一种牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻和直接移植方法

文档序号:305608阅读:647来源:国知局
一种牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻和直接移植方法
【专利摘要】本发明提供一种牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻和直接移植方法,属于胚胎低温生物学【技术领域】。本发明方法包括:(1)牛胚胎冷冻用细管中先加入一段解冻液,然后装入一段空气;(2)装入一段冷冻液,再装入一段空气;(3)装入一段冷冻液,并在该段冷冻液中置入牛胚胎,再装入一段空气;(4)装入一段解冻液并封闭管口,冷冻;(5)甩管解冻,直接移植;冷冻液为含有EG、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液,解冻液为含FBS的mPBS溶液。本发明方法操作简便,对操作人员技术要求不高,冷冻后的牛胚胎甩管解冻后可直接移植,解冻后的胚胎存活率100%,扩张率94%,移植后妊娠率达57%,是一种高效、简便易行的方法,适用于产业化推广。
【专利说明】一种牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻和直接移植方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物胚胎冷冻保存及胚胎移植【技术领域】,具体地涉及一种牛胚胎玻璃 化冷冻甩管解冻和直接移植方法。

【背景技术】
[0002] 自从Rail等(1985)发明胚胎玻璃化冷冻保存方法以来,使冷冻勿需借助冷冻仪, 可在室温下进行操作,程序得到极大地简化。后经许多研宄者的改进,目前卵母细胞/胚胎 的玻璃化冷冻方法仅需1分钟左右即可完成一个程序。在此过程中,许多研宄者创造性地 发明了许多冷冻的承载物体,并被命名为多种方法。如今常用的主要有以下几种方法:尼龙 环玻璃化法(Cryoloop)、开放式拉管法(OPS,Open Pulled Straw)、微细玻璃管法(GMP)、微 滴法(Microdrops)、半细管法(hemi-straw)。但上述方法在应用中仍存在着诸多的问题, 如:尼龙环玻璃化法一次冷冻卵母细胞/胚胎数量有限,且需要特殊的冷冻管固定装置才 易于长期保存。开放式拉管法(OPS)由于细管重量较轻,冷冻时易漂浮在液氮面,且该方法 的细管管壁较薄,易断裂,在液氮中极易断裂而造成卵母细胞/胚胎丢失,不利于卵母细胞 /胚胎的长期保存。微细玻璃管法(GMP)突出问题是冷却速率慢(最高限制在20000°C/ min左右),易造成卵母细胞/胚胎损伤;并且GMP在冷冻中容易断裂,造成卵母细胞/胚胎 丢失;且GMP的直径和体积很小,限制了一次冷冻卵母细胞/胚胎的数量;而且GMP的虹吸 效果十分显著,这也增加了操作的难度。微滴法(Microdrops)缺点是在贮存过程中无法进 行标识,容易污染,不利于卵母细胞/胚胎的长期贮存。半细管玻璃化冷冻法(hemi-straw) 缺点是操作较难,对专业技术人员的水平要求较高,需要有操作熟练的技术人员,不太适用 于初学者。国内外对牛胚胎冷冻甩管解冻和直接移植法的研宄还存在操作比较复杂,冷冻 液毒性较高及冷冻效率较低等诸多问题。这些因素影响了玻璃化冷冻方法在牛胚胎移植生 产中的推广应用。
[0003] 为了适应牛胚胎移植大规模生产需要,简化胚胎冷冻解冻操作程序,降低生产成 本,提高胚胎移植效率,国内外研宄人员进行了牛胚胎冷冻甩管解冻和直接移植法的试验。 该方法的共同点是以牛冻精细管做为玻璃化冷冻载体,稀释液(即解冻液)段占比较大,牛 胚胎在管外经预处理液平衡后,置于玻璃化冷冻液段中,投入液氮冷冻保存。解冻时从液氮 中取出细管,经空气浴,水浴解冻后,甩管混匀管内液体。牛胚胎在管内平衡一段时间后,剪 掉封口端,然后直接装入移植枪进行胚胎移植。表1为国内外牛胚胎冷冻甩管解冻和直接 移植法的研宄进展。
[0004] 表1国内外牛胚胎冷冻甩管解冻和直接移植法研宄进展
[0005]

【权利要求】
1. 一种玻璃化冷冻液在冷冻牛胚胎中的应用,其特征在于,将牛胚胎置于该冷冻液中, 于液氮中冷冻保存;所述冷冻液为含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液。
2. 如权利要求1所述的应用,其特征在于,冷冻液通过以下方法配制得到: a) mPBS溶液中加入聚蔗糖和蔗糖,使其终浓度分别为300g/L和0. 5mol/L,得到FS溶 液; b) 向FS溶液中加入乙二醇,二者体积比为65 :35,得到EFS35溶液即为冷冻液。
3. -种用于解冻牛胚胎的解冻液,其特征在于,其为向mPBS溶液中加入胎牛血清,二 者体积比为9:1。
4. 权利要求3所述的解冻液在冷冻甩管解冻牛胚胎中的应用,其特征在于,含有以下 步骤: (1) 牛胚胎冷冻用细管中先加入一段解冻液,然后装入一段空气; (2) 接着装入一段冷冻液,再装入一段空气; (3) 装入一段冷冻液,并在该段冷冻液中置入牛胚胎,再装入一段空气; (4) 装入一段解冻液并封闭管口,投入液氮冷冻; (5) 甩管解冻,直接移植; 所述冷冻液为EFS35,其为含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液。
5. -种牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻和直接移植方法,其特征在于,包括如下步骤: (1) 牛胚胎冷冻用细管中先加入一段解冻液,然后装入一段空气; (2) 接着装入一段冷冻液,再装入一段空气; (3) 装入一段冷冻液,并在该段冷冻液中置入牛胚胎,再装入一段空气; (4) 装入一段解冻液并封闭管口,投入液氮冷冻; (5) 甩管解冻,直接移植; 所述冷冻液为EFS35,其为含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液;所述解冻液为含 10% (V/V)胎牛血清的mPBS溶液。
6. 如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述冷冻液通过以下方法配制得到: a) mPBS溶液中加入聚蔗糖和蔗糖,使其终浓度分别为300g/L和0. 5mol/L,得到FS溶 液; b) 向FS溶液中加入乙二醇,二者体积比为65 :35,得到EFS35溶液即为冷冻液。
7. 如权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(1)加入的解冻液长度为7. 5cm,空气 为 0? 5cm ; 步骤(2)中加入的冷冻液长度为0. 4cm,空气长度为0. 5cm ; 步骤(3)中加入的冷冻液长度为0. 5-0. 7cm,空气长度为0. 5cm ; 步骤(4)中加入的解冻液长度为0. 9-1. lcm。
8. 如权利要求5所述的方法,其特征在于,在牛胚胎置入冷冻液之前,还包括在 20-25°C下,将牛胚胎移入乙二醇溶液中平衡2.5-3min,然后移入步骤(3)的冷冻液中;所 述乙二醇溶液为乙二醇与mPBS溶液按照体积比1:9混合配制而成。
9. 如权利要求5-8任一所述的方法,其特征在于,从牛胚胎移入冷冻液到投入液氮中 冷冻应在30秒之内完成。
10. 如权利要求5-8任一所述的方法,其特征在于,从液氮中取出冷冻牛胚胎的细管, 在空气中停留5-10秒,然后浸入20-25°C水浴中平行晃动,待细管内的溶液融化后,手持细 管快速甩动使管内的冷冻液和稀释液充分混匀,细管自解冻后于室温下平衡6-15min移植 于受体。
【文档编号】A01N1/02GK104488853SQ201510015346
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月12日 优先权日:2015年1月12日
【发明者】朱士恩, 傅祥伟, 周艳华, 张有文 申请人:中国农业大学
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