器官保存液的制作方法

文档序号:11235771阅读:1608来源:国知局
器官保存液的制造方法与工艺

本发明涉及器官保存液,更详细而言,涉及配合有l-抗坏血酸和l-抗坏血酸磷酸酯而成的器官保存液。



背景技术:

器官保存液作为器官移植时用于对已切除的器官进行灌注并浸渍的液体是已知的。若长时间中断血流,则生物体内的器官陷入坏死,因此,尽管已开发出了用于长时间运送为移植而摘取的器官的各种方法,但其中临床上应用最多的是单纯冷却法。该单纯冷却法中主要使用的是器官保存液。对于已摘取的器官而言,通过利用器官保存液进行灌注,并在摘取后利用相同的已冷却的器官保存液进行浸渍,从而预防坏死。

目前在器官移植的临床实践中通常使用的器官保存液是威斯康星大学液(universityofwisconsin:uw液/肾脏·肝脏·胰脏等)、euro-collins液(euro-collins:ec液/肾脏)、celsior(注册商标/心脏)、lactateringer液(肺)、组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐液(histidine-tryptophan-ketoglutarate:htk液/肝脏·心脏·胰脏·肾脏·小肠)、et-kyoto液等。除了作为缓冲液发挥作用以外,还设法为了防止因冰冻而导致的细胞膨胀而添加糖、或者添加抗氧化剂,由此防止缺血再灌注损伤的发生等。

此处所谓缺血再灌注损伤,是指对处于缺血状态的器官、组织进行血液再灌注时,在该器官·组织内的微小循环中导致各种毒性物质产生从而引起的损伤,多见于器官移植后。作为引起损伤的机制,认为是下述机制:由超氧化物(o2-)、羟基自由基(ho·)等活性氧、一氧化氮(no)等自由基的产生而导致的损伤;由各种细胞因子、内皮素、花生四烯酸等各种化学介质的产生而导致的损伤;基于活化中性粒细胞与血管内皮细胞的相互作用的损伤等。

抗坏血酸是强抗氧化剂,因此,认为其在用于除去活性氧中是有用的,该活性氧产生于缺血再灌注损伤时,是损伤移植器官的原因之一。但是,由于抗坏血酸因自动氧化而迅速消失(例如,参见非专利文献1),因而无法作为器官保存液的组成成分使用,已有在体外(invitro)添加被称为抗坏血酸2-葡糖苷的稳定型抗坏血酸(其中通过与葡萄糖的键合而将与氧化还原反应相关的部位掩蔽)的研究(例如,参见非专利文献2)。需要说明的是,抗坏血酸2-葡糖苷在没有进入细胞内时是不具有效果的前体药物,实际用于保存摘取器官时,未必能够获得保存器官的效果。

另一方面,虽然报道了通过向培养细胞的培养基中以特定的浓度比添加抗坏血酸和抗坏血酸磷酸酯,能够使抗坏血酸稳定地存在(例如,参见非专利文献3),但该结果只不过是显示出在细胞培养时抗坏血酸稳定地存在,其并未体现摘取出的器官能否长期保持其功能。

另外,含有半胱氨酸(例如,参见非专利文献4及5)的器官保存液、含有甘氨酸(例如,参见非专利文献6及7)的器官保存液、在日本较频繁使用的含有海藻糖的器官保存液et-kyoto(例如,非专利文献8)中进一步含有蛋白酶抑制剂的m-kyoto是已知的。

作为其他器官保存液,已知有含有特定的类黄酮糖苷的器官保存液(专利文献1),含有肝细胞增殖因子(hgf)的器官保存用溶液(专利文献2),含有卵磷脂化超氧化物歧化酶的器官保存液(专利文献3),以高含量含有硫酸盐、以低含量含有氯的器官保存用溶液(专利文献4),含有平均分子量为50万~65万的羟乙基淀粉、且钾离子与钠离子的摩尔比为0.4~0.8、ph值为7.1~7.5、渗透压为280~330mosm/l、粘度为1.8~2.5cp的器官保存液(专利文献5)、含有d-阿洛糖等稀有糖的保存液(专利文献6)等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开2009-221128

专利文献2:日本特开2005-306749

专利文献3:日本特开2002-60301

专利文献4:日本特开平10-245301

专利文献5:日本特开平9-328401

专利文献6:wo2005/115141

非专利文献

非专利文献1:freeradicrescommun.1986;1(6):349-53.

非专利文献2:celltransplant.2003;12(6):599-606.i

非专利文献3:invitrocell.dev.biol.--animal37:26-30,january2001

非专利文献4:transplantproc.2011oct;43(8):2897-9

非专利文献5:jheartlungtransplant.2005sep;24(9):1369-77.

非专利文献6:transplantation.2003mar15;75(5):591-8.

非专利文献7:transplint.1994may;7(3):195-200

非专利文献8:yonseimedj.2004dec31;45(6):1107-14.



技术实现要素:

发明要解决的课题

本发明的课题在于提供能够有效地防止由总缺血时间的延长而导致的缺血再灌注损伤的发生的器官保存液。

用于解决课题的手段

本申请的发明人针对上文所述的以往提案的器官保存液中添加的各成分对其组合等进行了反复试验,发现除了l-抗坏血酸及l-抗坏血酸磷酸酯以外还配合有磷酸氢二钠及磷酸二氢钠、以及氯化钾和d-葡萄糖、进一步还配合有甘氨酸、l-半胱氨酸、铁化合物而得到的器官保存液在防止发生缺血再灌注损伤方面比目前使用的器官保存液优异,从而完成了本发明。

即,本发明涉及下述各项限定的技术方案。

(1)一种器官保存液,其含有氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、l-抗坏血酸、l-抗坏血酸磷酸酯、及d-葡萄糖的配合物。

(2)如上述(1)所述的器官保存液,其特征在于,配合物还含有甘氨酸。

(3)如上述(2)所述的器官保存液,其特征在于,配合物还含有l-半胱氨酸。

(4)如上述(3)所述的器官保存液,其特征在于,配合物还含有铁化合物。

(5)如上述(1)~(4)中任一项所述的器官保存液,其特征在于,配合物中的l-抗坏血酸浓度为0.2~0.3mm,l-抗坏血酸磷酸酯浓度为0.4~0.5mm。

(6)如上述(1)~(5)中任一项所述的器官保存液,其特征在于,配合物中的磷酸氢二钠浓度为35~50mm,磷酸二氢钠浓度为12~18mm。

(7)如上述(1)~(6)中任一项所述的器官保存液,其特征在于,其中配合有d-葡萄糖,至渗透压为326~363mosm/kg。

(8)如上述(2)~(7)中任一项所述的器官保存液,其特征在于,配合物中的甘氨酸浓度为5~15mm。

(9)如上述(3)~(8)中任一项所述的器官保存液,其特征在于,配合物中的l-半胱氨酸浓度为0.5~0.7mm。

(10)如上述(4)~(9)中任一项所述的器官保存液,其特征在于,铁化合物为硫酸亚铁。

(11)一种保存器官的方法,其中,使用上述(1)~(10)中任一项所述的器官保存液。

发明的效果

通过将移植用器官浸渍于本发明的器官保存液中,能够有效地防止由总缺血时间的延长而导致的缺血再灌注损伤的发生。

附图说明

[图1]是针对将在htk液、ec液、uw液及保存液(a)~(c)的各保存液的任一者中浸渍了24小时的心脏进行异位心脏移植后的各小鼠个体示出直到移植心脏开始跳动所经时间的测定结果的图。

[图2]是针对将在htk液、ec液及保存液(a)~(c)的各保存液的任一者中浸渍了48小时的心脏进行异位心脏移植后的各小鼠个体示出直到移植心脏开始跳动所经时间的测定结果的图。

[图3]是针对将在uw液、保存液(d)3及保存液(d)6的各保存液的任一者中浸渍了24小时的心脏进行异位心脏移植后的各小鼠个体示出对直到移植心脏开始跳动所经时间的测定结果的图。

[图4]是针对将在uw液、保存液(d)3及保存液(d)6的各保存液的任一者中浸渍了24小时的心脏进行异位心脏移植后的各小鼠个体示出移植后的经过天数与心脏成活率的关系的图。

[图5]是针对将在uw液、保存液(d)3、保存液(d)6、及保存液(d)7的各保存液的任一者中浸渍了48小时的心脏进行异位心脏移植后的各小鼠个体示出直到移植心脏开始跳动所经时间的测定结果的图。

[图6]是针对将在uw液、保存液(d)3、保存液(d)6、及保存液(d)7的各保存液的任一者中浸渍了48小时的心脏进行异位心脏移植后的各小鼠个体示出移植后的经过天数与心脏成活率的关系的图。

[图7]是针对进行了异位心脏移植的各小鼠个体示出直到经移植的心脏开始跳动所经时间的图。

[图8]是示出进行了异位心脏移植的各小鼠血清中的ldh及cpk的产生量的图。

[图9]是示出经移植的心脏的成活率的图。

[图10]是示出已摘取及/或经移植的心脏的atp量的图。

[图11]示出了经ttc染色的移植心脏切片。

[图12](上部的图)示出了血管周围水肿区域相对于血管周围区域的比例。(下部的照片)示出了经h/e(苏木精/曙红)染色的移植心脏切片。

[图13]示出了使用抗cd68抗体(克隆:fa-11,biolegend公司制)、利用酶标记抗体法而染成蓝紫色的移植心脏切片。

[图14]示出了经tunel染色的移植心脏切片。

[图15]是示出移植心脏切片中发生了细胞凋亡的细胞的比例的图。

[图16]示出了利用抗8-ohdg抗体以酶标记抗体法染色、同时还利用将核染成蓝色的苏木精进行了染色的移植心脏切片。

[图17]是示出经移植的心脏的全部细胞中的8-ohdg阳性细胞的比例的图。

[图18]是示出进行了异位心脏移植的各小鼠血清中的8-ohdg量的图。

[图19]是示出将小鼠的移植心脏的组织破碎并进行定量rt-pcr时的各种炎症·氧化应激标记物相关基因的mrna的表达量的图。各图的柱从左开始表示naive、fresh、htk-48hr-poh24、c-48hr-poh24。

具体实施方式

作为本发明的器官保存液,只要是含有氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、l-抗坏血酸、l-抗坏血酸磷酸酯、及d-葡萄糖的各成分的配合物的器官保存液(a)、含有氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、l-抗坏血酸、l-抗坏血酸磷酸酯、甘氨酸、及d-葡萄糖的各成分的配合物的器官保存液(b)、含有氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、l-抗坏血酸、l-抗坏血酸磷酸酯、l-半胱氨酸、甘氨酸、及d-葡萄糖的各成分的配合物的器官保存液(c)、含有氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、l-抗坏血酸、l-抗坏血酸磷酸酯、l-半胱氨酸、甘氨酸、铁化合物、及d-葡萄糖的各成分的配合物的器官保存液(d)即可,没有特别限制,本发明的器官保存液可以以向蒸馏水等中添加并溶解上述各成分而得到的配合物的形式进行制备。另外,各成分的配合浓度只要在作为移植用器官的保存液能够达成本发明的课题的范围内即可,没有特别限定。

在上述成分中,无机盐以电离状态存在于溶液中,因此,本发明的器官保存液(a)含有氯化物离子、钾离子、钠离子、hpo42-、h2po4-、l-抗坏血酸、l-抗坏血酸磷酸酯、及d-葡萄糖,器官保存液(b)含有氯化物离子、钾离子、钠离子、hpo42-、h2po4-、l-抗坏血酸、l-抗坏血酸磷酸酯、甘氨酸、及d-葡萄糖,器官保存液(c)含有氯化物离子、钾离子、钠离子、hpo42-、h2po4-、l-抗坏血酸、l-抗坏血酸磷酸酯、l-半胱氨酸、甘氨酸、及d-葡萄糖,器官保存液(d)含有氯化物离子、钾离子、钠离子、hpo42-、h2po4-、l-抗坏血酸、l-抗坏血酸磷酸酯、l-半胱氨酸、甘氨酸、铁离子、及d-葡萄糖而成。

例如,作为配合物中的氯化钾的浓度,可合适地例举5~25mm、优选10~20mm、更优选13~17mm。即,作为配合物中的氯化物离子、钾离子的浓度,可合适地例举5~25mm、优选10~20mm、更优选13~17mm。

作为配合物中的磷酸氢二钠的浓度,可合适地例举25~60mm,优选35~50mm、更优选40~45mm。即,作为配合物中的hpo42-的浓度,可合适地例举25~60mm、优选35~50mm、更优选40~45mm。另外,作为配合物中的磷酸二氢钠的浓度,可合适地例举10~20mm、优选12~18mm、更优选14~16mm。即,作为h2po4-的浓度,可合适地例举10~20mm、优选12~18mm、更优选14~16mm。并且,作为配合物中的钠离子的浓度,可合适地例举35~80mm、优选47~68mm、更优选54~61mm。

磷酸氢二钠与氯化钾的浓度比优选为4:1~2:1。另外,磷酸二氢钠与氯化钾的浓度比优选为1:2~2:1。并且,磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的浓度比优选为4:1~2:1。

作为配合物中的l-抗坏血酸的浓度,可合适地例举0.1~0.5mm、优选0.2~0.4mm、更优选0.2~0.3mm。另外,l-抗坏血酸与氯化钾的浓度比优选为1:50~1:70。

作为配合物中的l-抗坏血酸磷酸酯的浓度,可合适地例举0.3~0.6mm、优选0.4~0.5mm、更优选0.43~0.47mm。另外,l-抗坏血酸磷酸酯与氯化钾的浓度比优选为1:25~1:40。并且,l-抗坏血酸与l-抗坏血酸磷酸酯的浓度比优选为1:1~1:3。

作为配合物中的甘氨酸的浓度,可合适地例举3~20mm、优选5~15mm、更优选8~12mm。另外,甘氨酸与氯化钾的浓度比优选为1:1~1:2。

作为配合物中的l-半胱氨酸的浓度,可合适地例举0.3~0.9mm、优选0.5~0.7mm、更优选0.60~0.65mm。另外,l-半胱氨酸与氯化钾的浓度比优选为1:20~1:25。

作为配合物中的d-葡萄糖的配合浓度,器官保存液的渗透压可合适地例举270~450mosm/kg、优选300~390mosm/kg、更优选326~363mosm/kg。

作为配合物中的铁化合物,可以为有机盐也可为无机盐,作为无机盐,可举出氯化铁、三氧化二铁、硫酸亚铁、焦磷酸亚铁,作为有机盐,可举出羧酸盐,例如作为羟基羧酸盐的柠檬酸亚铁、柠檬酸铁钠、柠檬酸亚铁钠、柠檬酸铁铵等柠檬酸盐、焦磷酸铁、乳酸铁、葡糖酸亚铁、二亚乙基三胺五乙酸铁钠、二亚乙基三胺五乙酸铁铵、亚乙基二胺四乙酸铁钠、亚乙基二胺四乙酸铁铵、二羧基甲基谷氨酸铁钠、二羧基甲基谷氨酸铁铵、富马酸亚铁、乙酸铁、草酸铁、琥珀酸亚铁、琥珀酸柠檬酸铁钠等有机酸盐、血红素铁、右旋糖酐铁、三亚乙基四胺铁、乳铁蛋白铁、转铁蛋白铁、叶绿酸铁钠、铁蛋白铁、含糖氧化铁、硫酸甘氨酸铁,其中优选为硫酸亚铁。作为铁化合物的浓度即铁离子浓度,可举出0.1μm~10mm,优选为0.5μm~5mm。

在本发明的器官保存液中,除上述各成分外,可适当配合水、生理食盐水、各种缓冲剂、维生素类、5-氨基乙酰丙酸、糖类、蛋白酶抑制剂、类黄酮糖苷、肝细胞增殖因子(hgf)、卵磷脂化超氧化物歧化酶、羟乙基淀粉、抗氧化剂、抗炎症性细胞因子、调节性t细胞、单核细胞、树状细胞、巨噬细胞等。

作为本发明的器官保存液的ph,ph为6~8,优选ph为6.5~7.5,更优选ph为7左右。另外,本发明的器官保存液通常在0℃左右使用。将器官浸渍在本发明的器官保存液中的时间(即冷缺血(冷缺血时间))为48小时以内,优选24小时以内,更优选12小时以内,但即使浸渍时间为24~48小时,缺血再灌注损伤的发生也能被有效地防止。

作为成为本发明的器官保存液的适用对象的器官,只要是能够进行移植的器官即可,没有特别限制,不仅可以是从供体摘取的器官,还可以是在体外(invitro)制作的移植物、细胞、利用再生医疗技术人工构筑的组织·器官、以及由万能细胞制作的器官等。另外,作为器官的种类,可例举肾脏、肝脏、心脏、胰脏、肺、小肠、眼球、角膜、毛发、皮肤等,其中,可合适地例举肾脏、肝脏、心脏、胰脏、肺、小肠。

使用本发明的器官保存液的器官移植可利用常规方法进行,其可以是将由供体等提供的器官浸渍于本发明的器官保存液中、然后除去受体的相应器官并将由供体等提供的器官移植到受体中的相同部位的原位器官移植,也可以是在保持残留有受体的器官的状态下将由供体等提供的器官移植到受体的其他部位的异位器官移植。

作为使用本发明的器官保存液的器官移植中的供体及/或受体,可举出人、狒狒、牛、猪、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等哺乳动物,作为所述器官移植的方式,只要是能够将器官从供体移植到受体的方式即可,没有特别限制,可举出从小鼠到小鼠、从大鼠到大鼠、从兔到兔、从狗到狗、从猫到猫、从猪到猪、从猴到猴、从狒狒到狒狒、从人到人等同种器官移植;从猪到人、从牛到人、从猴到人、从狒狒到人等异种器官移植。

以下,通过实施例来更具体地说明本发明,但本发明的技术范围并不限定于这些示例。

实施例1

(保存液的制备)

将新制备的3种器官保存液(保存液(a)~保存液(c))作为研究对象。将添加并溶解于蒸馏水中的成分的详情示于以下的表1中。在将移植用器官以超出针对以往的保存液制品规定的最大缺血容许时间的方式浸渍于上述保存液中的情况下,对移植后能否维持器官的功能进行研究。具体而言,在将浸渍于上述3种保存液中的供体小鼠的心脏移植到同株系小鼠的情况下,将移植后直到开始再跳动所经过的时间作为指标。为了进行比较研究,使用3种作为公知的现有产品的保存液,即euro-collins液(ec液)、组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐液(htk液)、威斯康星大学液(universityofwisconsin:uw液)。将上述3种现有产品的成分的详情示于以下的表2中。

[表1]

[表2]

(小鼠异位心脏移植1)

作为提供将要移植的心脏的供体小鼠、及将要移植从供体小鼠摘取的心脏的受体小鼠,使用c57bl/6ncrslc(h2-kb)株系小鼠(雄性、6~10周龄)。小鼠异位心脏移植手术步骤以wu等(europeanheartjournal(2011)32,509-516)的记载为参考,以下示出概要。

将供体小鼠麻醉后开胸,将心脏的上腔静脉结扎,并切断头臂动脉干(brachiocephalictrunk)。使用1ml肝素生理食盐水(100iu/ml)进行灌注后,将1ml上述表1中记载的各保存液(a)~(c)或上述表2中记载的作为比较研究用的3种现有产品的保存液分别自各供体小鼠的下腔静脉进行灌注,并从头臂动脉干排出。将各供体小鼠的下腔静脉结扎后,切断升主动脉和肺动脉,并将其他全部血管结扎。接下来,将供体小鼠的摘取心脏于0℃在15ml上述保存液(a)~(c)及表2中记载的3种现有产品的各保存液的任一者中浸渍24小时。

将浸渍于上述各保存液中的供体小鼠的摘取心脏移植到受体小鼠。在全身麻醉下对受体小鼠开腹后,使供体小鼠的摘取心脏的升主动脉吻合于受体小鼠的腹部大动脉,使供体小鼠的下腔静脉与受体小鼠的下腔静脉吻合,完成手术。器官移植时的温缺血时间统一为40分钟。

(经异位心脏移植的心脏的再跳动时间1)

针对将在上述各保存液中浸渍了24小时后的摘取心脏进行了异位心脏移植的各小鼠个体,对直到经移植的心脏开始跳动所经过的时间进行测定。之后,通过触诊来判断是否开始跳动。结果示于图1中。

(结果1)

由图1可见,uw液的再跳动开始时间为240秒左右,是3种现有产品中再跳动开始时间最短的,另一方面,保存液(c)的再跳动开始时间为100秒左右,时间缩短为uw液的一半以下。另外,对于从含有氯化钾、磷酸氢二钠·12水合物、磷酸二氢钠·2水合物、l-抗坏血酸、l-抗坏血酸磷酸酯镁盐n水合物、l-半胱氨酸盐酸盐1水合物、甘氨酸、d(+)-葡萄糖的保存液(c)中除去了l-半胱氨酸盐酸盐1水合物的保存液(b)而言,为与uw液同等程度的再跳动开始时间。从保存液(c)中除去了l-半胱氨酸盐酸盐1水合物及甘氨酸的保存液(a)与ec液相比,再跳动开始时间也缩短。因此,确认了在将移植器官浸渍于保存液(a)~(c)中的任一保存液的情况下,与使用3种作为现有产品的htk液、ec液、uw液的情况相比,再跳动开始时间缩短,这表明与使用现有产品进行保存的情况相比,器官的最大缺血容许时间(从器官的血流停止到移植器官后血流能够恢复为止的时间)变长。

实施例2

(小鼠异位心脏移植2)

将在各保存液中的浸渍时间设为48小时,为了进行比较研究使用了现有产品htk液、ec液,除此之外,按照上述实施例1(小鼠异位心脏移植1)的步骤进行小鼠异位心脏移植。针对进行了异位心脏移植的各小鼠个体,对直到经移植的心脏开始跳动所经过的时间进行测定。结果示于图2中。

(结果2)

由图2可见,htk液、ec液的再跳动开始时间均为1500秒以上,另一方面,保存液(a)的再跳动开始时间为500秒左右,保存液(b)的再跳动开始时间为1250秒左右,保存液(c)的再跳动开始时间为600秒左右。因此,与现有产品相比,保存液(a)~(c)均显示出良好的缩短再跳动开始时间的效果。然而,在浸渍时间为48小时的情况下,受体小鼠的死亡率变高。

实施例3

(小鼠异位心脏移植3)

作为铁添加系列保存液,进一步制备了在上述保存液(c)中添加有硫酸亚铁的保存液(d),继续进行研究。将各保存液的成分的详情示于下表3中。

[表3]

作为铁添加系列保存液,使用了保存液(d)3及保存液(d)6,为了进行比较研究使用了现有产品uw液,除此之外,按照上述实施例1(小鼠异位心脏移植1)的步骤进行小鼠异位心脏移植。在保存液中浸渍24小时后,针对进行了异位心脏移植的各小鼠个体,对直到移植心脏开始跳动所经过的时间进行测定。结果示于图3中。

进而,对于进行了上述异位心脏移植的小鼠个体而言,在心脏移植后,针对进行了异位心脏移植的各小鼠个体,对直到移植心脏停止跳动所经过的时间进行计量。结果示于图4中。

(结果3-1)

由图3也可见,现有产品uw液的再跳动开始时间为230秒左右,另一方面,保存液(d)3的再跳动开始时间为12秒,保存液(d)6的再跳动开始时间约为144秒,与现有产品uw液相比,保存液(d)3和保存液(d)6显示出明显的缩短再跳动开始时间的效果。特别是保存液(d)3显示出比上述实施例1中的保存液(c)更好的缩短再跳动开始时间的效果。

(结果3-2)

如上所述,在冷保存液中浸渍24小时后进行心脏移植,之后通过对心脏是否跳动进行触诊来判断心脏是否成活,将确认了停止跳动的日期作为心脏脱落日。即,针对进行了上述异位心脏移植的小鼠个体,对直到移植心脏停止跳动所经过的时间进行计量。由图4可知,保存液(d)3及保存液(d)6能够与uw液同样地确认心脏的成活。

实施例4

(小鼠异位心脏移植4)

作为铁添加系列保存液,使用了保存液(d)3、保存液(d)6、保存液(d)7,为了进行比较研究,使用了现有产品uw液,将在各保存液中的浸渍时间设为48小时,除此之外,按照上述小鼠异位心脏移植1的步骤进行小鼠异位心脏移植。针对进行了异位心脏移植的各小鼠个体,对直到移植心脏开始跳动所经过的时间进行测定。结果示于图5中。

进而,针对进行了上述异位心脏移植的小鼠个体,与实施例3同样地对直到移植心脏停止跳动所经过的时间进行计量。结果示于图6中。

(结果4-1)

在uw液的情况下,没有移植心脏开始再跳动的个体。关于各保存液的再跳动开始时间,保存液(d)3为260秒左右,保存液(d)6为90秒左右,保存液(d)7为820秒左右,均发生了移植心脏的再跳动。

(结果4-2)

对于移植了浸渍于uw液中的摘取心脏的小鼠而言,没有出现再跳动;

在移植了浸渍于保存液(d)3中的摘取心脏的小鼠(n=5)中,存在长时间跳动的小鼠。更详细而言,虽然当日(第0日)有2只、第1天有1只、第2天有1只小鼠的移植心脏停止跳动,但存在1只在经过60天的时间点移植心脏仍持续跳动的个体;

在移植了浸渍于保存液(d)6中的摘取心脏的小鼠(n=1)中,存在长时间跳动的小鼠。更详细而言,存在1只在经过60天的时间点移植心脏仍持续跳动的个体;

在移植了浸渍于保存液(d)7中的摘取心脏的小鼠(n=6)中,存在移植心脏长时间跳动的小鼠。更详细而言,虽然在第7天有1只小鼠的移植心脏停止跳动,但存在5只在经过30天的时间点移植心脏仍持续跳动的个体;

之后,将htk作为对照,对上述保存液(c)进一步进行研究。

实施例5

(小鼠异位心脏移植5)

作为保存液,使用保存液(c)或htk液,将来自供体小鼠的摘取心脏在保存液中浸渍24小时或48小时,除此之外,按照上述实施例1(小鼠异位心脏移植1)的步骤完成小鼠异位心脏移植的手术,制备进行了异位心脏移植的小鼠。

(进行了异位心脏移植的心脏的再跳动时间2)

针对进行了异位心脏移植的各小鼠个体,对直到移植的心脏开始跳动所经过的时间进行测定。需要说明的是,所有的再跳动都是在30分钟以内进行计量的。在再灌注后经30分钟还未开始跳动的情况下,算作1800秒。结果示于图7(a)(b)中。

(结果5)

由图7可见,在摘取心脏在保存液中的浸渍时间为24小时(参照图7(a))及48小时(参照图7(b))中的任一者的情况下,与将摘取心脏浸渍于htk液中相比,将摘取心脏浸渍于保存液(c)中时,直到移植到受体小鼠的心脏开始再跳动所经过的时间缩短。在浸渍时间为24小时情况下,浸渍于保存液(c)中的移植心脏的再跳动开始时间(约100秒)是浸渍于htk液中的移植心脏的再跳动开始时间(约300秒)的约三分之一,在浸渍时间为48小时情况下,浸渍于保存液(c)中的移植心脏的再跳动开始时间(约600秒)是浸渍于htk液中的移植心脏的再跳动开始时间(约1500秒)的约五分之二。

实施例6

(小鼠异位心脏移植6)

按照与上述实施例5(小鼠异位心脏移植5)同样的步骤完成手术,制备进行了异位心脏移植的小鼠。

(对刚刚移植后的抑制急性炎症的效果的研究)

对以下的各小鼠进行研究。

(1)移植了在保存液(c)中浸渍了24小时的摘取心脏、并从手术完成开始经过了24小时的小鼠(c-24hr-poh24);

(2)移植了在保存液(c)中浸渍了48小时的摘取心脏、并从手术完成开始经过了24小时的小鼠(c-48hr-poh24);

(3)移植了在htk液中浸渍了24小时的摘取心脏、并从手术完成开始经过了24小时的小鼠(htk-24hr-poh24);

(4)移植了在htk液中浸渍了48小时的摘取心脏、并从手术完成开始经过了24小时的小鼠(htk-48hr-poh24);

(以下,有时将上述4种小鼠统称为“(1)~(4)的小鼠”。)

进而,制备以下小鼠作为对照。

(5)未将摘取心脏浸渍在保存液中而直接进行移植、并从手术完成开始经过了24小时的小鼠(fresh);

(6)未进行移植手术的小鼠(naive);

针对上述各小鼠,从各小鼠进行采血并提取血清。针对得到的各血清,对用作对细胞的伤害的指标的cpk(肌酸磷酸激酶)和ldh(乳酸脱氢酶)的量进行测定。cpk使用fujidri-chemslidecpk-piii(fujifilm公司制)、ldh使用fujidri-chemslideldh-piii(fujifilm公司制)进行测定。结果示于图8中。

(结果6)

由图8也可见,对于血清中的ldh的产生量而言,c-48hr-poh24比htk-48hr-poh24明显减少(参照图8(a))。另外,对于血清中的cpk的产生量而言,c-48hr-poh24也比htk-48hr-poh24少(参照图8(b))。对于c-24hr-poh24和htk-24hr-poh24而言,在血清中的ldh的产生量、cpk的产生量方面没有产生差异。由以上结果可确认,在浸渍于保存液中48小时的情况下,较之用浸渍于htk液中的心脏进行异位移植的小鼠而言,在用浸渍于保存液(c)中的心脏进行异位移植的小鼠中,血清中ldh的产生被显著抑制,另外,血清中cpk的产生也被抑制。

实施例7

(对经移植的心脏的长期成活率效果的研究)

针对上述(1)~(4)的小鼠、及未将摘取心脏浸渍在保存液中而直接进行移植并且从手术完成开始经过了24小时的小鼠(fresh)的各小鼠,确认已移植的心脏成活至何时。通过对移植心脏的跳动进行触诊来确认,若跳动停止,则视为因功能停止而导致器官脱落(未成活)。最初的2周中,每天进行触诊确认,之后2.5个月中,每周进行2次触诊确认。结果示于图9中。

(结果7)

由图9可见,移植了在保存液(c)中浸渍了24小时的摘取心脏、并且从手术完成开始经过了24小时的小鼠(c-24hr(n=4))在术后第60天100%成活,与此相对,移植了在htk中浸渍了24小时的摘取心脏、并且从手术完成开始经过了24小时的小鼠(htk-24hr(n=7))的成活率仅为50%多一点。另外,移植了在保存液(c)中浸渍了48小时的摘取心脏、并且从手术完成开始经过了24小时的小鼠(c-48hr(n=4))即使在60日后也有50%成活,与此相对,移植了在htk液中浸渍了48小时的摘取心脏、并且从手术完成开始经过了24小时的小鼠(htk-48hr(n=0))的移植心脏在当日(第0日)全部脱落。由以上结果可确认,在浸渍时间为24小时及48小时中的任一者的情况下,与浸渍于htk液的心脏相比,浸渍于保存液(c)的心脏的长期成活率高。

实施例8

(对提高移植心脏的atp量的效果的研究)

针对按照上述实施例1(小鼠异位心脏移植1)的步骤制备的摘取心脏,对提高atp量的效果进行研究。

1)在保存液(c)中浸渍了24小时的摘取心脏(未移植)

(c-24hr-w/oope);

2)在保存液(c)中浸渍了48小时的摘取心脏(未移植)

(c-48hr-w/oope);

3)在htk液中浸渍了24小时的摘取心脏(未移植)

(htk-24hr-w/oope);

4)在htk液中浸渍了48小时的摘取心脏(未移植)

(htk-48hr-w/oope);

5)将在保存液(c)中浸渍了48小时的摘取心脏移植到小鼠、并且从移植手术完成开始经过了24小时的移植心脏(c-48hr-poh24);

6)将在htk液中浸渍了48小时的摘取心脏移植到小鼠、并且从移植手术完成开始经过了24小时的移植心脏(htk-48hr-poh24);

7)未将摘取心脏浸渍于保存液中而直接进行移植、并且从移植手术完成开始经过了24小时的移植心脏(fresh);

8)刚切除的心脏,且为未进行移植的小鼠心脏(naive);

利用americ-atpkit(cat.632-23881和光纯药公司制)从上述各心脏中提取atp,比较各组的atp量。结果示于图10中。

(结果8)

由图10可见,从c-24hr-w/oope提取的atp量比从htk-24hr-w/oope提取的atp量少。另一方面,从c-48hr-w/oope提取的atp量和从htk-48hr-w/oope提取的atp量两者没有显著差异。从c-48hr-poh24提取的atp量比从htk-48hr-poh24提取的atp量多。因此,就摘取后在保存液中浸渍48小时然后进行移植的心脏而言,从浸渍于保存液(c)中的心脏提取的atp量比从浸渍于htk中的心脏提取的atp量多。

实施例9

(基于组织染色的对抑制坏死部分的效果的研究)

按照与上述实施例5(小鼠异位心脏移植5)同样的步骤完成手术,制备进行了异位心脏移植的小鼠。针对在保存液(a)中浸渍了24小时后移植到受体小鼠并经过了1小时的小鼠(c-24hr-poh1、n=2)的心脏和在htk液中浸渍了24小时后移植到受体小鼠并经过了1小时的小鼠(htk-24hr-poh1、n=2)的心脏,对抑制坏死部分的效果进行研究。进行ttc(2,3,5-三苯基氯化四氮唑(cat:0765;amresco公司制))染色(仅将组织的健康部分染成红色),与未被染色仍保持呈白色状态的坏死部分的表面积进行比较。作为对照,使用刚切除的且未进行移植的心脏(naive、n=2)。对分成3份的心脏内部进行拍摄(eos,canon股份公司制),将得到的照片示于图11(a)~(c)。

(结果9)

由图11可见,与htk-24hr-poh1的心脏(图11(b))相比,c-24hr-poh1的心脏(图11(c))的白色部分(表示坏死)少,确认了与将摘取心脏浸渍于htk液中相比,将摘取心脏浸渍于保存液(c)中可防止移植心脏的坏死。

实施例10

(基于组织染色的研究)

针对按照上述实施例5(小鼠异位心脏移植5)的步骤制备的摘取心脏,利用组织染色进行观察。针对未将摘取心脏浸渍于保存液中而直接进行移植并且从移植手术完成开始经过了24小时的移植心脏(fresh)、在htk液中浸渍了24小时或48小时后移植到受体小鼠并且经过了24小时的小鼠(htk-24hr-poh24或htk-48hr-poh24)的心脏、和在保存液(c)中浸渍了24小时或48小时后移植到受体小鼠并经过了24小时的小鼠(c-24hr-poh24或c-48hr-poh24)的心脏,制作固定切片,进行h/e(苏木精/曙红)染色(其是将核染成蓝色、将细胞质染成红紫色的方法),通过用显微镜以200倍的倍率观察心肌的形态从而进行比较。将对肌细胞损伤进行染色而得到的结果示于图12(下部的照片)左侧(肌细胞损伤;a-e),将对血管周围水肿进行染色而得到的结果示于图12(下部的照片)右侧(血管周围水肿;a'-e')。另外,图12(上部的图)示出了血管周围水肿区域相对于血管周围区域的比例。

(结果10)

由图12(下部的照片)可确认,与htk-24hr-poh24或htk-48hr-poh24的心脏相比,c-24hr-poh24、c-48hr-poh24的心脏在心肌纤维间的水肿、心肌纤维的断裂、坏死心肌细胞核的消失、中性粒细胞的浸润等方面,心肌的损伤、血管周围水肿均减轻。另外,由图12(上部的图)可知,与htk-24hr-poh24或htk-48hr-poh24的心脏相比,c-24hr-poh24、c-48hr-poh24的心脏的血管周围水肿区域相对于血管周围区域的比例大幅降低。

实施例11

(对抑制巨噬细胞积聚的效果的研究)

针对上述(1)~(4)的小鼠的经移植的心脏,制作各心脏的固定切片,使用抗cd68抗体(克隆:fa-11,biolegend公司制)并利用酶标记抗体法将其染成蓝紫色,利用显微镜以200倍的倍率对cd68为阳性的巨噬细胞的分布进行观察,对在组织中积聚的巨噬细胞的数目进行比较。巨噬细胞在组织中积聚暗示该组织产生炎症。作为对照,使用刚切除且未进行移植的心脏(naive)、和未将摘取心脏浸渍在保存液中而直接进行移植并且经过了24小时的小鼠的心脏(fresh)。结果示于图13中。

(结果11)

由图13明显可见,c-24hr-poh24的心脏与htk-24hr-poh24的心脏相比,以及,c-48hr-poh24的心脏与htk-48hr-poh24的心脏相比,cd68为阳性的巨噬细胞的染成蓝紫色的部分的密度小,巨噬细胞向心脏的积聚少。由此,确认了在浸渍摘取心脏的时间为24小时及48小时中的任一者的情况下,与使用htk液作为浸渍摘取心脏的保存液相比,使用保存液(c)也可抑制组织中的炎症。

实施例12

(对抑制细胞死亡的效果的研究)

针对上述(1)~(4)的各小鼠的经移植的心脏,制作各心脏的固定切片,对抑制细胞死亡的效果进行研究。使用cardiotacsinsituapoptosisdetectionkit(trevigen公司,cat.4827-30-k)进行tunel(terminaldeoxynucleotidyltransferasedutpnickendlabelling)染色(将发生凋亡的细胞染成蓝紫色),然后利用显微镜以100、200倍的倍率进行观察,对tunel阳性细胞的数目进行比较。另外,对任意的9hpf/sample(≥3只/组)中的进行了染色的凋亡细胞的数目进行计数,计算在全部细胞中的比例并进行比较。作为对照,使用刚切除的且未进行移植的心脏(naive)、和未将摘取心脏浸渍于保存液中而直接进行移植且经过了24小时的小鼠的心脏(fresh)。结果示于图14和图15的图中。

(结果12)

由图14明显可见,就c-24hr-poh24的心脏(参照图14(d))和htk-24hr-poh的心脏(参照图14(c))而言,蓝紫色的量没有显著差异,但与c-48hr-poh24的心脏(参照图14(f))相比,htk-48hr-poh24的心脏(参照图14(e))的蓝紫色显著增多。另外,由图15明显可见,与c-48hr-poh24的心脏、fresh的心脏相比,发生细胞凋亡的细胞的比例在htk-48hr-poh24的心脏中显著增多。因此,确认了在摘取心脏的浸渍时间为48小时的情况下,与使用htk液作为保存液相比,使用保存液(c)可显著地抑制细胞凋亡。

实施例13

(对抑制细胞中的dna损伤的效果的研究)

针对移植了在上述保存液(c)或htk液中浸渍了24小时的摘取心脏并且从手术完成开始经过了24小时的小鼠(c-24hr-poh24或htk-24hr-poh24)的各心脏,制作心脏的固定切片,对抑制dna损伤的效果进行研究。利用将核染成褐色的抗8-ohdg抗体并使用酶标记抗体法(mog-100p、japaninstituteforcontrolofaging、nikkenseilco.)进行染色,同时还利用将核染成蓝色的苏木精进行染色。利用显微镜以100、200倍的倍率对该切片进行观察,对8-ohdg阳性细胞的数目进行比较。需要说明的是,8-ohdg为dna损伤标记物,显示出由活性氧导致的细胞的损伤程度。作为对照,使用刚切除的心脏(naive)和切除后立即移植且经过了24小时的心脏(fresh-poh24)。另外,对任意的9hpf/sample(≥3只/组)中的进行了染色的8-ohdg阳性细胞数进行计数,计算在全部细胞中的比例。结果示于图16的染色图和图17的图中。

(结果13)

由图16可见,与htk-24hr-poh24的心脏(参照图16(c))相比,c-24hr-poh24的心脏(参照图16(d))的被染成褐色的8-ohdg阳性细胞的数目少,因此,dna损伤被抑制,另外,由图17可见,与c-24hr-poh24、fresh-poh24相比,htk-24hr-poh24的经染色的8-ohdg阳性细胞数明显增多,确认了在摘取心脏的浸渍时间为24小时的情况下,与使用htk液作为保存液相比,使用保存液(c)可显著地抑制由活性氧导致的dna伤害。需要说明的是,对于摘取心脏的浸渍时间为48小时时的数据而言,由于心肌组织破坏,背景噪声(background)变高,无法对阳性细胞进行计数,因此未示出数据。

实施例14

(抑制血清中的dna损伤的效果的研究)

针对移植了在上述保存液(c)或htk液中浸渍了48小时的摘取心脏并且从手术完成开始经过了24小时的小鼠(c-48hr-poh24或htk-48hr-poh24),从各小鼠进行采血并提取血清,对抑制dna损伤的效果进行研究。从各小鼠进行采血并提取血清。使用highlysensitiveelisakitfor8-ohdg(kog-hs10/e,japaninstituteforcontrolofaging,nikkenseilco.公司制),对血清中的8-ohdg量进行比较。作为对照,使用未进行移植手术的小鼠(naive)、和摘取后立即进行移植并且经过了24小时的小鼠(fresh)。结果示于图18中。

(结果14)

由图18可以确认的是,在摘取心脏的浸渍时间为48小时的情况下,与使用htk液作为保存液相比,使用保存液(c)可显著地抑制dna损伤。

实施例15

(炎症·氧化应激标记物基因表达的变化的研究(定量rt-pcr))

针对移植了在上述保存液(c)或htk液中浸渍了48小时的摘取心脏并且从手术完成开始经过了24小时的小鼠(c-48hr-poh24或htk-48hr-poh24)的经移植的心脏,将组织破碎后提取总rna,使用primescript(注册商标)rtreagentkit(takarabio公司制)将其逆转录为cdna,使用premixextaqtm(takarabio公司制)通过定量rt-pcr对与炎症·氧化应激相关的基因簇的表达加以比较。

作为未处理组,使用刚切除的心脏(naive)和切除后立即移植并且经过了24小时的小鼠的心脏(fresh)。结果示于图19中。在图19中,对于il-6,从左起为naive(n=5)、fresh(n=3)、htk-48hr-poh24(n=5)、c-48hr-poh24(n=4);ho-1为naive(n=6)、fresh(n=3)、htk-48hr-poh24(n=4)、c-48hr-poh24(n=5);对于inos,从左起为naive(n=6)、fresh(n=3)、htk-48hr-poh24(n=4)、c-48hr-poh24(n=5);对于cd11b,从左起为naive(n=6)、fresh(n=3)、htk-48hr-poh24(n=4)、c-48hr-poh24(n=4);对于nrf2,从左起为naive(n=6)、fresh(n=3)、htk-48hr-poh24(n=3)、c-48hr-poh24(n=5);对于nf-kb,从左起为naive(n=6)、fresh(n=3)、htk-48hr-poh24(n=3)、c-48hr-poh24(n=5);对于tnf-α,从左起为naive(n=6)、fresh(n=3)、htk-48hr-poh24(n=3)、c-48hr-poh24(n=5);arg-1为naive(n=6)、fresh(n=3)、htk-48hr-poh24(n=3)、c-48hr-poh24(n=5);对于hif-1α,从左起为naive(n=6)、fresh(n=3)、htk-48hr-poh24(n=3)、c-48hr-poh24(n=5);对于tgf-β,从左起为naive(n=6)、fresh(n=3)、htk-48hr-poh24(n=3)、c-48hr-poh24(n=5)。

(结果15)

与htk-48hr-poh24的心脏相比,c-48hr-poh24的心脏的显示出明显低的值的项目是il-6:炎症性细胞因子基因;ho-1:抗氧化蛋白基因;inos:抗氧化蛋白基因;cd11b:在损伤部位积聚的巨噬细胞的标记基因。另一方面,与htk-48hr-poh24的心脏相比,c-48hr-poh24的心脏的显示出明显高的值的项目是nrf2;nf-kb;hif-1α:细胞的与应激反应相关的转录因子;tgf-β:炎症抑制性细胞因子基因。这表明使用保存液(c)作为保存液可抑制炎症。

产业上的可利用性

本发明在器官移植这样的医疗领域中有用。

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