本发明涉及一种草莓组织培养方法，特别指一种控制草莓试管苗玻璃化的组织培养方法。
背景技术：
：目前，植物组织培养技术被公认为解决草莓病毒病、快速繁殖草莓脱毒苗最有效的方法。草莓组织培养分为外植体处理、初代培养、继代增殖培养、生根培养、驯化移栽等过程，采用的外植体类型有茎尖、花药、根、叶及叶柄等草莓组织。但是，在草莓继代增殖培养中，玻璃化问题是急需解决的一大难题。发生玻璃化的试管苗，其组织结构和生理功能异常，分化增殖能力低且生根困难，严重影响草莓试管苗的规模化生产。玻璃化现象的发生与培养基中的激素浓度、琼脂浓度、添加剂和离子浓度配比等均有关系。李胜在《植物试管苗玻璃化现象研究进展》（甘肃农业大学学报2003，3（1）：1-16）中分析认为高浓度6-BA对玻璃化的产生有一定的促进作用，通过降低培养基中6-BA浓度达到减少玻璃化发生。但采用低浓度6-BA的培养基进行草莓继代增殖培养，草莓不定芽的增殖系数较低。同时随着继代数的增加，持续多代使用相同浓度6-BA的培养基，在实际生产过程中还是会存在较高的玻璃化现象。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种控制草莓试管苗玻璃化的组织培养方法，这是一种可提高草莓试管苗增殖系数、有效控制草莓增殖培养过程中发生玻璃化的组织培养方法。本发明是通过以下步骤的技术方案来实现的：1）茎尖消毒接种，在诱导培养基上进行分化诱导培养，获得再生小植株；2）在添加不同浓度6-BA的继代培养基上进行三次继代增殖培养；3）在生根培养基上，对继代增殖培养形成的植株进行诱导生根。本发明还包括以下技术方案：所述步骤1）中接种选取的茎尖半圆球形顶端分生组织大小为0.3mm~0.4mm。所述步骤1）中诱导培养基配方为：MS基本培养基+1.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+10g·L-1琼脂+30g·L-1蔗糖，培养基PH值5.5~6.0。所述步骤1）中诱导培养时间为35～40d。所述步骤2）中进行继代增殖培养的试管苗为分化形成的未出现玻璃化的小植株。所述步骤2）中第一、二、三次继代增殖培养所用MS基本培养基中添加的6-BA浓度不一样，其他成分一样，其他成分包含有琼脂10g·L-1+蔗糖30g·L-1+0.1mg·L-1NAA,培养基PH值5.5~6.0，在第一、二、三次继代增殖培养中添加的6-BA浓度分别为1.0mg·L-1、0.8mg·L-1、0.6mg·L-1。所述步骤2）中每次继代增殖培养时间为25～30d。所述步骤3）生根培养基配方为：1/2MS基本培养基+10g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖。所述步骤1）、所述步骤2）、所述步骤3）中组织培养条件为：在培养室内培养，培养温度16℃~22℃，光照强度为1500lx~2000lx，每天光照时间12h。本发明具体步骤如下：（1）将经过消毒的草莓茎尖在解剖镜下由外向内逐层剥去幼叶，直至露出半圆球形顶端分生组织，切取0.3mm~0.4mm左右大小茎尖接种于含有1.5mg·L-16-BA、0.1mg·L-1NAA、10g·L-1琼脂、30g·L-1蔗糖的MS培养基上进行分化诱导培养，培养基PH值5.5~6.0。在培养室内培养，培养温度16℃~22℃，光照强度为1500lx~2000lx，每天光照时间12h。（2）35～40d后将分化形成的未出现玻璃化的小植株开始进行继代增殖培养，每隔25d～30d继代增殖培养一次，培养基为MS基本培养基，每次继代增殖培养除添加的6-BA浓度不一样外，其他成分均一样，其他成分包含有0.1mg·L-1NAA、10g·L-1琼脂、30g·L-1蔗糖，培养基PH值5.5~6.0。在第一、二、三次继代增殖培养中添加的6-BA浓度分别为1.0mg·L-1、0.8mg·L-1、0.6mg·L-1。（3）将继代增殖培养中已形成完整植株，且植株高度达到2cm以上的试管苗接种到1/2MS培养基上诱导生根。培养基其他成分包含有10g·L-1琼脂、20g·L-1蔗糖。本发明的有益效果是：在草莓试管苗第一、二、三次继代增殖培养过程中逐代降低培养基质中的6-BA浓度，在保证草莓试管苗较高的增殖系数的前提下，可控制草莓组培苗玻璃化，前三次继代增殖培养中草莓试管苗增殖系数均值达到6.01，玻璃化率均值控制在26.25%。附图说明图1为本发明的工艺流程图。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明进行详细介绍。实施例：在3-5月选取生长健壮的“红颜”草莓母株上新长出的匍匐茎顶端3～4cm长的顶芽，用含少量洗洁精的自来水浸泡30min，再用自来水冲洗30min，最后用无菌水冲洗3次，然后转至超净工作台进行灭菌处理。具体灭菌处理方法为：先用75%乙醇处理30s，无菌水冲洗3次后用0.1%HgCl2处理7min，最后用无菌水冲洗5～6次。灭菌后在超净工作台上进行接种。在解剖镜下由外向内逐层剥去幼叶，直至露出半圆球形顶端分生组织，切取0.3mm~0.4mm左右大小茎尖接种于装有诱导培养基的三角瓶（50ml）内进行培养，每瓶接种4个茎尖。诱导培养基的成分为MS+1.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+10g·L-1琼脂+30g·L-1蔗糖，培养基PH值5.5~6.0，15～20d后更换一次诱导培养基。培养条件为光照1500lx~2000lx，12h/d，温度16℃~22℃。在接种35～40d后将分化形成的小植株开始进行继代增殖培养，第一、二、三次继代增殖培养所用MS基本培养基中添加的6-BA浓度不一样，其他成分一样，其他成分包含有10g·L-1琼脂+30g·L-1蔗糖+0.1mg·L-1NAA,培养基PH值5.5~6.0。继代增殖培养的接种材料均选用未出现玻璃化现象的小植株，每次继代培养时间均为25d～30d。培养条件为光照1500lx~2000lx，12h/d，温度16℃~22℃。在MS培养基中添加不同浓度6-BA的继代培养基的具体组成和继代培养效果如表1所示。由试验结果可知，从保持草莓试管苗高水平的增殖系数，同时又能控制试管苗玻璃化的发生率角度来看，处理1的试验效果是最好的。处理2和处理3虽然试管苗的玻璃化率更低，但试管苗的增殖系数不高，不利于试管苗的扩繁。表1不同浓度6-BA对各继代培养的草莓试管苗增殖和玻璃化影响 继代次数处理编号6-BA浓度增殖系数玻璃化率/%第一次继代CK1.5mg·L-16.95a7.06a11.0mg·L-16.21b0b20.8mg·L-15.10c0b30.6mg·L-13.77d0b第二次继代CK1.5mg·L-16.24ab56.84a10.8mg·L-16.75a48.08b20.6mg·L-15.10bc40.79c30.4mg·L-14.39c27.98d第三次继代CK1.5mg·L-15.72a41.32a10.6mg·L-15.06b30.66b20.4mg·L-14.52b29.27b 30.2mg·L-13.29c14.43c前三次继代培养的均值比较CK6.30a35.07a16.01a26.25b24.91b23.35c33.82c14.14d注：小写英文字母表示不同处理差异，代表Duncan分析中差异达到0.05显著水平。将继代增殖培养中已形成完整植株，且植株高度达到2cm以上的试管苗接种到1/2MS培养基上诱导生根。15d～20d后，当试管苗根长至2cm以上，生根数达2根以上，苗高5cm以上时进行驯化移栽。当前第1页1 2 3