用于防治有害生物的可喷雾分散淀粉基生物塑料制剂的制作方法

本发明涉及可喷雾液体生物防治制剂，其包含嵌入有微生物生物防治剂的分散的淀粉基生物塑料，所述微生物生物防治剂被递送至靶标如病原体和叶子，以降低农产品的污染和侵染。本发明提供了以下实例：喷雾包含球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的昆虫病原性分离株或由苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)产生的内毒素的生物防治制剂，以有效地防治玉米中欧洲玉米螟(European Corn Borer)的侵染；将包含非产毒素的黄曲霉(Aspergillus flavus)菌株的可喷雾生物防治制剂递送至作物以有效地减少玉米和其他作物植物中黄曲霉毒素污染；以及将包含哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的可喷雾生物防治制剂施用于番茄种子以有效减少立枯病。另外，这种可喷雾生物塑料制剂也用于携带球孢白僵菌菌株的孢子以防治棉花中的美国牧草盲蝽(Tarnished Plant Bug)。

背景技术：

通用术语微生物生物防治剂是指在农业有害生物(包括细菌、真菌、杂草和昆虫)防治中的微生物的使用。虽然文献报道了在实验室或小规模田间条件下用于防治特定有害生物或植物病原体的有效的微生物分离株的许多例子，但是仅仅有限数量已经进入了市场。考虑到微生物生物防治剂是活有机体，不同于合成农药，很多因素可影响微生物生物防治剂的效果。在数种情况下，缺少持续的田间防效、高生产成本和产品变异性限制了它们的商业成功(Glare等人.2012.Trends in Biotech.30:250-258)。然而，限制微生物生物防治剂在农业中的实际使用的最重要因素涉及如何配制这些生物防治微生物(Legget等人.2011.Can.J.Plant Pathol.33:101-107)。除了用于将微生物生物防治剂递送至靶标(即土壤或叶子)，制剂应该也保证充足的保质期，容易操作和对操作者的安全性，以及在田间施用后生物防治微生物的延长的生物活性(Fravel,D.R.2009.Annu.Rev.Phytopathol.43:337-359；Legget等人，如上文)。因此，不充分或不适当的制剂是限制微生物生物防治剂在农业的使用和传播的最常见的原因(Kaewchai等人.2009.Fungal Diversity 38:25-50)。最近，生物技术和应用生物学的进展，以及对食品产品的安全性的需求和环境可持续性已经导致了有效的微生物生物防治剂的需求增加并且因此新的技术方法的发展(Leggett等人，如上文；Glare等人，如上文)。

如上文提及的，微生物生物防治剂主要以用于在农业上防治有害生物、植物病原体和杂草的细菌或真菌为代表。除了细菌苏云金杆菌外，其他成功的生物防治剂的例子是真菌木霉属(Trichoderma spp.)和球孢白僵菌(Kaewchai等人，如上文；Glare等人，如上文)。这两种丝状真菌配制在多种不同的递送系统中，所述递送系统包括预胶化淀粉-粉、粗粒小麦粉颗粒和黏土、接种的谷物、可湿性粉剂等(Papavizas 1985.Annu.Rev.Phytopathol.23:23-54；Daigle and Cotty 1997.Biocontrol Sci.Technol.7:3-10；Harman等人.2011.Phytoparasitica.39:103-108)。

包括目前用于减少玉米、棉花和花生中的黄曲霉毒素污染的真菌黄曲霉的不产毒分离株的许多其他生物防治真菌，根据相似的技术和方法配制(Dorner,J.W.2004.Toxin Rev.23:425-450；Abbas等人.2006.Biocontrol Sci.Technol.16:437-449)。黄曲霉毒素是指主要由栖息真菌黄曲霉的土壤产生的一组致癌的真菌毒素。用于减少玉米中黄曲霉毒素污染的新颖和成功的方法是由使用黄曲霉的不产毒分离株竞争性排斥固有的产黄曲霉素分离株组成的生物防治策略。在美国南部进行的研究证明了接种黄曲霉的不产毒分离株的谷粒的土壤施用在减少玉米、棉花和花生中的黄曲霉毒素污染上是成功的(Dorner,J.W，如上文；Abbas等人，如上文)。另外，由孢子包覆的大麦种子组成的生物防治制剂已经在美国商业化。更多最近的研究已经显示由淀粉基生物塑料Mater-Bi^TM(MB)制成的颗粒可有效地代替谷粒(Accinelli等人.2009.Bioresource Technol.100:3997-4004；Accinelli等人.2012.Crop Protection32:30-35；Abbas等人.2012.美国专利号8,173,179)。类似于黄曲霉，各种其他丝状真菌能够在富淀粉基质上生长(Accinelli和Abbas.2011.Toxin Rev.30:71-78)。因此，使用淀粉基生物塑料基质以递送真菌繁殖体的构思已被延伸至生物防治真菌木霉属(Abbas等人.2012.美国申请公开号20120213740；Accinelli等人.2014.Acta Hort.1015:79-88)。

最初的构思由颗粒淀粉基生物塑料组成，该颗粒淀粉基生物塑料被配制为用作载体基质以维持土传(soil-born)生物防治真菌的生长和提供玉米田土壤接种的机制。生物塑料颗粒由通过化学交联稳定的淀粉基聚合物组成。生物塑料颗粒促进真菌急剧生长和孢子形成，其导致了快速的土壤定殖。另外，生物塑料颗粒由可再生和可堆肥来源产生。

如上讨论的，用于有效防治产毒素真菌和细菌以及昆虫害虫的各种生物防治方法和制剂在本领域是已知的。然而，仍然存在对生物防治剂的制剂的需求，所述生物防治剂对确保长期储存后的生物防治剂的完整性和有效性，并且对促进在田间和在温室中施用生物防治剂的操作、安全性、时机和定位是有效的。对适合的、有效的制剂系统以递送其他生物防治剂的需求也是明显的。

技术实现要素：

我们已经发明了可喷雾液体生物防治制剂，其包含嵌入由商业的生物塑料Mater-Bi^TM制备的生物塑料分散体的生物防治微生物。

根据该发现，本发明的目的是提供可喷雾微生物生物防治剂组合物，其包含嵌入分散的淀粉基生物塑料中的生物防治微生物。

本发明的另一个目的是提供可喷雾微生物生物防治剂组合物，其包含嵌入生物塑料分散体中的曲霉属(Aspergillus spp.)或其他相关物种的非产毒素菌株。

本发明的再一个目的是提供可喷雾生物防治组合物，其包含嵌入Mater-Bi^TM生物塑料分散体中的非产毒素黄曲霉菌株NRRL 30797。

本发明的又一个目的是提供能够抑制立枯病的可喷雾生物防治组合物，其包含嵌入分散的Mater-Bi^TM生物塑料中的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株。

本发明的另外的目的是提供能够抑制立枯病的可喷雾生物防治组合物，其包含嵌入分散的Mater-Bi^TM生物塑料中的绿木霉(Trichoderma virens)菌株。

本发明的另一个目的是提供能够防治欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)侵染的可喷雾生物防治组合物，其包含嵌入分散的Mater-Bi^TM生物塑料中的球孢白僵菌分离株或由苏云金杆菌产生的内毒素。

本发明的另一个目的是提供能够防治美国牧草盲蝽(Lygus lineoraris)侵染的可喷雾生物防治组合物，其包含嵌入Mater-Bi^TM生物塑料分散体的球孢白僵菌分离株。

本发明的又一个目的是提供防止和减少玉米的黄曲霉毒素污染的生物防治方法，其包括将嵌入有非产毒素黄曲霉菌株的分散的Mater-Bi^TM的可喷雾生物防治组合物喷雾于植物上以防治黄曲霉毒素。

本发明的另外的目的是提供抑制立枯病的生物防治方法，其包括将包含嵌入Mater-Bi^TM生物塑料分散体中的哈茨木霉的可喷雾生物防治组合物喷雾于土壤、植物或植物部分上。

本发明的另外的目的是提供抑制立枯病的生物防治方法，其包括将包含嵌入Mater-Bi^TM生物塑料分散体中的绿木霉的可喷雾生物防治组合物喷雾于土壤、植物或植物部分上。

本发明的进一步的目的是提供防治欧洲玉米螟侵染的生物防治方法，其包括将包含嵌入有球孢白僵菌分离株或由苏云金杆菌产生的内毒素的Mater-Bi^TM生物塑料分散体的可喷雾生物防治组合物喷雾于玉米植物上。

本发明的进一步的目的是提供防治美国牧草盲蝽侵染的生物防治方法，其包括喷雾包含嵌入有球孢白僵菌分离株的Mater-Bi^TM生物塑料分散体的可喷雾生物防治组合物。

本发明的另外部分是试剂盒，包括可喷雾生物防治组合物，所述可喷雾生物防治组合物包含嵌入有微生物生物防治剂的分散的Mater-Bi^TM生物塑料。

本发明的其他目的和优势将通过下文的描述变得更加明显。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一幅以颜色表现的附图。带有彩色附图的该专利或专利申请公开的副本可以在请求并支付需要的费用的情况下由美国专利与商标局提供。

图1显示了施用包含分散的淀粉基生物塑料的可喷雾生物防治制剂后的玉米叶的表面。

图2A和图2B描述了在2012年(图2A)和2013年(图2B)玉米生长季期间欧洲玉米螟蛾的捕获量。

图3A和图3B显示了在2012年(图3A)和2013年(图3B)玉米生长季期间记录的气象数据(最低/最高温度和降雨量)。

图4A至图4D描述了2012年和2013年期间对照(CTR)、商业制剂(CF)和可喷雾生物塑料制剂(BF)对损伤频率的影响：欧洲玉米螟对玉米植物的茎叶部分的摄食活动导致的穿孔损伤(图4A)和秆损伤(图4B)以及对基于穿孔的列(图4C)和秆腔(图4D)的强度的作用。两种制剂均含有球孢白僵菌的孢子。

图5描述了在2012年和2013年期间对照(CTR)、商业制剂(CF)和可喷雾生物塑料制剂(BF)对抽穗百分比的作用，所述穗显示由欧洲玉米螟的摄食活动所导致的损伤。

图6描述了在用包含嵌入有不同浓度的苏云金杆菌库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)内毒素的分散的淀粉基生物塑料的2.5％可喷雾生物塑料制剂喷雾的小室中温育6小时之后的二龄欧洲玉米螟幼虫的死亡率。

图7显示了与生物塑料颗粒和未处理的对照相比可喷雾分散生物塑料制剂对玉米中黄曲霉毒素污染的影响。

图8A和图8B显示了在出苗的种子表面上喷雾含有哈茨木霉孢子的2.5％可喷雾分散淀粉基生物塑料制剂的影响。种子种植于侵染了两种不同水平的导致30％立枯病(图8A)和60％立枯病(图8B)的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)侵染的罐装混合物中。

图9显示了配制为可喷雾分散淀粉基生物塑料的球孢白僵菌对美国牧草盲蝽的死亡率和感染率的影响。以不同量(1、0.75、0.5和0.25％w/v)的生物塑料制备并针对0.04％吐温80和水对照评价生物塑料制剂(BF)。

图10显示了配制为1％可喷雾分散淀粉基生物塑料(BF)的球孢白僵菌在田间条件下对美国牧草盲蝽成虫的死亡率和感染率的影响。将生物塑料制剂喷雾在种植了棉花的小块土地上，并针对0.04％吐温80和未处理对照评价。使用两种球孢白僵菌菌株N18和GHA制备BF和吐温80制剂。

具体实施方式

我们已经证明了用于包含嵌入Mater-Bi^TM生物塑料分散体中的生物防治微生物的生物防治组合物的新型可喷雾生物塑料分散体制剂对在土壤内或在叶子或其他植物部分上引入生物防治微生物的稳定种群是有效的。

通过在水中均质化不同类型的生物塑料基质(例如颗粒、小球、粉末)，然后使其富含真菌结构(如孢子、细胞、菌丝体等)、细菌细胞或其他生物活性化合物(例如内毒素)获得可喷雾制剂。可供选择地，可以通过固态发酵方法实现接种生物塑料粉末，其中生物塑料和例如真菌培养物一起在容器如可高压灭菌的袋子中温育3-7天，然后在炉中在45℃下干燥。将产生的干物质研磨成分散于水中并且可喷雾的粉。另一程序包括将生物塑料基质(例如小球和颗粒)穿过装备有小尺寸(<1mm)喷嘴的挤出机。使用常规工业挤出机或台式挤出机进行挤出。将产生的粉末直接分散于含有微生物结构(例如孢子、菌丝体、细胞)或生物活性化合物的水中。这种构思的新颖性是它使制剂的塑料特性与生物防治有机体或生物活性物质结合。

为了更好地维持生物防治微生物病原体的生长，也可以将特定的营养品添加至通过在田间施用前配制的方法制备的混合物中。在使用常规杀虫剂喷雾机器进行田间施用之前，将接种的生物塑料粉末悬浮于水中。也可将微生物/生物塑料混合物的水悬液喷雾于种子表面以保护幼苗对抗立枯病或其他病害。

因为可喷雾制剂的塑料特性，一旦通过喷雾将生物防治制剂施用于植物叶片或其他植物器官(例如种子)，水迅速通过蒸发被去除并且含有选择的微生物的生物塑料制剂的连续的膜或薄层或斑点保持长时间(高达2-4个月)粘附于叶表面，其中它用作生物防治微生物的生长基质和起到对有害生物的持久防治的作用。因为粘附于(即粘着于)叶片的膜的特性，不必将粘合剂添加至制剂中(图1)。进一步，生物塑料不仅是载体，它也是生物防治微生物的食物来源。生物塑料也减缓降解；因此，所述组合物是持久的并且可持续。

新的可喷雾生物塑料制剂构思和技术提供了优于颗粒生物塑料制剂和其他制剂的优势。优势包括施用的时机上更大的弹性，有效生物防治作用的延长以及精确地将生物防治微生物剂置于最接近靶标有害生物(如产毒素真菌、昆虫害虫等)的位置。其他优势是使用喷雾制剂导致以需要的更低量的生物塑料和生物防治剂产生提高的效率，因为接触是更好的。进一步，可以与常规产品如合成杀虫剂一起施用这种可喷雾制剂。

Mater-Bi^TM是由淀粉、聚己酸内酯(ε-己内酯)和少量的天然增塑剂组成的生物塑料产品(Bastioli,C.2001.Starch/Starke 53:351-355)。Mater-Bi^TM是完全生物可降解的，具有与纤维素相似的降解速率(Bastioli,C.1998.Polym.Degrad.Stabil.59:263-272)。除了高度有利的低环境影响谱，它的物理特性促进了产品操作和田间施用。我们报道了证实新的用于包含生物塑料基质、Mater-Bi^TM和生物防治微生物的生物防治组合物的可喷雾生物塑料制剂的可靠性的一系列研究。本发明的组合物涵盖具有与Mater-Bi^TM生物塑料颗粒的关于Mater-Bi^TM生物塑料颗粒的生物塑料相同的识别特征的生物塑料分散体产品；然而，如上所述，制剂和施用的生物塑料分散体产品的特征是不同的。

新的用于包含生物塑料基质、Mater-Bi^TM和生物防治微生物的生物防治组合物的可喷雾生物塑料制剂的有效性已经在控制的温室条件下被证明并在田间条件下被确认。可喷雾生物塑料生物防治制剂显示可适应于真菌或细菌生物防治剂，也就是木霉菌和曲霉菌的非产毒素菌株以及球孢白僵菌和苏云金杆菌的昆虫病原分离株。

本发明的方法适用于任何针对人类消费生长和/或被真菌毒素和/或病原或有害生物损伤的农业商品，如对立枯病和根腐病易感的花生、玉米、棉花、树坚果、蔬菜植物和观赏植物。

对于本发明的目的，真菌制剂或真菌农业生物防治组合物是指微生物制剂，其中微生物包括、基本上由以下组成或由以下组成：分别能够减少农业作物中黄曲霉毒素污染和抑制立枯病的曲霉属(Aspergillus)的非产毒素或非产黄曲霉毒素菌株和木霉属(Trichoderma)菌株。真菌制剂可包含一种或多种曲霉属的非产毒素菌株或非产黄曲霉毒素菌株。曲霉属的非产毒素菌株包括不产生毒素黄曲霉毒素和环匹阿尼酸(CPA)的任何菌株。用于本发明的目的的农业生物防治组合物包含在农业上可接受的载体上的真菌的非产毒素一种菌株或多种菌株，所述载体可以是真菌可以贴附并且对真菌和用组合物处理的作物无害的任何载体。当将真菌制剂和真菌农业生物防治组合物在施用于生长农业商品的土壤时具有生物竞争性的能力。

将曲霉属的非产毒素菌株和非产黄曲霉毒素菌株以在农业商品上减少毒素水平有效的量喷雾于植物上。本文所使用的“减少毒素水平”是指与在未根据本发明的方法处理的农业商品中预期的相比毒素的量减少。如对于本领域技术人员而言明显的是，任何测量和比较毒素水平的精确方法可以用于这样的比较。

本文所使用的“以有效的量(in amounts effective)、有效的量(an amount effective)或有效量(an effective amount)”是指施用的真菌制剂的量，其中施用的作用用于减少农业商品的毒素污染。将喷雾的制剂以大约0.75至7.5千克(kg)每公顷(ha)的速率施用于土壤或植物部分。也可以含有添加的营养品的生物塑料制剂提供了促进生物防治真菌的生长和孢子形成的受保护的环境。可以作为单菌株可喷雾组合物生长和施用菌株；或在微生物与生物塑料在液体培养基中生长时期以及干燥和粉碎过程以获得细微分裂的均质的微生物/生物塑料分散体混合物之后，可以约等比例地混合干产物以提供由曲霉属的不同菌株制成的组合物。

实施例

现已对本发明进行了一般的描述，通过参考某些具体实施例可以更好地理解本发明，所述具体实施例仅包括在本文中以进一步说明本发明并且不旨在限制如权利要求定义的本发明的范围。

实施例1

生物防治真菌、细菌和毒素

用以下的生物防治微生物进行实验室和田间研究：球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ATCC 74040、球孢白僵菌N18、球孢白僵菌GHA、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ATCC 20847、黄曲霉(Aspergillus flavus)NRRL 30797和由细菌苏云金杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)HD1产生的杀虫内毒素。数种微生物可以与该可喷雾生物塑料制剂配制，包括褐色绿僵菌(Metarhizium brunneum)(Erler等人.2014.Pest Manag.Sci.70:496-501)、苏云金杆菌拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis)(Elek等人.1999.J.Econ.Entomol.92:1062-1071)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Hu等人.2014.Biol.Control.70:54-64)、钩状木霉(Trichoderma hamatum)(Horst等人.2005.Plant Disease 89:1195-1200)、巨口茎点霉(Phoma macrostoma)(Bailey,K.L.2010.Canadian J.Plant Pathol.32:113-121)和疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)(Hoagland,等人.2007.Biocontrol Sci.Technol.17:721-731)。

实施例2

可喷雾生物塑料基制剂的制备

通过在瓦林捣碎机(Waring blender)中均质化生物塑料小球、颗粒或粉末在水中(20％；w/v)的混合物制备可喷雾生物塑料制剂。捣碎15分钟后，使生物塑料分散体通过1mm筛，稀释于水中(0.25-2.5％或其他值)并在4℃下储存直到使用。对特定的要求，例如添加生物活性化合物或物质(即内毒素)，可以通过在120℃下高压灭菌15分钟对制剂灭菌。可供选择地，也可以通过固态发酵过程实现接种生物塑料粉末，其中生物塑料和例如真菌培养物一起在容器如可高压灭菌的袋子中温育3-7天，然后在炉中在45℃下干燥。将产生的干物质研磨成可溶于水中并且可喷雾的粉。通过使生物塑料小球或颗粒通过装备了小尺寸(<1mm)喷嘴的挤出机获得相同的结果。然后使生物塑料粉末与微生物繁殖体(例如孢子、细菌细胞)或生物活性物质(例如内毒素)混合。营养品或其他化学物质(即抗生素、化学杀虫剂等)的添加是任选的。

真菌分离株(例如黄曲霉、木霉属、球孢白僵菌)在马铃薯葡萄糖琼脂上生长直至孢子形成，然后将许多的十个5mm琼脂塞转移至含有1kg预湿并高压灭菌的小麦种子的可高压灭菌袋中。将种子在连续的三天中在120℃下高压灭菌30分钟。用固定在钢环上的棉塞覆盖住袋子并将袋子在28℃下在垂直位置温育10天。通过将全部物质转移至含有500mL无菌的0.2％吐温20溶液的1L瓶内以回收孢子。在200rpm下摇动30分钟后，通过干酪包布过滤混合物回收孢子。用血细胞计数器调整孢子密度后，将等分部分添加至稀释的生物塑料分散体中以获得希望的效能(即10⁷个孢子/mL或更高)。制剂可以直接使用或在4℃下储存。使用相似的方案以制备具有生物活性成分的可喷雾生物塑料分散体制剂。在下文报道了制备含有杀虫内毒素的可喷雾生物塑料制剂的程序的说明。生物塑料的百分比和最终制剂的效能(孢子、其他繁殖体或生物活性化合物的数目)可以根据需要修改。

实施例3

可喷雾生物塑料制剂在受控制的温室条件下的施用

首先在受控制的温室条件下评价该可喷雾生物塑料制剂用作用于微生物生物防治剂的实际和有效的制剂的可行性。玉米、棉花和大豆的植物生长于温室中并且在实验的整个持续时间内每天从土壤中获得水分。使用手动喷雾器将以1％生物塑料粉末(<1mm)和10⁷个孢子/mL的哈茨木霉ATCC 20847或黄曲霉NRRL 30797制备的液体分散的淀粉基生物塑料制剂均匀地喷雾在叶子上。对于每种处理，每个物种总共有7株植物均匀地喷雾35mL制剂。使用漂白剂消毒的单孔打孔器在喷雾前1小时以及在喷雾后2周和4周采集叶子样品。对于每株植物，采集总计5个样品，并将其转移至无菌2mL管中，并直接用于使用PowerSoil DNA分离试剂盒(MoBio实验室，索拉纳海滩，CA)进行DNA分离。用NanoPothometer P 360(Implen股份有限公司，慕尼黑，德国)测定总的回收的DNA，然后根据Accinelli等人(2012.Crop Protection32:30-35)描述的步骤通过定量PCR定量靶DNA。简单地说，在含有2μL DNA、12.5μL 2×TaqMan通用PCR预混液(Applied Biosystems有限公司，福斯特市，CA)和0.2μM引物对的每条引物的总体积为25μL的反应中进行PCR扩增。为了定量哈茨木霉和黄曲霉，引物对分别为Tf/uTr和omtB-F/omtB-R(Hagn等人.2007.J.Microbiol.Methods 69:86-92；Kim等人.2008.Int.J.Food Microbiol.29:49-60)。热循环条件如下：在50℃下2分钟，在95℃下10min，以及在95℃下15s和在60℃下1min的40个循环。使用ABI Prism 7700序列检测系统(Applied Biosystems有限公司)分析得到的样品。在定量后，使扩增的片段样品经过熔解曲线分析。通过相对于靶DNA的对数转化量对循环阈值(Ct)作图来生成标准曲线，所述靶DNA获得自10倍稀释的分离自哈茨木霉ATCC 20847或黄曲霉NRRL 30797的孢子分散体的DNA。

如预期，在喷雾含有哈茨木霉ATCC 20847或黄曲霉NRRL 30797的孢子的液体生物塑料分散体制剂后，来自这两个物种的DNA可容易地检测到。更具体地，在喷雾后2周和4周，从玉米叶子回收的哈茨木霉DNA的量在叶表面分别为0.8和1.3μg/mm²，黄曲霉DNA的量在叶表面分别为1.1和2.5μg/mm²。在棉花和大豆中观察到更低的值，在这两个物种之间没有差异。在喷雾后2周和4周，这两个物种的平均值，哈茨木霉分别为0.4和0.6μg/mm²，黄曲霉分别为0.5和0.8μg/mm²。仅有限数量(<5％分析的样品)的三种未处理的植物物种，棉花、玉米和大豆的叶子样品具有可检测量的总DNA，而没有黄曲霉或哈茨木霉DNA的痕迹。这些发现与如下的构思是一致的：这种可喷雾生物塑料分散体制剂在将两种微生物生物防治剂粘附于叶表面以及为它们的生长和孢子形成提供营养是有效的。

实施例4

田间实验：在玉米中欧洲玉米螟的生物防治

在位于邻近意大利博洛尼亚的谷物生产农场中进行实验。2012年4月末，在20m×30m的小块土地种植常规的玉米杂交种(PR31K18；Pioneer Hi-Breed，Des Moines,IA)，并根据该地区的通常实践来管理。每小块土地由10m宽的缓冲区包围。在玉米的V7生长期，用包含嵌入分散的淀粉基生物塑料中的生物防治分离株球孢白僵菌ATCC 74040的分生孢子的2.5％生物塑料可喷雾制剂或用商业制剂Naturalis(Intrachem Bio股份公司，意大利)喷雾小块土地。Naturalis是含有7％活性成分(球孢白僵菌ATCC 74040的孢子)的液体制剂。两种制剂均以400L/ha的速率使用背包喷雾器施用。根据完全随机区组设计一式三份进行实验。也包括未处理的对照。全部实验在2013年根据相同的实验程序来重复。

使用商业尼龙网笼罩诱捕器(Riff98责任有限公司，博洛尼亚，意大利)监测欧洲玉米螟雌虫的飞行。在诱捕器中放入购自Isagro S.p.A.(米兰，意大利)的欧洲玉米螟生态型E的性信息素的诱饵进行引诱。三个诱捕器放置在每块玉米田的边缘并从5月末至9月初每周启用一次。根据制造商的说明放置诱饵。

在7月中旬(第一代幼虫)和在收获时(第二代幼虫)按照Mencarelli等人(2013.Pest Manag.Sci.69:1085-1091)描述的步骤评价由欧洲玉米螟幼虫对玉米植物的营养组分的摄食活动导致的损伤。在由第一代幼虫产生的损伤的情况下，从每小块土地中随机选取30株植物，并且评价典型的直排穿孔(rows of shot holes(RSH))的存在(1分)或不存在(0分)。损伤严重程度依据对每株选取的植物的视觉上评分的RSH的数量来评价，并且在0-5的范围分级(0：无RSH；1：1-5RSH；2：6-10RSH；3：11-20RSH；4：21-35；5：>35RSH)。在收获时采用相同的方法以评价幼虫对导致秆腔(SC)形成的掏空秆引起的损伤。对于SC，使用以下范围：0：没有SC；1：1-3SC；2：3-5SC；3：5-7SC；4：7-9SC；5>9SC。在评价SC后，移去穗并且记录欧洲玉米螟损伤的穗的频率。

在收获时，将来自所有植物的穗去壳，在50℃下干燥72小时，并且记录产量。对数据进行方差分析。使用Tukey HSD检验比较平均值，并且在P>0.05水平检测到显著性差异。数据表示为平均值±STD。

欧洲玉米螟蛾的捕获量在图2A和2B中显示。如在之前的调查中所观察到的，欧洲玉米螟显示了具有两个飞行峰的二化性的物候学，第一个飞行峰在6月下旬，第二个飞行峰在8月下旬。每周捕获的数目表明在2012年(图2A)欧洲玉米螟的侵染高于2013年(图2B)。这很可能是由于，与2013年相比(图3B)，2012年记录的夏季极端炎热和干燥(图3A)。基于玉米的这种关键害虫的生命周期，在卵孵化之后，早龄幼虫首先以生长中的穗和轮生体组织为食。这种摄食活动导致穿过叶子的特征性RSH的形成。在2012年和2013年，显示RSH损伤的植物的频率分别为86％和49％(图4A和图4B)。与损伤的植物的频率相似，损伤强度在2012年高于2013年(图4C和图4D)。更具体地，损伤强度等级在2012年和2013年分别为3.4和2.1(图4C和图4D)。

在第一实验年，施用含有球孢白僵菌ATCC 74040的孢子的商业制剂导致损伤植物的频率降低22％，损伤等级为2.9(图4C)。在2013年，降低为12％，损伤等级为1.9(图4C)。在接受了可喷雾生物塑料基制剂的小块土地中，显示RSH损伤的植物的百分比进一步显著降低至更低的百分比。更具体地，在用生物塑料喷雾过的植物中由第一代幼虫引起的损伤的频率和强度分别在2012年是39％和1.6，在2013年是21％和0.9(图4A和图4C)。

从第三幼虫阶段开始，幼虫钻入秆内产生秆腔(SC)。在这两年中，显示SC损伤的植物的百分比相对于RHS损伤的植物更低(图4B)。这解释为考虑到已知的早期阶段欧洲玉米螟幼虫的高死亡率。然而，如对由幼虫对叶子的摄食导致的损伤所观察到的，SC损伤的频率和强度在2012年高于2013年。可喷雾生物塑料制剂相对于商业制剂在减少对秆的损伤上显著更有效。更具体地，SC损伤的频率和强度分别在2012年减少了44％和48％，在2013年减少了48％和59。商业制剂也减少了SC损伤，但是量级显著低于可喷雾生物塑料(图4B和图4D)。

在这两年中，高达接近一半的穗显示可见的欧洲玉米螟损伤。使用商业制剂损伤减少高达8％，而使用可喷雾生物塑料损伤减少高达54％(图5)。最重要地，相对于未处理的对照和商业制剂，可喷雾生物塑料的施用导致了更高的玉米产量。更准确地，在2012年，接受了商业制剂和生物塑料制剂的小块土地的平均玉米产量分别高于未处理的对照6％和35％。在2013年，这些值分别为8％和43％。因此，嵌入有生物防治剂球孢白僵菌的可喷雾生物塑料分散体比商业制剂显著更有效。

实施例5

欧洲玉米螟生物测定

通过昆虫生物测定评价这种可喷雾生物塑料制剂待被靶标昆虫害虫(即欧洲玉米螟，ECB；Ostrinia nubilalis)摄食的潜能。对于该生物测定研究，如上描述制备2.5％可喷雾分散生物塑料制剂，除了在生物塑料分散体内真菌孢子替换为苏云金杆菌库斯塔克亚种HD1株的内毒素。杀虫内毒素获得自如Accinelli等人(2004.Agric.Ecosys.Environ.103:497-507)描述的商业制剂。简单地说，首先将50g Dipel 2X(Sipcam股份公司，佩罗，意大利)用1M氯化钠洗涤，然后用去离子水洗涤。每种洗涤重复两次。洗涤后的沉淀物用含有0.5M二硫苏糖醇和1M硫氰酸钾的MOPS缓冲液(0.1M 3-N-吗啉丙磺酸，pH 7.8)萃取，然后用去离子水透析8小时，并用硫酸铵沉淀。将沉淀物在27,000g下离心并在去离子水中重悬浮。在用劳里法(Lowry method)定量内毒素之后计算用于制备可喷雾生物塑料制剂的储备液的浓度。

根据Accinelli等人(2004，如上文)的描述进行昆虫的生物测定。简单地说，将10mL昆虫食物添加至50小室生物测定托盘的每个小室中，并且将四龄欧洲玉米螟幼虫转移至小室内(1幼虫/室)。用穿孔的塑料盖子封闭小室，并且将室放置在27℃下的气候室，并且光周期为16:8(光照：黑暗)。在温育3天后，将幼虫转移至小室内，所述小室用由增加浓度的内毒素(0.1、1和10μg/mL)制备的2.5％可喷雾分散的生物塑料制剂喷雾过。6小时后，将幼虫重新放置于充满特定的食物的小室内。每种浓度总共使用30条幼虫。在14天后对昆虫死亡率评分。

欧洲玉米螟的生物测定结果显示于图6中。转移至仅含有干的用增加浓度的内毒素制备的生物塑料的小室内6小时的幼虫的死亡率增加，清楚地证明了这种制剂被欧洲玉米螟幼虫摄食的能力。基本上，本发明背后的构思是在水蒸发后，接种的生物塑料制剂的薄层保持粘附在叶子表面(图1)，其中它用作生物防治微生物的生长基质而且还具有被靶标昆虫害虫摄食的潜能。预期该后者的方面增加抗靶标害虫的活性。

实施例6

在玉米中黄曲霉的生物防治

2012年在上文提及的农场进行实验，并且遵循相同的实验方案和程序。在玉米的V7生长期(其中植物在七叶期(seven leaf stage))，用包含嵌入生物塑料分散体中的生物防治分离株黄曲霉NRRL 30797的孢子(10⁷个孢子/mL)的1％生物塑料液体制剂喷雾小块土地，并且使用背包喷雾器以400L/ha的速率施用。与欧洲玉米螟生物防治实验一样，根据完全随机区组设计一式三份进行当前实验。在收获时，从每小块土地上随机选择60个玉米穗，去壳并在50℃下干燥72小时，并研磨(<1mm)用于化学分析。用甲醇/水(70:30)萃取之后，通过HPLC根据Accinelli等人(2012，如上文)描述的程序进行化学分析。对数据进行方差分析。使用Tukey’s HSD检验比较平均值，并且在P>0.05水平检测到显著性差异。数据表示为平均值±STD。

在2012年玉米生长季期间记录的炎热和干燥条件也有利于玉米的黄曲霉侵染(图3A)。在未处理的对照小块土地，平均黄曲霉毒素污染为140ng/kg。可喷雾生物塑料制剂的施用导致黄曲霉毒素水平减少大约97％(图7)。这些发现显示这种可喷雾制剂在减少玉米中的黄曲霉毒素污染中是高效的。

实施例7

种子立枯病的生物防治

用于在植物叶子上喷雾微生物生物防治剂的相同构思被扩展以保护种子免受立枯病侵害。更具体地，可喷雾生物塑料基制剂用于防治由真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)导致的番茄幼苗的立枯病。用包含嵌如分散的淀粉基生物塑料中的生物防治真菌哈茨木霉ATCC 20847(最终效能10⁸个孢子/mL)的孢子的2.5％生物塑料制剂喷雾番茄种子(圣女果(Lycopersicum escultentus)‘ACE55VF’；Blumen责任有限公司，米兰，意大利)。将种子转移入台式回转筛(benchtop rotative siever)中并使用手动喷雾器喷雾。将处理的种子干燥1小时，然后直接种植于充满如下制备的被侵染的栽种混合物(potting mix)的幼苗托盘中。充足质量的栽种混合物Terraplant 2(Torf-un Humuswenk Uchte股份有限公司，乌特，德国)用作为病原体侵染的粉末状谷物供给的立枯丝核菌NRRL 22805侵染。简单地说，将来自真菌病原体在PDA上的活性生长培养物的4个3mm琼脂塞置于含有在连续的日子中高压灭菌3次的大麦谷物(25g谷物和18mL水)的250mL瓶中。将瓶在黑暗中在25℃下温育。在温育2周后，使谷物成为粉状，穿过2mm筛并合掺入栽种混合物中。在彻底混合后，通过在25℃下温育以稳定栽种混合物。将丝核菌属感染的生长基质与未感染的栽种混合物混合以达到希望的疾病发生率。在托盘小室(直径5cm，深度5cm)种植喷雾或未喷雾的番茄种子，并在生长室中在25℃下温育，补充12h的光照。单个处理种植总计300颗种子。包含充满未感染的栽种混合物的托盘作为对照。实验以完全随机区组设计一式三份布置，并且监测植物密度(plant stand)18天。

可喷雾生物塑料制剂的施用对减少番茄幼苗的立枯病是有效的。更具体地，当将喷雾的种子种植于病原侵染水平相当于30％立枯病的栽种混合物中时，相对于未喷雾的种子，萌发前立枯病减少高达85％(图8A)。当种植于甚至更严重水平的侵染的栽种混合物中时，种子仍然受到保护。如图8B所示，当将番茄种子种植于人为侵染立枯丝核菌而达到60％立枯病的栽种混合物中时，未萌发种子的发生率为大约10％。这些发现显示，通过在种子周围形成黏性包膜，这种可喷雾制剂保护番茄幼苗免于遭受由立枯丝核菌引起的立枯病。

实施例8

在棉花中的美国牧草盲蝽的生物防治

根据第[0034]和[0035]段中描述的程序制备具有增加的百分比的生物塑料的可喷雾生物塑料制剂并且评价两种生物防治分离株球孢白僵菌NI8和球孢白僵菌GHA的孢子的递送，最终目的是在棉花中防治美国牧草盲蝽(TPB；Lygus lineoraris)侵染。

进行初步的昆虫生物测定实验以评价含有增加量的生物塑料粉末(0.25、0.50、0.75和1％w/v)和球孢白僵菌NI8的孢子(10⁹个孢子/mL)的分散的生物塑料制剂防治美国牧草盲蝽的可行性。分散的生物塑料制剂与0.04％吐温80和水的溶液对比。生物测定根据Portilla等人(2011.J.Insect Sci.11:1-10)描述的程序进行。简单地说，含有0.5g孢子的6mL孢子分散体的等分部分稀释于0.04％吐温80水溶液或可喷雾分散生物塑料中以达到6×10⁹个孢子/mL的浓度。对每种处理(吐温80或分散的生物塑料制剂)，评价90只昆虫。使用增压的实验室设备喷雾制剂。在喷雾后，将TPB成虫转移至昆虫观察笼(BioQuip 1466A)中以使它们干燥。被喷雾的昆虫单独地敲入充满人工固体食物的单个杯中。每日检测成虫的死亡率。死亡的昆虫保持在相同的杯中并每日检查真菌的孢子形成。更具体地，将成虫和若虫保持在27℃、相对湿度65％，并12:12小时(L:D)光周期的环境室中10天。

在喷雾3天后，没有在接受生物塑料分散体处理的TPB和接受吐温80处理的TPB之间观察到TPB的死亡率的差异。如预期的，在用水喷雾后观察到低死亡率(<0.5％)。施用球孢白僵菌5天后，1％分散生物塑料制剂和0.04％吐温80的TPB死亡率分别为80.0和75.5。施用以0.75、0.5和0.25％生物塑料制备的生物塑料制剂导致的死亡率分别为46.6、54.4、40.0。在对TPB成虫喷雾生物塑料或吐温80后10天，观察到更高的死亡率。更具体地，死亡率为97.7％，在1％生物塑料和0.04％吐温80之间没有差异。以0.75、0.5和0.25％生物塑料，死亡率分别为83.3、84.4和66.6％(图9)。分散的生物塑料制剂也促进真菌孢子形成。在喷雾10天后，孢子形成为大约95％，在1％生物塑料和吐温80之间没有差异。以0.75、0.5和0.25％生物塑料，孢子形成分别为76.6、77.7和63.3。

还在由50块小块土地组成的大块田地(270m²；18m长，15m宽)研究中评价可喷雾生物塑料基生物防治制剂。在该研究中，在2013年7月将含有分离株球孢白僵菌N18或球孢白僵菌GHA的1％生物塑料制剂喷雾于棉花植物上。使用安装在约翰迪尔拖拉机上的增压的多喷雾器(multi-sprayer)(Cone-Tip Quick TXVS12)以90psi的压力和8km/hr的速度进行处理，体积为每公顷30L。处理后5天，喷雾了1％生物塑料/NI8和0.04％吐温80/NI8的小块土地中TPB死亡率分别为36和44％。GHA菌株在防治棉花中TPB侵染上不太有效。更具体地，施用1％生物塑料/GHA和0.04％吐温80/GHA导致TPB的死亡率分别为22和27％。在未处理的对照小块土地中观察到的死亡率为14％((图10)。

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