剂:嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、铜、环唑醇、苯醚甲环、醚菌胺、氟环唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、粉唑醇、氟唑菌酰胺、异皮姆、扑海因、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰、叶菌唑、苯氧菌胺、腈菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙环唑、丙森锌、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、氟醚唑、甲基硫菌灵、肟菌酯;甜菜除草剂:氯草敏、甜菜安、甜菜呋、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、氟胺磺隆、吡喃草酮、精喹禾灵;甜菜杀昆虫剂:吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ-/λ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、塞斯比(Cyaxypyr)、氟虫腈、克百威;卡诺拉除草剂:二氯吡啶酸、禾草灵、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐胺苯磺隆、喹草酸、精喹禾灵、烯草酮、吡喃草酮;卡诺拉杀真菌剂:嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、环唑醇、苯醚甲环、醚菌胺、氟环唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟硅唑、氟唑菌酰胺、扑海因、异皮姆、甲哌鎓、叶菌唑、苯氧菌胺、多效唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鲜胺、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯、乙烯菌核利;卡诺拉杀昆虫剂:克百威、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ和λ-氯氟氰菊酯、τ-弗沃勒瑞特(tau-Fluvaleriate)、乙虫腈、多杀菌素、斯诺托姆(spinotoram)、氟虫酰胺、氯虫酰胺、溴氰虫酰胺、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。

以下实例是举例说明而不是任何形式的限制。

实验实例

实例1.Axmi011的表达与活性

Axmi011基因(SEQIDNO:1)是从苏云金杆菌菌株(从美国农业部的ARS培养物富集)中分离,并且描述在美国专利出版物20080070829。AXMI011氨基酸序列(SEQIDNO:3)与Mtx2具有23%的序列同一性。

全长Axm011与截短版的Axm011(编码推定的信号序列的核苷酸序列被去除并被编码蛋氨酸的N-末端密码子替代)被表达并分析生物活性。截短的Axmi011蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。该基因的PCR扩增使用5’端带有NotI接头和3’端带有的AscI接头的引物和Herculase聚合酶。扩增的PCR产物用AscI和NotI消化,并连接入pMalC4X载体以产生质粒pAX7606。该克隆通过测序确认并且将转化进pAX7606在BL21感受态细胞中。每个的单菌落接种在LB培养基中,并在37℃生长直到对数期,并在16℃下用1.0mMIPTG诱导16小时。按照标准实验指南,纯化的Axmi011和截短的Axmi011被提交进行针对选择的有害生物的生物测定。使用Axmi011和截短的Axmi011针对褐飞虱(BPH)都证明严重矮化和大于75%的死亡率。

实例2.运载基因用于植物表达

本发明的编码区与合适的启动子和终止子序列连接以便在植物中表达。这样的序列在本技术领域已熟知。用于产生和确认启动子-基因-终止子构建体的技术也是本技术领域中熟知的。

在本发明的一个方面,设计和产生合成的DNA序列。这些合成的序列相对于亲本序列具有改变的核苷酸序列,但是编码的蛋白质本质上与亲本序列相同。在一些实施例中,合成的DNA序列包含SEQIDNO:2。

在本发明的另一个方面,设计修饰版本的合成基因以至于产生的肽被靶向至植物细胞器,如内质网或质外体。已知导致融合蛋白靶向至植物细胞器的肽序列在本技术领域是已知的。例如,来自白羽扇豆(Lupinusalbus)的酸性磷酸酶基因的N-末端区域(IDGI:14276838,Miller等人(2001)《植物生理学》(PlantPhysiology)127:594-606)是本技术领域公知的导致异源蛋白质的内质网靶向。如果产生的融合蛋白在C-末端还包含内质网滞留序列(该内质网滞留序列包含肽N-末端-赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(即“KDEL”基序,SEQIDNO:5)),该融合蛋白将靶向内质网。如果融合蛋白在C-末端缺乏内质网靶向序列,该蛋白质将被靶向至内质网,但最终将被隔离在质外体。

因此,这个基因编码融合蛋白,该融合蛋白包含酸性磷酸酶基因的N-末端31个氨基酸(来自白羽扇豆白羽扇豆(Lupinusalbus)(IDGI:14276838,上文,Miller等人,2001))融合至本发明的氨基酸序列的N-末端,并且在C-末端包含KDEL(SEQIDNO:5)序列。因此,产生的蛋白质在植物细胞中表达后被预测为靶向至内质网。

上文描述的植物表达盒与合适的植物可选择标记结合以帮助转化细胞和和组织的选择,并连接到植物转化载体中。这些可以包括来自农杆菌介导的转化的二元载体或用于喷气溶胶或基因枪转化的简单质粒载体。

在本发明中,表达盒包括编码Axmi011(SEQIDNO:2)的合成基因可操作地连接到水稻(Oryzasativa)的蔗糖合成酶1基因的启动子区域(Wang等人(1992)《植物分子生物学》(PlantMolecularBiology),19,881-885)或花椰菜花叶病毒35S转录物的启动子区域(Odell等人(1985)《自然》(Nature)313,810-812)和矮牵牛(Petuniahybrid)的叶绿素a/b结合蛋白基因的前导序列(Harpster等人(1988)《分子及普通遗传学》(MolecularandGeneralGenetics)212,182-190)。表达盒进一步包含来自pTiT37的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3’非翻译区(Depicker等人(1982)《分子及应用遗传学杂志》(JournalofMolecularandAppliedGenetics)1,561-573),其可操作地连接至Axmi011序列的3'末端。

实例4.水稻的转化

从在温室条件下生长的供体植物中收集未成熟的水稻种子(包含在正确的发育阶段的胚胎)。种子的消毒后,切除未成熟的胚胎并在固体培养基上预诱导3天。预诱导后,胚胎在具有预期的载体的农杆菌悬浮液中浸泡几分钟。然后胚胎被共培养在含有乙酰丁香酮的固体介质中并暗培养4天。然后外植体被转入含有草胺膦作为选择剂的第一选择性培养基。大约3周后,具有愈伤组织发育的角质鳞片被切割成多个小块,并转移到相同的选择性培养基。大约每2周进行随后的传代培养。在每次传代培养后,生长活跃的愈伤组织被切成更小的片并培养在一个第二选择性培养基上。经过几个星期后,对草丁膦具有明显抗性的愈伤组织被转移到选择性再生培养基。产生的植株被培养在半强度MS下以便完全伸长。将植物最终转移至土壤,并在温室中生长。

说明书中提到的所有出版物和专利申请都表明了本发明相关领域技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请以相同程度通过引用结合在此,如同这些出版物或专利申请中的每一个都是特定地和单独地通过引用结合在此的。

尽管为了清楚地理解,本发明通过说明和实例加以详细描述,显而易见的是,可以在随附的权利要求书的范围内作出一定的改变和修改。

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