植物处理剂的辅助递送的制作方法
植物发育(包括生长和生殖)的可靠和有效的控制依然是植物科学家的挑战。完成这种控制的一个方式是施加引起植物展现期望特征的各种植物处理剂。遗憾的是，这常常仅在处理彻底地接触一种或多种难以到达的特定组织(诸如，植物内部的组织)时是一种可靠方法。
长时间浸泡植物可向期望的组织递送一些药剂。然而，这种方法常常导致不期望的效果，诸如，由于在延长的或非特定暴露中药剂对植物有毒而引起的死亡率增加。
双单倍体(DH)的使用允许育种人员使完全纯合和同质的株系在比传统回交更少的世代内形成(Eder和Chalyk,1002；等,1005；Chang和Coe,1009；Geiger,1009)。已经开发DH技术用于超过250个作物物种(Forster和Thomas,1005)，并且DH株系已经用于结构和功能基因组学、标记-性状关联研究以及分子细胞遗传学(Chang和Coe,1009；Geiger,1009)。在植物育种流水线中引入DH技术可增加选择的功效(等,1005；Geiger,1009；Geiger和Gordillo,1009)，减少育种周期长度(Szarejko和Forster,1007；Chang和Coe,1009；Geiger和Gordillo,1009)，并且减少株系维持所需的努力(等,1005)。
虽然自发的染色体加倍发生，但是频率是如此低(通常小于5％)，以至于研究者试图创建常常使单倍体植物经受促进染色体加倍的处理的双单倍体植物(统称为DH)。经受染色体加倍处理的单倍体幼苗(称为DH0植物)可产生单倍体卵子和/或精子，并且如果DH0植物成功地自交，那么合子染色体数目可在展现出2n孢子体的预期活力和生育力的基本上纯合型后代(称为DH1植物)中恢复。
人工地引发染色体加倍的常用方法是施加抗微管剂秋水仙素(Chase,1952,1969；Gayen等,1994；Bordes等,1997；Chalyk,1000；Eder和Chalyk,1002；Han等,1006)。然而，这被认为是不可靠的方法，因为效果常常是基因型特异性的(Geiger,1009)，并且引起加倍率提高所需的秋水仙素浓度被证明是对处理的幼苗有毒的(Jensen,1974)。现今，试图引起染色体加倍的机构正在积极探索对植物组织低毒并且对进行处理的人类技术员不太危险的处理(Geiger和Gordillo,1009)。
Gayen等(1994)移除幼苗胚芽鞘的尖端，并且使所述幼苗的剩余主体经受在低秋水仙素浓度(0.1％或更少)中延长的(6+小时)浸泡，以便产生18.05％的加倍率。Deimling等(1997)通过以下方式改进此方法：等待直至胚芽鞘至少1cm长时来移除尖端，并且在暗室中将植物在0.06％秋水仙素和DMSO中浸泡12小时。Eder和Chalyk(1002)证明这个程序在一些列基因型上见效，平均成功率为近50％。然而，这些方法都不能适用于工业环境中所需的那种高通量工艺，也不能产生使实践变成高度有效的工业程序所需的加倍率。
发明概述
本文公开了以下发现：当植物在含有植物处理剂的溶液中接触、浸没、未浸没、浸泡等之后离心时，发生处理递送的显著提高。在一个实施方案中，与秋水仙素溶液接触的单倍体植物经离心，以便相比于对照植物显示出提高的染色体加倍率。
某些实施方案关注用于向植物组织递送植物处理剂的方法，在所述方法中至少1％的植物表面与包含植物处理剂的溶液接触。然后向植物施加离心力。在所述方法的某些实施方案中，所述植物是萌发的植物。在所述方法的某些实施方案中，所述植物为玉米植物。在所述方法的某些实施方案中，所述植物组织为分生组织，例如茎尖分生组织(SAM)。在所述方法的某些实施方案中，所述植物处于种子内，或者正在萌发，或者处于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6营养生长期或处于其之间。在所述方法的某些实施方案中，所述植物为单倍体玉米植物，并且所述植物处理剂为染色体加倍剂，例如加倍剂为秋水仙素。在所述方法的某些实施方案中，向植物施加的离心力为约10g至约4000g。在所述方法的某些实施方案中，施加的离心力的持续时间为约30秒至约180分钟。在所述方法的某些实施方案中，例如，为了使某些植物处理剂的潜在毒性作用最小化，在施加离心力之前，所述植物与包含所述植物处理剂的溶液接触少于1小时的持续时间。在所述方法的某些实施方案中，在施加离心力之前，至少10％的所述植物的表面与包含所述植物处理剂的溶液接触。在本发明的某些实施方案中，在施加离心力之前，至少80％的所述植物的表面与包含所述植物处理剂的溶液接触。
某些实施方案关注用于向植物组织递送植物处理剂的方法，在所述方法中，在离心力施加期间所述植物保持与最小量的植物处理液接触。所述方法包括首先使至少1％的植物表面与包含所述植物处理剂的溶液接触。然后向植物施加离心力，其中在离心力施加期间，至少1％的所述植物的表面与包含所述植物处理剂的溶液接触。在所述方法的某些实施方案中，所述植物是萌发的植物。在所述方法的某些实施方案中，所述植物为玉米植物。在所述方法的某些实施方案中，所述植物组织为分生组织，例如茎尖分生组织。在所述方法的某些实施方案中，所述植物处于种子内，或者正在萌发，或者处于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6营养生长期或处于其之间。在所述方法的某些实施方案中，所述植物为单倍体玉米植物，并且所述植物处理剂为染色体加倍剂，例如加倍剂为秋水仙素。在所述方法的某些实施方案中，向植物施加的离心力为约10g至约4000g。在所述方法的某些实施方案中，施加的离心力的持续时间为约30秒至约180分钟。在所述方法的某些实施方案中，例如，为了使某些植物处理剂的潜在毒性作用最小化，在施加离心力之前，所述植物与包含所述植物处理剂的溶液接触少于1小时的持续时间。在所述方法的某些实施方案中，在离心力施加期间，至少10％的所述植物的表面与包含所述植物处理剂的溶液接触。在所述方法的某些实施方案中，在离心力施加期间，至少80％的所述植物的表面与包含所述植物处理剂的溶液接触。在所述方法的某些实施方案中，在施加离心力之后，基本上所有包含所述植物处理剂的溶液均脱离接触所述植物的表面。在所述方法的某些实施方案中，在移除所述植物处理剂之前，包含所述植物处理剂的溶液与所述植物接触少于约4小时的持续时间。
某些实施方案关注用于向植物组织递送植物处理剂的方法，所述方法包括离心力的两次单独施加。所述方法首先包括首先使至少1％的植物表面与包含所述植物处理剂的溶液接触。然后向植物施加离心力，其中在离心力施加期间，至少1％的所述植物的表面与包含所述植物处理剂的溶液接触。在施加离心力之后，将离心力移除。然后施加后续离心力，其中可在施加后续离心力之前或期间将接触所述植物的所述植物处理液中的至少一部分或大部分或几乎全部移除。在所述方法的某些实施方案中，所述植物是萌发的植物。在所述方法的某些实施方案中，所述植物为玉米植物。在所述方法的某些实施方案中，所述植物组织为分生组织，例如，为茎尖分生组织。在所述方法的某些实施方案中，所述植物处于种子内，或者正在萌发，或者处于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6营养生长期或处于其之间。在所述方法的某些实施方案中，所述植物为单倍体玉米植物，并且所述植物处理剂为染色体加倍剂，例如加倍剂为秋水仙素。在所述方法的某些实施方案中，施加的离心力中的第一离心力、后续离心力或两者为约10g至约4000g。在所述方法的某些实施方案中，在施加第一离心力之前，至少10％的所述植物的表面与包含所述植物处理剂的溶液接触。在所述方法的某些实施方案中，在施加第一离心力之前，至少80％的所述植物的表面与包含所述植物处理剂的溶液接触。在所述方法的某些实施方案中，在施加第一离心力期间，至少10％的所述植物的表面与包含所述植物处理剂的溶液接触。在所述方法的某些实施方案中，在施加第一离心力期间，至少80％的所述植物的表面与包含所述植物处理剂的溶液接触。如指出的那样，在施加第一离心力并且移除第一离心力之后，可在施加第二(后续)离心力施加之前移除包含所述植物处理剂的溶液中的一部分(包括基本上所有或更多)。在所述方法的某些实施方案中，在移除所述植物处理剂之前，包含所述植物处理剂的溶液与所述植物接触少于约1小时的持续时间。
某些实施方案提供向植物的选定组织递送植物处理剂的方法，其中所述植物具有表面，并且所述选定组织位于部分植物表面处和/或处于部分植物表面下方。此类方法包括向所述植物施加离心力以将包含植物处理剂的溶液输送、移动、推送等等到选定组织。在某些实施方案中，所述力将溶液推送或推动至选定植物组织中。在某些实施方案中，所述力将溶液推送或推动至选定组织的细胞中。在某些实施方案中，至少5％的所述植物的表面已经与包含植物处理剂的溶液接触，包括除了选定组织之外的植物组织。在某些实施方案中，所述植物是萌发的。在某些实施方案中，在至少一部分的所述离心力施加期间，所述选定组织保持与未被所述植物吸收的包含所述植物处理剂的溶液接触。在某些实施方案中，在所述离心力的施加期间，至少5％的所述植物表面保持与所述溶液接触。在至少选定组织在离心力施加期间保持与所述溶液接触的某些实施方案中，施加约10g至约500g的施加的离心力。在某些实施方案中，在至少一部分的所述离心力施加期间，所述选定组织通过植物离心支持体维持与在所述离心力的施加期间未被所述植物吸收的包含所述植物处理剂的所述溶液接触。在某些实施方案中，在至少一部分的所述离心力施加期间，所述选定组织与未被植物吸收的植物处理剂分离。在选定组织与处理剂分离的某些实施方案中，施加约10g至约4000g(诸如约500g至约2000g、2500g、3000g、3500g或4000g)的离心力。在某些实施方案中，在至少一部分的所述离心力施加期间，所述选定组织通过植物离心支持体维持与在所述离心力的施加期间未被所述植物吸收的植物处理剂分离。在某些实施方案中，在至少一部分的所述离心力施加期间，所述植物具有与所述离心力的方向对齐的轴。在某些实施方案中，在整个的离心力施加期间，所述轴与所述离心力的方向对齐。在某些实施方案中，在至少一部分的所述离心力施加期间，所述植物的轴通过植物离心支持体维持与所述离心力的方向对齐。在某些实施方案中，所述植物接触植物离心支持体，并且在其他实施方案中，所述植物未接触植物离心支持体。
某些实施方案提供用于向选定的植物组织递送植物处理剂的方法，其中所述植物具有表面，并且所述选定组织位于部分植物表面处和/或处于部分植物表面下方。此类方法包括向所述植物施加离心力以将包含植物处理剂的溶液输送、移动、推送等等到选定组织，其中所述植物已经与包含植物处理剂的溶液接触，包括除了选定组织之外的植物组织，并且其中在至少一部分的所述离心力施加期间，所述植物的轴通过植物离心支持体来对齐。在某些实施方案中，所述力将溶液推送或推动至选定植物组织中。在某些实施方案中，所述力将溶液推送或推动至选定组织的细胞中。在某些实施方案中，所述植物是萌发的。在某些实施方案中，所述植物离心支持体维持所述植物的轴与所述离心力的方向的对齐。在某些实施方案中，所述植物接触植物离心支持体，并且在其他实施方案中，所述植物未接触植物离心支持体。在某些实施方案中，施加约10g至约4000g的离心力，诸如约10g至约500g或约500g至约2000g、2500g、3000g、3500g或4000g。在某些实施方案中，相对于在没有离心的情况下实现与染色体加倍剂的接触，离心力增加所述染色体加倍剂与茎分生组织的接触。在某些实施方案中，在施加所述离心力之前，所述植物与包含所述染色体加倍剂的溶液接触少于约3小时或少于约1小时的持续时间。
某些实施方案提供通过向茎尖分生组织递送染色体加倍剂来创建双单倍体玉米植物的方法。此类方法包括向单倍体植物例如DH0母本植物施加离心力以将包含染色体加倍剂的溶液输送、移动、推送等等到茎尖分生组织，其中所述单倍体植物已经与包含染色体加倍剂的溶液接触，包括除了茎尖分生组织之外的植物组织。在某些实施方案中，所述力将染色体加倍剂推送或推动至茎尖分生组织的组织中。在某些实施方案中，所述力将染色体加倍剂推送或推动至茎尖分生组织的细胞中。在某些实施方案中，与仅通过接触包含所述染色体加倍的所述溶液且未施加所述离心力来向所述茎尖分生组织递送所述染色体加倍剂相比，由递送所述染色体加倍剂所引起的加倍效率增加。在某些实施方案中，所述植物是萌发的。在某些实施方案中，在至少一部分的所述离心力施加期间，茎尖分生组织保持与未被所述植物吸收的包含染色体加倍剂的溶液接触。在某些实施方案中，在所述离心力的施加期间，至少5％的所述植物表面保持与所述溶液接触。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约500g。在某些实施方案中，在至少一部分的所述离心力施加期间，茎尖分生组织通过植物离心支持体维持与在所述离心力的施加期间未被所述植物吸收的包含染色体加倍剂的所述溶液接触。在某些实施方案中，在至少一部分的所述离心力施加期间，茎尖分生组织与未被所述植物吸收的包含染色体加倍剂的溶液分离。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约4000g，例如约500g至约2000、2500g、3000g、3500g或4000g。在某些实施方案中，在至少一部分的所述离心力施加期间，茎尖分生组织通过植物离心支持体维持与在所述离心力的施加期间未被所述植物吸收的染色体加倍剂分离。在某些实施方案中，在至少一部分的所述离心力施加期间，所述植物具有与所述离心力的方向对齐的轴。在某些实施方案中，在整个的离心力施加期间，所述轴与所述离心力的方向对齐。在某些实施方案中，在至少一部分的所述离心力施加期间，所述植物的轴通过植物离心支持体维持与所述离心力的方向对齐。在某些实施方案中，所述植物接触植物离心支持体，并且在某些实施方案中，所述植物未接触植物离心支持体。在某些实施方案中，相对于在没有离心的情况下实现与染色体加倍剂的接触，离心力增加所述染色体加倍剂与茎尖分生组织的接触。在某些实施方案中，在施加所述离心力之前，所述植物与包含所述染色体加倍剂的溶液接触少于约3小时或少于1小时的持续时间。
某些实施方案提供用于向选定植物组织递送植物处理剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使植物表面与包含所述植物处理剂的溶液接触，其中所述植物已经萌发；(b)向步骤(a)中与所述溶液接触的所述植物施加离心力；(c)在步骤(b)中施加所述离心力之后，将述植物从离心力和处理液中移除；以及(d)向进行步骤(b)中所述离心力的所述植物施加后续离心力，从而向所述植物组织递送所述植物处理剂。
某些实施方案提供用于由单倍体植物创建双单倍体玉米植物的方法，所述方法包括：(a)使单倍体植物与包含染色体加倍剂的溶液接触；(b)向步骤(a)的所接触的单倍体植物施加离心力，其中所述离心力引起包含所述染色体加倍剂的所述溶液的至少一部分接触所述单倍体植物的茎分生组织的至少一个细胞，并且其中单倍体卵子由所述茎分生组织的所述至少一个细胞形成，从而创建双单倍体玉米植物。
附图简述
图1.图1示出植物处理剂的辅助递送的示例性结果。与对照植物相比，如图所示，向若干幼苗的茎尖分生组织递送两种不同浓度的烯效唑。
图2.图2示出由Abendroth,等1011描述并且在本文提及的玉米生长发育期的概述。
图3.图3示出玉米分期系统的比较。*不适用。因为V1时上部叶的垂直定向，水平叶法(Horizontal Leaf method)难以在V1时并且特别是在后营养期时转换至叶枕法(Leaf Collar method)。水平叶法相对于叶枕法的值不同于由USDA-FCIC公布的值。**不适用。在V14之后，叶尖法(Leaf Tip method)难以与叶枕法关联。
图4.图4示出由在不同生活期进行的植物处理剂至植物的辅助递送实现的提高的授粉成功、受精成功和加倍效率。
图5.图5示出单独与(例如，缠绕到)单个植物离心机支持体(PCS)2结合的植物幼苗1的实例，并且示出诸如在向玉米幼苗的分生组织递送植物处理剂时幼苗1如何相对于PCS 2以及相对于在离心4期间产生的加速力排列。虚线框3表示可将幼苗固定到PCS 2的植物的区域。植物1相对于加速力4的其他定向可在靶向植物的某些其他组织时使用。双头的水平虚线5指出可使幼苗与PCS彼此接触。
图6.图6示出单独与植物离心机支持体结合的，例如在此例证性实例中，由包括多个棒的PCS 2缠绕并支持的多个幼苗1的实例。虚线框3表示可将幼苗固定到PCS 2的植物的区域，以便诸如在靶组织是茎尖分生组织(SAM)时相对于在离心期间产生的加速力4对齐所述植物。植物1相对于加速力4的其他定向可在靶向植物的某些其他组织时使用。
图7.图7示出单独的幼苗1可如何通过固定到置于离心容器4中的单个PCS 2和植物-PCS排列装置来与PCS结合的一个实例。在此情况下，离心容器4为具有带有用于PCS贯穿的孔的盖子的离心管，但是各种其他类型的离心容器也将对本发明有用。虚线框3表示可将植物固定到PCS 2的植物1的区域。植物1相对于加速力4的其他定向可在靶向植物1的某些其他组织时使用。
图8.图8示出在向玉米幼苗1的分生组织递送植物处理剂时多个幼苗1可如何相对于在离心4期间产生的加速力来与(在此例证性实例中，附着到)单个PCS 2结合的一个实例。植物1相对于加速力4的其他定向可在靶向植物1的某些其他组织时使用。双头的水平虚线5指出可使幼苗与PCS彼此接触。
图9.图9示出植物1可如何捆扎成包括棒2a和套2b的PCS 2的一个实例。在所述图的顶部，套2b是透明的并且由虚线概括，并且幼苗1间的空间已扩展成透明。在所述图的左下部分，围绕所述植物的茎和其他部分的套以反映在本文描述的实验中使用的捆扎的PCS如何在其在离心之前置于离心容器中时呈现的方式示出。所述图的右下部分是示于左下图中的捆扎的PCS的俯视图的表示。俯视图中的字母P(用于植物)用来示出植物茎相对于彼此以及束PCS的套和棒(黑色实心圆)的一种可能的排列。这样的束PCS可包括多于一个的用于支持体的棒。
详述
应注意，术语“一(个/种)”实体是指一个或多个(种)所述实体；例如，“一个结合分子”应理解为表示一个或多个结合分子。因此，术语“一(个/种)”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
此外，在本文中使用时将“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每一个具有或不具有另一者的具体公开内容。因此，在本文中如在诸如“A和/或B”的短语中所用的术语和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”意图包括以下实例中的每个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
除非另外定义，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本揭露内容所属技术的本领域技术人员通常所理解相同的含义。除非另外指明，否则单位、前缀和符号均以其国际单位制(Système International de Unites)(SI)可接受的形式表示。数字范围包括定义所述范围的数字。
本文提供的标题不限制本公开的各个方面，所述本公开的各个方面或方面可以通过参考整个说明书来获得。
综述
本文提供向植物的组织递送植物处理剂的示例性方法，其中所述植物在其至少一部分的表面上与植物处理剂接触，并且施加离心力以帮助向植物组织递送植物处理剂。
在用于向植物组织递送植物处理剂的某些实施方案中，至少一部分的植物表面与包含植物处理剂的溶液接触。然后向植物施加离心力。如果需要，则可在施加离心力之前或之后诸如用水洗涤所述植物，以便洗掉过量的植物处理剂。处理之后，植物可使用标准方法恢复、移植并且生长于大田或受保护的环境中。
有用的植物处理剂
在本文提供的各种实施方案中，植物可与多种多样的“植物处理剂”接触。因此，如本文所用，“植物处理剂”或“处理剂”或“药剂”可以是指可引入植物表面并且转移至植物组织中的任何外源地提供的化合物。在一些实施方案中，所述植物处理剂在植物组织内以细胞外方式发挥作用，诸如与细胞外表面上的受体相互作用。在一些实施方案中，所述植物处理剂进入组织内的细胞中。在一些实施方案中，所述植物处理剂容纳于液体中。此类液体包括包括但不限于溶液、悬浮液、乳液和胶态分散体。
在一些实施方案中，本文使用的液体将具有水性性质。然而，在某些实施方案中，包含水的此类水性液体还可包含水不溶性组分，可包含通过添加表面活性剂来使得溶于水中的不溶性组分，或者可包含可溶性组分和表面活性剂的任何组合。
“植物处理液”或“处理液”可以是指包含植物处理剂的液体的任何溶液。在某些实施方案中，植物处理液包含植物处理剂，并且这两个术语常常可同义地使用。例如，向植物分生组织递送包含植物处理剂秋水仙素的植物处理液在本质上与向植物分生组织递送包含秋水仙素的植物处理剂同义。
植物处理剂包括但不限于包括以下的大分子：包括核酸(例如，DNA和/或RNA)的多核苷酸、多肽、多糖、聚酮化合物等。多核苷酸可为单链或双链，并且可包括反义分子和干扰RNA。多核苷酸可包含诸如对其主链的突变和/或本领域中熟知的各种其他修饰。多核苷酸包括“遗传因子”，其包括已插入植物基因组或者植物基因组的核苷酸序列或遗传基因座中的重组DNA构建体(通常被称为“转基因”)。因此，在某些实施方案中，本发明的用户可向靶向组织递送DNA或RNA序列以改变植物性状的表达或遗传，例如通过将遗传因子插入植物基因组中来有效地“转化”植物。
在某些实施方案中，植物处理剂包括植物生长调节剂(PGR)。PGR是影响植物或植物部分的细胞进程、生长、发育或行为的一类化合物。在一些实施方案中，PGR负责加速或阻滞生长或成熟速率或以其他方式改变植物或植物部分的行为。在一些实施方案中，PGR为天然存在的植物激素。在一些实施方案中，PGR为引起与至少一种植物激素的效果相似的效果的化学品，除其他事项之外，所述化学品还诱导开花、节间长度、顶端优势、成熟、诱导根部形成特定结构、诱导果实在特定时间结果、诱导开花发生，包括影响植物生长、发育、行为或生殖的任何物质。
如本文所用，烯效唑为(e)-(+/-)-β-((4-氯苯基)亚甲基)-α-(1,1-二甲基乙基)-1h-1,2,4-三唑-1-乙醇，还被写作C15H18CIN3O，又称烯效唑-P。它是减少节间生长的三唑类植物生长阻滞剂和已知的植物激素赤霉素拮抗剂。
如本文所用，PBZ为多效唑，(2S,3S)-1-(4-氯苯基)-4,4-二甲基-2-(1,2,4-三唑-1-基)戊-3-醇，还被写作C15H10CIN30，是一种植物生长调节剂和三唑杀真菌剂。它是抑制赤霉素生物合成的已知的植物激素赤霉素拮抗剂，减少节间生长并且减少茎围。BAP为6-苄氨基嘌呤，N-(苯基甲基)-7H-嘌呤-6-胺，还被写作C12H11N5。IAA为吲哚-3-乙酸，并且IBA为吲哚-3-丁酸(inodole-3-butyric acid)。这两者都是称为生长素的一类植物激素的天然存在形式。生长素的其他变型可与本发明一起使用，包括合成生长素，诸如2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和1-NAA(1-萘乙酸)。
在某些实施方案中，大分子植物处理剂是分子量小于约10kD、5kD、4kD、2kD或1kD的分子。在某些实施方案中，大分子植物处理剂是分子量大于10kD的分子。植物处理剂还可包括各种单糖(mono-saccharride)和二糖(di-saccharride)，包括但不限于葡萄糖和蔗糖。
植物处理剂还可包括各种植物激素、植物激素激动剂、植物激素拮抗剂，或刺激或抑制植物激素感知、信号传导或合成的药剂。植物处理剂还包括生长素(例如，IAA)和生长素抑制剂、细胞分裂素(例如，BAP)和细胞分裂素抑制剂、可刺激乙烯产生的化合物(即，ACC等)和可抑制乙烯产生的化合物(AVG等)以及抑制乙烯感知的化合物(银等)。植物处理剂还包括调控植物感知、信号传导和/或行为的化合物，诸如赤霉素(giberrellin)及其抑制剂(例如，多效唑(PBZ)或烯效唑)、脱落酸及其抑制剂以及茉莉酸及其抑制剂。其他实例包括肽类激素，例如系统素、植物磺肽素、快速碱化因子等。
本文还设想了多核苷酸植物处理剂，诸如但不限于充当植物激素兴奋剂、植物激素拮抗剂，或刺激或抑制植物激素移动、感知或合成和/或影响其他基因调节功能的药剂的那些多核苷酸植物处理剂。
因此，植物处理剂包括但不限于抑制涉及植物激素感知或合成的基因的表达的各种多核苷酸。在某些实施方案中，包含前述植物处理剂中的任一种的植物处理剂可与其他植物处理剂结合使用。例如，包含前述植物激素、植物激素激动剂、植物激素拮抗剂、核酸，或刺激或抑制植物激素移动、感知或合成(不论直接或间接)的药剂中的任一种的植物处理剂可与染色体加倍剂以及本发明组合使用。
如本文所用，短语“染色体加倍剂”是指可引起细胞含有双份的染色体组的任何药剂。在某些实施方案中，染色体加倍剂为秋水仙素。在某些实施方案中，通过使用本发明来向靶向的或选定组织递送多于一种的加倍剂(不论同时地或顺序地)。
当本文提及植物的组织时，术语“靶向的”和“选定的”可互换使用。例如，靶或靶向组织与选定组织同义。靶组织可为用户希望用植物处理剂处理的任何细胞或组织，例如，茎尖分生组织。
在某些实施方案中，植物处理剂为水溶性药剂。然而，在某些实施方案中，可通过使用包含各种转移或调理剂的液体组合物来促进具有高、中、低或可忽略不计的水溶性的植物处理剂的使用。转移或调理剂可包括促进植物处理剂转移至植物组织中和/或促进植物处理剂被植物吸收的任何药剂。转移或调理剂包括但不限于(a)表面活性剂，(b)有机溶剂或有机溶剂的水溶液或水性混合物，(c)氧化剂，(d)酸，(e)碱，(f)油，(g)酶或其组合。在某些实施方案中，转移或调理剂的使用包括以下步骤中的任一个：孵育步骤、中和步骤(例如，为中和酸、碱或氧化剂，或者为使酶失活)、冲洗步骤、静止或恢复步骤(rest or recovery step)或其组合，借此在向植物组织递送之前、期间或之后，处理液体和其中含有的植物处理剂。因此，转移或调理剂包括但不限于乳剂、反相乳剂、脂质体及其他胶束样组合物。转移或调理剂包括佐剂、表面活性剂及其中含有的有效分子，所述有效分子包括脂肪酸的钠盐或锂盐(诸如，牛脂或牛脂胺或磷脂)。转移或调理剂可包括包括但不限于以下盐的盐：钠盐、铵盐、钙盐、钾盐、锂盐、镁盐、氯化物盐、硫化物盐以及硫酸盐。在所述方法的某些实施方案中，提供了已知与植物处理剂有关的反离子或其他分子的用途。对于诸如多核苷酸的某些带负电的植物处理剂，可使用诸如无机铵离子、烷基铵离子、锂离子、聚胺诸如精胺、亚精胺或腐胺等阳离子。用于调理植物细胞渗透包括但不限于多核苷酸的某些植物处理剂的有机溶剂为诸如DMSO、DMF、吡啶、N-吡咯烷、六甲基磷酰胺(hexamethyiphosphoramide)、乙腈、二氧六环、聚丙二醇或与水混溶的其他溶剂的溶剂。可使用具有或没有表面活性剂或乳化剂的天然来源的油或合成油，例如，可使用植物来源的油、作物油(诸如列于herbicide.adjuvants.com万维网(因特网)上可公开获得的第9版Compendium of Herbicide Adjuvants中的那些作物油)。用于本文提供的方法中使用的某些液体组合物中的油包括但不限于石蜡油、多元醇脂肪酸酯或具有用酰胺或聚胺诸如聚乙烯亚胺或N-吡咯烷修饰的短链分子的油。
如本文所用的“包含植物处理剂的溶液”包括含有植物处理剂的各式各样的溶液。非限制性实例包括包含秋水仙素和/或烯效唑和/或甲基胺草磷(APM)的溶液。在某些实施方案中，包含植物处理剂的溶液包含例如秋水仙素。
在某些实施方案中，植物处理剂为染色体加倍剂。当通过本文提供的方法使用时，此类染色体加倍剂可以使双单倍体植物生产成为可能。染色体加倍剂可包括引起染色体加倍的各种有丝分裂抑制剂。在某些实施方案中，染色体加倍剂可为诸如秋水仙素、甲基胺草磷、氟乐灵、氨磺乐灵、拿草特或氯苯胺灵(chloropropham)的化合物。
在某些实施方案中，染色体加倍剂可为低哺乳动物毒性染色体加倍剂。可用于本文提供的各种实施方案中的低哺乳动物毒性染色体加倍剂包括但不限于诸如以下的化合物：i)1,2,3-三甲氧基-4-((1S,6R)-6-硝基-环己-3-烯基)-苯和美国专利申请公布1010/0169999中公开的其他相关化合物；以及ii)Michelotti等的美国专利号5,866,513中公开的化合物。美国专利申请公布1010/0169999以及美国专利号5,866,513中公开的化合物以引用方式并入本文。具体而言，美国专利号5,866,513的第3-4栏、第5-6栏、和第7-8栏上的表I和1a中公开的76种化合物各自以引用方式并入本文。在某些实施方案中，染色体加倍剂包括多核苷酸。
在某些实施方案中，包含植物处理剂的溶液所包含的秋水仙素的量高达溶液中约4000百万分率(ppm)秋水仙素。在某些实施方案中，秋水仙素浓度的量低至溶液中约50ppm秋水仙素。在某些实施方案中，秋水仙素浓度的量为溶液中约50ppm至约4000ppm秋水仙素。在某些实施方案中，秋水仙素的量为溶液中约50ppm至约2500ppm，或约50ppm至约1000ppm，或约50ppm至约1500ppm，或约50ppm至约1000ppm，或约50ppm至约500ppm，或约50ppm至约250ppm，或约50ppm至约100ppm秋水仙素。在某些实施方案中，秋水仙素的量为溶液中约100ppm至约4000ppm，或约250ppm至约4000ppm，或约500ppm至约4000ppm，或约1000ppm至约4000ppm，或约1000ppm至约4000ppm，或约2500ppm至约4000ppm秋水仙素。在某些实施方案中，秋水仙素的量为溶液中约1100ppm至约1500ppm秋水仙素。在某些实施方案中，秋水仙素的量为约300ppm至约3000ppm。
需要指出的是，这些方法可与在本领域中表明或已知对处理植物有用的任何浓度的植物处理剂结合使用。
为减少由于操作、离心或感染所引起的植物胁迫或死亡率，可在离心步骤之前、期间、之间或之后用与本文描述的方法结合的另外的激素、盐、抗生素和其他杀虫剂处理植物。这些另外的处理可在植物恢复时预防感染，或者以提高存活的方式影响植物生长。实施例5显示如何向植物组织递送处理液中的植物生长调节剂，以便以提高植物从施加离心力之后的操作、输送和移植中存活的能力的方式影响植物发育。
使植物与处理剂接触
植物与处理液的接触可在施加离心力之前、期间或之后发生。在某些实施方案中，通过将植物浸渍、浸没或以其他方式插入到包含植物处理剂的液体的贮器中来实现植物表面与处理剂的接触。使至少一部分植物表面与植物处理剂接触的其他方法包括用包含植物处理剂的溶液对植物进行喷洒或喷雾，或者在包含植物处理剂的溶液中搅动或翻转植物。在某些实施方案中，通过将植物置于容器中，然后向具有所述植物的所述容器中添加处理液来实现植物表面与处理剂的接触。处理剂然后可从容器中倾出或以其他方式排出，而如果例如用户希望进行连续离心，则所述植物仍处于其中，或者所述植物可在所述处理剂移除之前或期间从所述容器中移除。
在某些实施方案中，在施加离心力之前，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的植物表面与包含植物处理剂的溶液接触。在某些实施方案中，在离心力施加开始时，至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的植物表面与包含植物处理剂的溶液接触。
如本文所用，宏观尺度植物处理是指使多于极小面积的植物表面与包含植物处理剂的溶液接触。例如，在某些实施方案中，宏观尺度处理的植物是在施加离心力之前至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的植物表面已经与包含植物处理剂的溶液接触的一株植物。在某些实施方案中，与溶液接触的至少一部分植物表面包括除了选定植物组织之外的植物组织。在某些实施方案中，选定植物组织不是与溶液接触的植物的表面的一部分。因此，在某些实施方案中，在离心力施加期间，包含植物处理剂的溶液中的至少一部分在离心力影响下移动或行进至选定植物组织。
在某些实施方案中，至少一部分的植物表面保持与包含植物处理剂的溶液接触持续至少大部分的离心力施加的持续时间，至少一部分的植物的表面保持与包含植物处理剂的溶液接触持续基本上整个离心力施加的持续时间，和/或至少一部分的植物的表面保持与包含植物处理剂的溶液接触持续整个离心力施加的持续时间。在某些实施方案中，至少一部分的植物的表面保持与包含植物处理剂的溶液接触持续至少约25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的离心力施加的持续时间。在某些实施方案中，在至少一部分的离心力施加期间，保持与包含植物处理剂的溶液接触的植物表面的量为所述植物的表面的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。在某些实施方案中，不管保持与溶液接触的植物表面的百分比，选定组织保持浸没于所述溶液中。例如，其中玉米植物的茎尖分生组织浸没于所述溶液中，但是叶片部分未浸没。在某些实施方案中，不管保持与溶液接触的表面的百分比，在所述溶液的离心力施加期间，选定组织的表面是游离的或变得游离。例如，其中玉米植物茎尖分生组织的表面摆脱溶液，但是根部保持浸没。应当理解，尽管选定组织的表面“摆脱”所述溶液，痕量的溶液和/或植物处理剂仍然可存在于选定组织中。
在某些实施方案中，所有或基本上所有包含植物处理剂的溶液在离心期间从所述植物的表面移除，并且/或者没有或基本上没有所述溶液在离心力移除之后保持在所述植物表面上。在某些实施方案中，大于约95％、96％、97％、98％或99％的植物表面在离心力移除之后摆脱所述溶液，而无需另外的溶液移除步骤，即，小于约5％、4％、3％、2％或1％的植物表面到离心力施加结束时保持与包含植物处理剂的溶液接触，而无需另外的溶液移除步骤。
如本文所用，“接触步骤”是使植物部分与包含植物处理剂的溶液接触的任何过程。各式各样的持续时间对接触步骤是可能的，特别是对考虑接触步骤如何成为孵育期的类型以及本文描述的实施方案如何提供对本发明有用的各式各样的孵育持续时间是可能的。
取决于若干变量且不限于研究中的种质、使用的植物处理剂的活性或浓度、靶向组织的位置、离心速度或这些和其他变量的组合，如本文其他地方所述的植物表面与包含植物处理剂的溶液接触时以及施加离心力时之间的持续时间可短至确保至少一些植物处理剂在后续离心期间到达靶向组织所需的最小值。在某些实施方案中，用户将所述植物短暂地浸渍于包含植物处理剂的溶液中，时长刚好足以覆盖用户靶向的选定组织、足以覆盖未靶向的组织例如围绕选定组织的组织，或选定组织和未靶向的组织。例如，将单倍体植物的茎尖浸渍于包含加倍剂的液体中，时长刚好足以确保茎尖分生组织和/或围绕其的组织与加倍剂接触。这可少至约一秒，可能甚至更少，上限取决于若干因素，包括药剂对植物的影响(例如，毒性)以及植物可在此类条件下存活多久。
在某些实施方案中，可用无毒药剂或低浓度处理剂通过将植物浸泡若干天或可能甚至几周来处理特定种质，前提是采取措施以去确保植物从所述处理中存活，并且用户愿意接受向植物的这种延长暴露对所述植物的任何另外的影响。
有用的植物类型
除非另外说明，否则本公开不限于任何特定的植物类型。例如，所述植物可为商业商品作物或观赏植物。例如，在某些实施方案中，所述植物为单子叶植物或者为禾本科成员，小麦植物、玉米植物、甜玉米植物、水稻植物、野生稻植物、大麦植物、黑麦、小米植物、高梁植物、甘蔗植物、草坪草植物、竹子植物、燕麦植物、雀麦草植物、芒草植物、蒲苇植物、柳枝稷(黍属)植物和/或类蜀黍植物，或者为葱科成员，洋葱植物、韭葱植物、大蒜植物；或者其中所述植物为双子叶植物或者为苋科成员，菠菜植物、藜麦植物、漆树科成员，芒果植物、菊科成员，向日葵植物、苣荬菜植物、莴苣植物、洋蓟植物、十字花科成员，拟南芥植物、油菜植物、油籽油菜植物、西蓝花植物、球芽甘蓝植物、卷心菜植物、卡诺拉(canola)植物、花椰菜植物、甘蓝植物、芜菁植物、萝卜植物、凤梨科成员，菠萝植物、番木瓜科成员，番木瓜植物、藜科成员，甜菜物、葫芦科成员，甜瓜植物、哈密瓜植物、南瓜(squash)植物、西瓜植物、白兰瓜植物、黄瓜植物、南瓜植物、薯蓣科成员，山药植物、杜鹃花科成员，蓝莓植物、大戟科成员，木薯植物、蝶形花科成员，苜蓿植物、三叶草植物、花生植物、茶藨子科成员，醋粟植物、胡桃科成员，胡桃植物、唇形科成员，薄荷植物、樟科成员，鳄梨植物、豆科成员，大豆植物、菜豆植物、豌豆植物、锦葵科成员，棉花植物、竹芋科成员，竹芋植物、桃金娘科成员、番石榴植物、桉树植物、蔷薇科成员，桃树植物、苹果树植物、樱桃树植物、李子植物、梨树植物、prune植物、黑莓植物、覆盆子植物、草莓植物、茜草科成员，咖啡树植物、芸香科成员，柑橘植物、橙子植物、柠檬植物、西柚植物、橘子植物、杨柳科成员，白杨植物、柳树植物、茄科成员，马铃薯植物、甘薯植物、番茄植物、辣椒植物、烟草植物、绿番茄(tomatillo)植物、茄子植物、颠茄(Atropa belladona)植物、曼陀罗(Datura stramonium)植物、葡萄科成员，葡萄树植物、伞形科成员，胡萝卜植物或芭蕉科成员，香蕉树植物；或者其中所述植物为松科成员，雪松植物、冷杉植物、铁杉植物、落叶松植物、松树植物、云杉植物。
除非另外说明，否则如本文所用，植物可为任何完整植物或植物的一部分，或来源于植物的组织培养物，或植物种子；具有植物处理剂可递送至的组织。植物可具有任何染色体含量，诸如单倍体、二倍体、三倍体、四倍体等。多倍性通常是指具有大于三倍体的倍性水平的状况。在某些实施方案中，对生长于组织培养物中生长的植物组织与非组织培养物植物的进行了区分。
除非另外说明，否则如本文所用，植物表面是指通常暴露于围绕所述植物的外部环境中的表面，而没有牵拉、切割等所述植物来暴露另外的区域。例如，如果植物完全浸没于溶液中，那么所述植物的表面通常为将与所述溶液接触的植物部分。
植物组织可为任何植物组织。在某些实施方案中，植物组织可包括功能分生组织或能够形成功能分生组织的细胞的分组。功能分生组织被定义为具有产生新植物组织或器官的能力的多能细胞的中心。在某些实施方案中，所述植物组织为分生组织，诸如根尖分生组织或茎尖分生组织。
在某些实施方案中，向靶向的或选定植物组织递送植物处理剂。可基于组织对植物处理剂的应答和/或寻求实现的对植物生长、特征、遗传、产量等的影响来靶向或选择植物组织。例如，可选择茎尖分生组织，特别是DH0植物的茎尖分生组织，以递送染色体加倍剂。选定组织可位于植物表面处，和/或其可位于植物表面下方或位于部分植物表面下方。因此，在某些实施方案中，当诸如通过完全浸没植物来使甚至整个植物表面与包含植物处理剂的溶液接触时，至少一部分的选定组织可不与所述溶液接触。
用于本文描述的方法中的植物可处于任何不同的发育期。例如，玉米植物可通过它们的营养生长期和生殖期来描述，并且如本文所用，玉米粒发育期(叶枕法：V1-Vn、Vt、R1-R6等)如Abendroth,L.J.,R.W.Elmore,M.J.Boyer和S.K.Marlay,1011,Corn Growth and Development,PMR 1009,Iowa State University Extension,Ames,Iowa(图2、3、14-83)中所描述的那样，并且概述于图2中。发育期的选择可取决于许多因素，诸如但不限于植物处理剂进入处于某些发育期下的某些组织的能力、对植物处理剂的需要与某些发育期之间的相关性，或植物的物理尺寸以及使植物经受离心力的实践性。在某些实施方案中，所述植物为种子。在某些实施方案中，所述植物为萌发的植物。在某些实施方案中，所述植物为成熟的植物。
在某些实施方案中，在萌发之前，所述植物或所述植物的繁殖体与植物处理剂接触并且进行离心，以便向所述植物的至少一个选定组织递送处理剂。在某些实施方案中，本领域中已知的胚拯救技术用来在种子萌发之前将胚从种子中切除，以便使所述胚与处理剂更好地接触。切除之后，可将所述胚在体外培养或使其以其他方式生长于促进其存活并发育成幼苗的条件下。因此，可使用本领域中目前已知的各种技术(包括胚拯救技术)来向萌发之前的植物的选定组织递送植物处理剂，从而允许所述胚在离心期间与植物处理剂接触。在某些实施方案中，这些方法用来向单倍体胚的分生组织递送加倍剂，以便创建至少一种能够产生功能性单倍体配子的双单倍体生殖组织。
在某些实施方案中，所述植物为玉米植物。在某些实施方案中，所述植物为玉米植物，并且所述植物组织为分生组织。在某些实施方案中，所述植物为玉米植物，并且所述植物组织为茎尖分生组织(SAM)。在某些实施方案中，所述植物为玉米植物，所述植物组织为茎尖分生组织，并且所述玉米植物处于种子内，或者正在萌发，或者处于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6生长期或处于其之间。在某些实施方案中，所述植物为单倍体玉米植物，所述植物组织为茎尖分生组织，所述玉米植物处于种子内，或者正在萌发，或者处于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6营养生长期或处于其之间，并且所述植物处理剂为染色体加倍剂，诸如秋水仙素。
离心
离心力可以任何不同的方式施加，但最通常使用离心机来完成。如本文所用，对离心的提及与离心力施加同义，并且术语“旋转”和“离心”在本文同义地使用。
此处报告的离心参数与公式RCF＝1.12R(RPM/1000)2一致，其中RCF＝相对离心力，R＝旋转半径，并且RPM＝以每分钟转数测量的旋转速度。由RCF表示的加速度大小还可以“g”的倍数(或“x g”)表示，其中g表示地球表面处的标准重力加速度。因此，50g或50x g或50RCF表示等效的加速度值。本文使用的RCF和g值表示一旦RPM已达到用户设定的速度，向处于或靠近离心样品(RCF最大值)容器的底部处的样品施加的加速度。因此，RCF＝RCF最大值＝1.12R最大值(RPM最大值/1000)2。所预期的是，对于给定速度，普通技术人员可确定沿着旋转半径的任何点处的RCF。例如，普通技术人员可优选使用RCF最小值(向离心样品容器的最近端施加的RCF)或RCFave(在整个离心样品容器上施加的平均RCF)，以便实践本公开的发明。向植物施加离心力的本发明实施方案包括使用任何加速方法以产生在效果方面与本文描述的那些效果基本等效的力，不管如何计算或实现所述力。
在Beckman Coulter Allegra X-14系列离心机中使用SX4750A吊桶式转子来达到本文描述的离心速度。当在使用SX4750A转子的Allegra X-14上向电子控制面板中输入50RCF(xg)的值时，其产生大约463.5RPM的R最大值，所述R最大值产生：RCF最大值＝50g，RCFave＝34g，以及RCF最小值＝31.3。输入10RCF(xg)的值产生：RCF最大值＝10，RCFave＝14，以及R最小值＝7.5。其他离心设置可需要不同的参数以产生大约相同的加速度，并且所预料的是，本领域普通技术人员可将这些值转化到在没有过度实验的相似原则上操作的其他系统或装置。
在本发明的范围内考虑了使用不同的离心设置或装置来调整离心参数以产生良好的结果。
在本发明的各种实施方案中，可以允许例如通过离心力向植物施加加速度的任何方式处理植物。通常，植物置于适于置于离心机中的容器(离心样品容器)中。在某些实施方案中，所述容器可为小容器，诸如放置单株或几株植物的管。在某些实施方案中，所述容器可为大容器，诸如可使许多植物同时一起离心和/或与植物处理剂接触的烧瓶、瓶子、盒子、网或贮器。
在某些实施方案中，植物可一起保持在相同的离心容器中时经受离心力，或者它们可分离或分开到其他容器中，诸如单个地或几个地置于单独容器中以进行离心。单个地置于单独容器中的大量植物可同时离心，或者它们可一次几个地或单独地和顺序地离心。在一些实施方案中，在一次离心中一起处理多于一种的植物，然后在另外的离心期间(例如，作为在双旋转期间和/或作为连续离心处理的一部分)在单独容器中单个地处理所述植物。
在某些实施方案中，无需使靶组织与储备处理剂保持分离，也无需相对于在计划的离心期间(例如，在浸没性离心期间)产生的加速力对齐所述靶组织，在所述浸没性离心中，所述靶组织在离心期间接触和/或浸没于储备处理剂中。在某些实施方案中，其中所述靶组织在离心力施加期间处于接触中或是浸没的，一些部分的植物表面在离心期间也接触或浸没于储备处理剂中。
在某些实施方案中，需要防止靶组织在离心期间接触和/或浸没于储备处理剂中，并且需要相对于在离心期间(例如，在浸没性离心期间)产生的加速力对齐所述靶组织，在所述浸没性离心中，防止靶组织变得浸没和/或接触储备处理剂，并且相对于在离心期间产生的加速力对齐所述靶组织。出于若干原因，诸如为促进植物处理剂移动至植物的靶组织或区域，或者为将药剂从植物表面移除，或者仅仅为帮助在给定离心步骤上游或下游的步骤期间操作所述植物，可进行某些定向的维持。
有用的离心力
在某些实施方案中，在至少一部分植物表面与植物处理剂接触之后，向所述植物施加至少约10g的离心力。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约50g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约50g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约100g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约100g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约250g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约250g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约500g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约500g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约750g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约750g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约1000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约1000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约500g至约1000g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约1250g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约1250g。在某些实施方案中，施加的离心力为约750g至约1250g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约1500g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约1500g。在某些实施方案中，施加的离心力为约1000g至约1500g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约1750g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约1750g。在某些实施方案中，施加的离心力为约1250g至约1750g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约1000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约1000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约1500g至约1000g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约2000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约2000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约300g至约2000g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约2250g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约2250g。在某些实施方案中，施加的离心力为约1750g至约2250g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约2500g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约2500g。在某些实施方案中，施加的离心力为约1000g至约2500g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约2750g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约2750g。在某些实施方案中，施加的离心力为约2250g至约2750g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约3000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约3000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约2500g至约3000g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约3250g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约3250g。在某些实施方案中，施加的离心力为约2750g至约3250g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约3500g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约3500g。在某些实施方案中，施加的离心力为约3000g至约3500g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约3750g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约3750g。在某些实施方案中，施加的离心力为约3250g至约3750g。在某些实施方案中，施加的离心力不大于约4000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约4000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约3500g至约4000g。
有用的离心持续时间
在某些实施方案中，离心力施加至少约1秒。在某些实施方案中，离心力施加至少约5秒。在某些实施方案中，离心力施加至少约10秒。在某些实施方案中，离心力施加至少约15秒。在某些实施方案中，离心力施加至少约10秒。在某些实施方案中，离心力施加至少约30秒。在某些实施方案中，离心力施加至少约40秒。在某些实施方案中，离心力施加至少约50秒。在某些实施方案中，离心力施加至少约60秒。在某些实施方案中，离心力施加至少约90秒。在某些实施方案中，离心力施加至少约2分钟。在某些实施方案中，离心力施加至少约3分钟。在某些实施方案中，离心力施加至少约5分钟。在某些实施方案中，离心力施加至少约10分钟。在某些实施方案中，离心力施加至少约15分钟。在某些实施方案中，离心力施加至少约10分钟。在某些实施方案中，离心力施加至少约30分钟。在某些实施方案中，离心力施加至少约45分钟。在某些实施方案中，离心力施加至少约60分钟。在某些实施方案中，离心力施加至少约90分钟。在某些实施方案中，离心力施加至少约110分钟。在某些实施方案中，离心力施加至少约150分钟。在某些实施方案中，离心力施加至少约180分钟。
在某些实施方案中，离心力施加约1秒与约60分钟之间或约10秒与约60分钟之间。在某些实施方案中，离心力施加约1秒与约45分钟之间或约1秒与约45分钟之间，或约1秒与约30分钟之间或约1秒与约30分钟之间，或约1秒与约10分钟之间或约1秒与约10分钟之间，或约1秒与约15分钟之间或约1秒与约10分钟之间，或约1秒与约10分钟之间，或约1秒与约5分钟之间或约1秒与约10分钟之间，或约1秒与约10分钟之间或约1秒与约10分钟之间。在某些实施方案中，离心力施加约1秒与约180分钟之间。
有用的孵育时间
递送植物处理剂的方法通常涉及将植物暴露于处理剂中。这可需要暴露于植物处理剂中持续一段延长的时间，以便允许所述药剂充分地转移至所述植物的选定组织和/或细胞中。出于各种原因，包括一些处理剂的毒副作用和/或因为它更为有效，可能期望限制植物与植物处理剂接触的时间。包括向植物施加离心力的某些实施方案可缩短植物与植物处理剂接触来实现植物处理剂至植物组织的充分递送所需的时间，以便在植物或植物组织中实现期望的变化。
在某些实施方案中，在施加离心力之前，植物与包含植物处理剂的溶液接触少于约3.5小时，或少于约2小时，或少于约1小时，或少于约45分钟，或少于约30分钟，或少于约10分钟，或少于约10分钟，或少于约5分钟或少于约1分钟。
在某些实施方案中，所述植物与处理剂接触，仅持续使植物与药剂接触所需的时间量，并且将所述植物加载到离心机中并开始离心。在某些其他实施方案中，所述植物可在添加以及然后移除处理剂时保持在容器中。例如，诸如图7所示的植物和PCS(植物离心支持体)组合可与自动化系统结合使用，所述自动化系统在植物保持在容器内时将处理剂推动至容器中或者将处理剂从容器中移除。在某些实施方案中，玉米植物可置于离心容器中，并且由诸如图7所示的PCS来固定，其中手动或自动化系统向容器中递送处理剂，直至接触和/或浸没选定组织或围绕所述PCS的组织的程度。在某些实施方案中，自动或手动系统还将大部分处理剂从容器中移除，使一些处理剂仍然留在植物上或植物中，因此将所述植物准备用于后续的非浸没性离心。在一些实施方案中，在施加离心力之前，靶组织与包含例如秋水仙素的液体加倍剂接触少于一秒。
在某些实施方案中，可通过在对植物进行离心之前将植物放置、浸没或浸渍于包含植物处理剂的液体的贮器中并且然后将所述植物从所述溶液中移除来使至少一部分植物表面与植物处理剂接触。在某些实施方案中，可向含有植物的容器中添加植物处理剂，然后可在一段时间后移除所述植物处理剂，使所述植物留在所述容器中，而一些残留的处理剂仍然留在所述植物中或所述植物上。所述植物可在溶液保持少于一秒、约一秒，或至少约5秒，或至少约10秒，或至少约30秒，或至少约一分钟、至少约五分钟、至少约十分钟、至少约10分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时或更长时间。
在某些实施方案中，在施加离心力之前，单倍体植物与包含染色体加倍剂诸如秋水仙素的溶液接触约5分钟与约1小时之间。
离心技术
在某些实施方案中，在离心期间，与植物表面接触或以其他方式处于具有植物的离心容器内的处理剂的微滴在离心开始时将由在离心期间产生的推入植物中或穿过离心容器直至被离心容器的壁和/或底部阻挡。一旦阻挡，取决于离心容器内表面的形状，所述溶液就将开始以液体进行的可预测方式汇集。在离心力施加期间与植物一起离心以及在植物外面汇集的一定量的处理剂被称为“储备”处理剂。在离心力施加期间吸收到植物中的一定量的处理剂称为“吸收”处理剂。
在某些实施方案中，根据在离心期间植物如何定向和/或在离心期间多少处理液处于具有所述植物的离心容器中，在离心力施加期间，靶组织和/或围绕所述靶组织的表面组织将浸没于或未浸没于储备处理剂中。
某些实施方案提供用于向植物组织递送植物处理剂的方法，其中所述方法包括使植物至少表面与包含植物处理剂的溶液接触。除非另行说明，否则本文其他地方公开的用于使植物与包含植物处理剂的溶液接触以及施加离心力的所有参数均适用于所述方法。在某些实施方案中，所接触的植物表面的量为至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。在某些实施方案中，所述植物已经萌发。在接触植物之后，向已经与包含植物处理剂的溶液接触的植物施加离心力。在离心力施加期间，所述力将倾向于朝所述力的方向驱动溶液。根据力的大小、力的持续时间以及植物和容器的物理特征，在离心力施加之前附着到所述植物的至少一部分溶液可在离心力施加期间从所述植物的表面移除。然而，在一些实施方案中，存在足以使至少一部分植物(诸如选定组织或围绕所述选定组织的组织)保持接触和/或浸没的溶液的量。在某些实施方案中，在离心力施加期间，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的植物表面保持与所述溶液接触。在某些实施方案中，在离心步骤期间，大于约25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的溶液脱离与所述植物的表面的接触。在某些实施方案中，施加如本文其他地方所更加详细地说明的约10g至约4000g的离心力。在某些实施方案中，在步骤期间，所述植物的轴相对于所述离心力的方向对齐。在某些实施方案中，所述植物在一定程度上与所述离心力的方向对齐。在某些实施方案中，植物与植物离心支持体(PCS)结合，所述植物离心支持体在本文其他地方进行了详细描述。与PCS结合的植物可完全浸没于溶液中、基本上浸没于溶液中、部分浸没于溶液中，或基本上摆脱溶液而离心，其中所述植物未浸没于所述溶液中(例如，当接触所述植物的所述溶液仅仅是在与所述溶液接触后粘着到所述植物的表面的溶液时)等等。在某些实施方案中，植物附着到PCS，诸如缠绕到、系到、捆扎到等等。在某些实施方案中，在离心力施加期间，植物的轴由PCS来维持。在某些实施方案中，PCS维持所述植物的轴与所述离心力的方向在一定程度上对齐。在某些实施方案中，植物与植物离心支持体直接接触，然而在其他实施方案中，植物不与植物离心支持体直接接触。在某些实施方案中，离心力引起植物处理剂转移，以便所述植物处理剂接触在所述植物在离心力施加之前与所述植物处理剂接触时未被接触的所述植物的组织。在某些实施方案中，所述植物组织为分生组织，诸如茎尖分生组织(SAM)。在某些实施方案中，所述植物为玉米植物，例如处于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6营养生长期的玉米植物。
除非另行说明，否则本文其他地方公开的用于使植物与包含植物处理剂的溶液接触以及施加离心力的所有参数均适用于涉及创建双单倍体植物、增加加倍效率等的方法。某些实施方案提供创建双单倍体玉米植物的方法。单倍体植物诸如DH0母本植物的表面与包含染色体加倍剂的溶液接触。所接触的表面的量可为如本文其他地方所更加详细地描述的任何量。然后向DH0母本植物施加离心力。如本文公开的某些实施例所证实的那样，在某些实施方案中，实现了至少一定量的加倍效率。如本文公开的某些实施例所证实的那样，除了创建双单倍体植物之外，所述方法与其他方法相比还可增加所达到的加倍效率。在创建双单倍体植物期间，DH0母本植物产生至少一种单倍体玉米卵子，从而创建双单倍体玉米植物。在某些实施方案中，在离心力施加期间，至少5％的植物表面，或本文其他地方所更加详细地说明的另一种量保持与包含染色体加倍剂的溶液接触。在其他实施方案中，在离心力施加期间，大于99％的包含染色体加倍剂的溶液，或本文其他地方所更加详细地说明的另一种量脱离与所述植物的表面的接触。在某些实施方案中，施加如本文其他地方所更加详细地说明的约10g至约4000g的离心力。在某些实施方案中，如本文其他地方所更加详细地说明的，向所述植物施加的离心力的持续时间为约1秒至约180分钟。在某些实施方案中，如本文其他地方所详述的，在离心期间，所述植物与所述离心力的方向对齐。在某些实施方案中，在离心力施加期间,所述植物的轴由植物离心支持体来维持。在某些实施方案中，植物离心支持体维持所述植物的轴与所述离心力的方向在一定程度上对齐。在某些实施方案中，植物与植物离心支持体直接接触，并且在某些实施方案中，植物不与植物离心支持体直接接触。在某些实施方案中，相比于通过在没有离心的情况下接触茎分生组织来实现茎分生组织与染色体加倍剂的接触，离心力增加所述染色体加倍剂与所述茎分生组织的接触。在某些实施方案中，离心力引起染色体加倍剂转移，以便所述药剂接触在所述植物在离心力施加之前与所述染色体加倍剂接触时未被接触的所述植物的组织。在某些实施方案中，所述玉米植物处于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6营养生长期。在某些实施方案中，所述染色体加倍剂为秋水仙素。在某些实施方案中，在所述施加离心力之前，所述植物与包含染色体加倍剂的溶液接触少于约1小时或3小时的持续时间，或持续一段本文其他地方描述的持续时间。
某些实施方案提供用于向植物组织递送植物处理剂的方法，其包括使植物表面与包含植物处理剂的溶液接触，并且向与所述溶液接触的所述植物施加离心力，其中在离心力施加期间，所述植物的轴由植物离心支持体(PCS)来维持，从而向所述植物组织递送所述植物处理剂。除非另行说明，否则本文其他地方公开的用于使植物与包含植物处理剂的溶液接触以及施加离心力的所有参数均适用于所述方法。在某些实施方案中，在步骤期间，PCS维持所述植物的轴与所述离心力的方向对齐。在某些实施方案中，植物与植物离心支持体直接接触，并且在某些实施方案中，植物不与植物离心支持体直接接触。在某些实施方案中，施加约10g至约500g的离心力。在某些实施方案中，施加约500g至约4000g的离心力。在某些实施方案中，离心力引起植物处理剂转移，以便所述植物处理剂接触在所述植物在离心之前与所述植物处理剂接触时未与所述植物处理剂接触的所述植物的组织。在某些实施方案中，相比于在离心力施加之前选定植物与植物处理剂的接触，离心力的施加增加选定组织与植物处理剂的接触。在某些实施方案中，所述植物组织为茎分生组织。在某些实施方案中，所述植物为玉米植物，例如处于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6营养生长期的玉米植物。在某些实施方案中，所述植物为DH0植物。在某些实施方案中，所述植物处理剂为染色体加倍剂，例如秋水仙素。在某些实施方案中，相比于在离心力施加之前实现茎分生组织与染色体加倍剂的接触，离心力增加所述染色体加倍剂与所述茎分生组织的接触。
某些实施方案提供用于向植物组织递送植物处理剂的方法，其中方法包括使植物表面与包含植物处理剂的溶液接触，并且向所述植物施加第一离心力。在施加第一离心力之后，将离心力移除。然后，向经受第一离心力的植物施加后续离心力。本文其他地方公开的用于使植物与包含植物处理剂的溶液接触以及施加离心力的所有参数均适用于接触所述植物以及第一离心力施加和后续离心力施加。
非浸没性离心
在非浸没性离心期间，在基本上整个离心力施加过程中，靶组织与储备处理液分离。换言之，在某些实施方案中，当吊桶式离心机加速或减速并且储备液还未到达所述植物外面的位置时，可存在一段通常相对短暂的时期，其中例如在离心开始和/或结束时，选定组织是浸没的，在所述位置中所述储备液将在离心期间静止和/或再积累于所述植物上。
一旦植物已经诸如通过浸泡于液体主体中来与包含植物处理剂的溶液接触，所述植物就可与用来接触所述植物的液体的主体分离。虽然用来接触植物的溶液的主体与所述植物分离，但是一些溶液通常将通常作为在所述溶液的主体移除之后依附至所述表面(例如，“涂覆”所述植物表面)或以其他方式保留一段时间的微滴保持与所述植物的表面接触。
当选定组织或围绕所述选定组织的植物表面在离心期间与处理液接触并且适当对齐时，留在所述植物上或植物中的一些处理剂将由在非浸没性离心期间产生的加速力推动到所述植物的选定组织中。这种对齐将取决于选定组织，并且仅需要采用基本物理原理来测定有效定向。在非浸没性离心期间离开植物的处理剂将穿过离心容器来以液体进行的可预测方式汇入离心容器的一端处的储备处理剂中。
在本发明的某些实施方案中，在离心期间或在离心结束时，少于99％，或少于98％，或少于97％，或少于96％，或少于95％，或少于94％，或少于93％，或少于92％，或少于91％，或少于90％，或少于89％，或少于88％，或少于87％，或少于86％，或少于85％，或少于84％，或少于83％，或少于82％，或少于81％，或少于80％的植物表面保持与植物处理剂接触。
在某些实施方案中，在离心力施加之前和/或期间，包含植物处理剂的溶液从所述植物的表面移除或基本移除，以便所述植物表面中的少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％表面到离心力施加结束时保持与包含所述植物处理剂的溶液接触，而无需另外的溶液移除。
例如，在如本文实例中所述的非浸没性离心期间，在离心期间从所述植物的表面转移的所有植物处理剂在离心结束时靠着靠近所述植物的根部的离心容器的壁积累。因为一些根部也与离心容器的这种壁接触，所以储备液分散到一部分根部，因此所述一些根部在离心结束时保持与所述处理液接触。注意在非浸没性旋转期间限制这种接触，包括限制在接触步骤期间所用的处理液，以便在典型的非浸没性旋转中，在离心力施加期间和/或之后，仅几毫升处理液汇集在离心容器中。
某些实施方案提供使用各种方法来从选定组织中进一步分离储备处理剂，所述各种方法包括并入吸收所述储备处理剂的材料。还提供的是，人们可在离心力施加期间使用成形的离心容器，以便其在离心期间将处理液储存在使所述储备处理剂在从所述植物中转移离开之后不再接触选定组织的一个地方，或者使用可插入性隔离物来完成相似的结果。还提供的是，储备处理剂在离心期间例如使用用于液体在离心期间退出的离心容器的一端处的开口退出离心容器。在那种情况下，储备处理剂在离心力施加期间不静止在离心容器内部，但是退出至使其在离心力施加期间不接触选定组织的位置。
在某些实施方案中，植物的轴相对于离心力对齐。植物可被描述成具有多个轴。这些轴中的一个为茎根轴(shoot-root axis)，其朝根端上至茎端的方向上延伸，并且反之亦然。在某些实施方案中，所述植物的茎根轴与所述离心力的方向对齐。在某些实施方案中，所述植物的茎根轴例如在所述离心力的方向的3°以内基本上对齐。在某些实施方案中，所述植物的茎根轴在所述离心力的方向的1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°或30°以内对齐。
在某些实施方案中，在离心期间，所述植物的茎根轴与所述离心力的方向对齐，并且向所述植物提供PCS以阻止所述植物在离心力施加期间弯曲、屈曲、塌缩等。在某些实施方案中，所述支持体防止所述植物被离心期间产生的力损伤。在某些实施方案中，所述支持体允许植物从离心力施加中恢复，其中不具有所述支持体的相同的植物将损伤而无法恢复。在某些实施方案中，所述支持体通过防止弯曲、屈曲、塌缩等来维持或至少通常维持所述植物的茎根轴。
在某些实施方案中，所述支持体维持植物的轴诸如茎根轴相对于所述离心力的方向的对齐。在某些实施方案中，所述支持体维持植物的轴诸如茎根轴与所述离心力的方向的对齐，或者与所述离心力的方向至少基本上对齐，例如在所述离心力的方向的3°以内。在某些实施方案中，所述支持体维持植物的轴诸如茎根轴在所述离心力的方向的1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°或30°以内对齐。
在某些实施方案中，所述支持体提供高于预期的离心速度/力的使用，同时阻止所述植物弯曲、屈曲、塌缩等。在某些实施方案中，所述支持体提供高于预期的离心速度/力的使用，同时阻止所述植物被离心期间产生的力损伤。在某些实施方案中，所述支持体提供高于预期的离心速度/力的使用，同时允许植物从离心力施加中恢复，其中不具有所述支持体的相同的植物将损伤而无法恢复。
在某些实施方案中，如本文所述的支持结构的使用允许向植物施加高达约500g、750g、1000g、1250g、1500g、1750g、2000g、2250g、2500g、2750g、3000g、3500g或4000g的离心力。在某些实施方案中，如本文所述的支持结构的使用允许向植物施加约10g或20g或100g或300g至约500g、750g、1000g、1250g、1500g、1750g、2000g、2250g、2500g、2750g、3000g、3500g或4000g的离心力。在某些实施方案中，如本文所述的支持结构的使用允许向植物施加至少约500g、750g、1000g、1250g、1500g、1750g、2000g、2250g、2500g、2750g、3000g或4000g的离心力。在某些实施方案中，施加的离心力为约10g至约4000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约300g至约2000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约500g至约2000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约750g至约1250g。在某些实施方案中，施加的离心力为约1000g至约1500g。在某些实施方案中，施加的离心力为约1250g至约1750g。在某些实施方案中，施加的离心力为约1500g至约2000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约1750g至约2250g。在某些实施方案中，施加的离心力为约2000g至约2500g。在某些实施方案中，施加的离心力为约2250g至约2750g。在某些实施方案中，施加的离心力为约2500g至约3000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约2750g至约3250g。在某些实施方案中，施加的离心力为约3000g至约3500g。在某些实施方案中，施加的离心力为约3250g至约3750g。在某些实施方案中，施加的离心力为约3500g至约4000g。在某些实施方案中，施加的离心力为约500g、750g、1000g、1250g、1500g、1750g、2000g、2250g、2500g、2750g、3000g或3500g中的任一个至约750g、1000g、1250g、1500g、1750g、2000g、2250g、2500g、2750g、3000g、3500g或4000g中的任一个。
在某些实施方案中，向植物和支持结构施加离心力至少1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟或180分钟。在某些实施方案中，向植物和支持结构施加离心力不超过约5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟或180分钟。在某些实施方案中，向植物和支持结构施加离心力，持续约1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟或120分钟中的任一个至约5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟或180分钟中的任一个。
非浸没性离心之后，植物可进行后续处理(即，连续离心)或诸如用水冲洗(如果需要)，以便去除任何剩余的植物处理液，然后通过移植于生长培养基中来恢复，并且在受保护的环境(例如，温室、遮阴棚、生长室或生长箱、组织培养室等)中照管，或者直接移植到大田。
浸没性离心
在浸没性旋转期间，靶组织浸没和/或保持与储备处理剂接触，所述储备处理剂即离心容器中未转移至植物中的处理剂主体。在某些实施方案中，在离心力施加期间，剩余的植物体也浸没和/或保持与离心容器中的储备处理剂接触。在某些实施方案中，PCS用来支持植物的靶组织和/或剩余的植物体，以便靶组织在离心力施加期间浸没于处理剂中，而基本上剩余的植物体未浸没。
在某些实施方案中，在所述植物的表面与包含所述植物处理剂的溶液的最初接触之后，可添加另外的溶液以确保在离心力施加期间基本上所述植物的大部分和/或靶向组织保持浸没和或与储备处理液接触。
不管本文对“浸没的”的一般提及，所述方法不限于要求整个植物在离心期间浸没。在本文进行的浸没性离心中，我们发现，只要靶向组织浸没，和/或围绕所述靶向组织的植物的表面上的组织浸没，就可获得向所述组织进行的药剂的良好递送。在某些实施方案中，其中至少选定组织浸没，和/或围绕所述靶向组织的植物的表面上的组织浸没，获得了向所述组织进行的药剂的良好递送。
在某些实施方案中，一株或多株植物置于容器中，并且包含植物处理剂的溶液倒在它们上直至充分浸没。在某些实施方案中，在离心期间，仅选定组织和/或围绕靶向组织的表面组织保持与处理剂接触。
例如，其中所述选定组织为茎尖分生组织，在浸没性离心期间接触少于约1％的植物总表面区域，以便实现向SAM的组织递送药剂。在某些实施方案中，在浸没性离心期间，少于约1％的植物表面需要与植物处理剂接触，以便向靶向组织递送所述植物处理剂。
在某些实施方案中，在浸没性离心期间，至少约1％或更多的植物表面需要保持与植物处理液接触。在某些实施方案中，在离心期间，所述植物表面中至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的植物的表面浸没于植物处理剂中。
在某些实施方案中，多株植物置于也作为包含植物处理剂的溶液的贮器的容器中，以便所述多株植物一起捆扎于所述溶液中。虽然所述植物将通常浸没，但是所述植物中的一些可能不总是使它们的所有表面覆盖。在某些实施方案中，在离心之前，所述植物在处理剂中混合或搅动至少一次，以便帮助确保所有植物表面在离心之前或期间的在某个时间与处理剂接触。
在某些实施方案中，在离心期间，所述植物和/或所述植物的轴不需要相对于彼此和/或相对于加速力排列或对齐。例如，在某些实施方案中，多株诸如约一打、约几打、约50株、约75株、约100株等幼苗可置于包含植物处理液的液体的贮器中，并且允许约在离心之前和/或期间混合。在某些实施方案中，未注意所述植物的对齐。在某些其他实施方案中，所述多株植物中的两株或更多株或它们的轴有意地相对于彼此对齐。在某些实施方案中，不论是否有意，在离心期间，所述多株植物中的至少约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、98％、99％或100％或它们的轴都相对于彼此对齐。例如，在离心期间将植物对齐植物和/捆扎在一起，以便它们将为另外的下游步骤做准备，诸如第一离心之后的另外一次或多次的另外离心步骤。在第一离心之前进行的对齐和/或捆扎可使进行的后续步骤(诸如也进行了植物的对齐的某些实施方案中的离心)更为有效。
在某些实施方案中，与植物处理剂接触的植物的表面区域的量可随着植物类型和/或所述植物的结构、植物的尺寸、植物处理剂待递送至的组织、所述植物的发育期以及可供使用的包含植物处理剂的溶液的量等因素而变化。在某些实施方案中，约1％与100％之间的植物表面与植物处理剂接触。在某些实施方案中，约5％与100％之间的植物表面与植物处理剂接触。在某些实施方案中，在离心期间，至少约1％，或至少约2％，或至少约5％，或至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约98％，或至少约99％或约100％(例如，植物完全浸没于溶液中)的植物的表面保持与包含所述植物处理剂的溶液接触。
在某些实施方案中，其中至少一部分的所述植物表面在离心期间保持接触或浸没，可施加高达约20g、40g、50g、60g、70g、75g、80g、90g、100g、150g、200g、250g、300g、350g、400g、450g、500g、550g、600g、650g、700g、750g、800g、850g、900g、950g、1000g、1050g、1100g、1150g、1200g、1250g、1300g、1350g、1400g、1450g、1500g、1550g、1600g、1650g、1700g、1750g、1800g、1850g、1900g、1950g、2000g、2050g、2100g、2150g、2200g、2250g、2300g、2350g、2400g、2450g、2500g、2550g、2600g、2650g、2700g、2750g、2800g、2850g、2900g、2950g、3000g、3050g、3100g、3150g、3200g、3250g、3300g、3350g、3400g、3450g、3500g、3550g、3600g、3650g、3700g、3750g、3800g、3850g、3900g、3950g或4000g的离心力。在某些实施方案中，其中至少一部分的所述植物表面在离心期间保持接触或浸没，可施加至少约10g、20g、40g、50g、60g、70g、75g、80g、90g、100g、150g、200g、250g、300g、350g、400g、450g、500g、550g、600g、650g、700g、750g、800g、850g、900g、950g、1000g、1050g、1100g、1150g、1200g、1250g、1300g、1350g、1400g、1450g、1500g、1550g、1600g、1650g、1700g、1750g、1800g、1850g、1900g、1950g、2000g、2050g、2100g、2150g、2200g、2250g、2300g、2350g、2400g、2450g、2500g、2550g、2600g、2650g、2700g、2750g、2800g、2850g、2900g、2950g、3000g、3050g、3100g、3150g、3200g、3250g、3300g、3350g、3400g、3450g、3500g、3550g、3600g、3650g、3700g、3750g、3800g、3850g、3900g、3950g或4000g的离心力。在某些实施方案中，施加的离心力来自约10g、20g、40g、50g、60g、70g、75g、80g、90g、100g、150g、200g、250g、300g、350g、400g、450g、500g、550g、600g、650g、700g、750g、800g、850g、900g、950g、1000g、1050g、1100g、1150g、1200g、1250g、1300g、1350g、1400g、1450g、1500g、1550g、1600g、1650g、1700g、1750g、1800g、1850g、1900g、1950g、2000g、2050g、2100g、2150g、2200g、2250g、2300g、2350g、2400g、2450g、2500g、2550g、2600g、2650g、2700g、2750g、2800g、2850g、2900g、2950g、3000g、3050g、3100g、3150g、3200g、3250g、3300g、3350g、3400g、3450g、3500g、3550g、3600g、3650g、3700g、3750g、3800g、3850g、3900g、3950g或4000g中的任一个。
在此类实施方案中的某些中，施加离心力至少1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟或180分钟。在某些实施方案中，向植物和支持结构施加离心力不超过约5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟或180分钟。在某些实施方案中，向植物和支持结构施加离心力，持续约1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟或120分钟中的任一个至约5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟或180分钟中的任一个。
在某些实施方案中，来自所述植物表面与包含所述植物处理剂的溶液接触时以及移除时的持续时间为至少约一秒、5秒、30秒、一分钟、五分钟、十分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时或更长时间。在某些实施方案中，来自所述植物表面与包含所述植物处理剂的溶液接触时以及移除时的持续时间不大于约5秒、30秒、一分钟、五分钟、十分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时或更长时间。在某些实施方案中，来自所述植物表面与包含所述植物处理剂的溶液接触时以及移除时的持续时间为约一秒、5秒、30秒、一分钟、五分钟、十分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时或2.5小时中的任一个至约5秒、30秒、一分钟、五分钟、十分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时或3小时。
与植物处理剂接触的植物的表面的量可根据例如使所述植物表面与所述植物处理剂接触的方法和/或根据例如所用的所述植物处理剂的量(诸如体积)而变化。例如，植物处理剂可通常在整个植物表面上或仅在某些部分上喷洒或喷雾。
如果使用液体处理液，那么向容器中添加的植物处理剂的量越大，越容易确保充分接触容器中所处理的植物，直至所述植物基本上完全浸没和/或它们开始漂浮到所述液体的表面。此外，向离心容器中添加另外的植物，处理剂可用的容器的容量将减少，因此减少接触各植物上的所需表面所需的处理剂的量。而且，如果诸如通过震动或翻转来搅动含有植物和植物处理剂的容器以使所述植物处理剂分布于整个容器中，那么通常将与所述植物处理剂接触的所述植物的表面区域越大。
在某些实施方案中，所述植物为具有当展开时形成萼(cup)或轮生体(whorl)的叶的玉米幼苗。展开的叶片的底部处的这个区域能够保持液体。在某些实施方案中，包含植物处理剂的溶液与玉米植物接触，而不考虑液体是置于萼中或置于轮生体中。在某些实施方案中，其中包含植物处理剂的溶液包含于萼或轮生体内，玉米植物的另外表面区域也与包含植物处理剂的溶液接触。在某些实施方案中，也与包含植物处理剂的溶液接触的玉米植物的另外的表面区域比萼/轮生体中接触的表面区域多约1％、2％、3％、4％或5％。在某些实施方案中，在离心力施加之前，至少一部分的植物的表面与包含植物处理剂的溶液接触，但是没有溶液置于展开的叶片的底部处形成的萼/轮生体中，换言之，所述萼/轮生体没有溶液。
离心处理
本发明的某些实施方案采用“连续离心”，所述连续离心包括连续进行的多于一次的离心，并且可包括至少一次非浸没性离心和/或一次浸没性离心。在连续离心期间，使植物在第一离心施加之后进行至少一次另外的离心。连续离心可包括在离心之前、之后或之间具有不同步骤的以任何顺序进行的任何类型的多次离心。连续离心可在至少一次离心处理期间产生的加速力的施加期间结合PCS的使用。“双重离心”是一种类型的连续离心，其包括连续或在不同时间进行的两次离心。在某些实施方案中，连续离心包括第一浸没性旋转，随后进行非浸没性旋转。
在某些实施方案中，向靶向组织在离心力施加期间浸没于储备处理剂中的植物施加离心力。在某些实施方案中，在离心力施加期间，至少1％的总植物表面与包含植物处理剂的溶液接触。在某些实施方案中，在离心力施加期间，至少约1％，或至少约2％，或至少约3％，或至少约5％，或至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约98％，或至少约99％或100％的植物表面与包含植物处理液的溶液接触。
在某些实施方案中，在后续离心力施加之前和/或期间，包含植物处理剂的溶液从所述植物的表面移除或基本移除，以便少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％的植物表面到后续离心力施加结束时保持与所述溶液接触。
在作为连续离心的一部分的离心期间向植物施加的离心力可为本领域已知的任何离心力。在某些实施方案中，至少一种离心处理的离心参数与本文其他地方描述的那些离心参数(诸如，如本文其他地方所述的浸没性离心或非浸没性离心或连续离心的离心参数)一致。这些离心参数包括非浸没性旋转期间的10g-4000g之间和/或浸没性旋转期间的10g-500g之间的离心力范围，并且向植物施加的离心力的持续时间可包括约一秒至约180分钟的范围。
第一离心处理之后，植物可进行后续或连续处理或诸如用水冲洗，以便去除任何剩余的植物处理液，然后通过移植于生长培养基中来恢复，并且在受保护的环境(例如，温室、遮阴棚、生长室或生长箱、组织培养室等)中照管，或者直接移植到大田。
植物离心支持体
在某些实施方案中，结构支持与植物在离心时包含于离心容器内。在某些实施方案中，植物离心支持体(PCS)相对于由离心产生的加速力维持期望的靶向组织定向，以便接触植物的处理剂中的至少一些部分转移到选定组织和/或被离心期间产生的加速力推动到选定组织中，即以便“适当地对齐”靶组织和/或植物。在某些实施方案中，PCS在离心期间支持植物的至少一些部分，以便靶组织的细胞不接触储备处理剂。在某些实施方案中，PCS消除或减轻离心力施加期间所引起的对植物的细胞、组织或器官损伤，虽然这不一定总是需要，因为用户可能发现恢复含有离心期间成功地递送处理剂的细胞或组织的受损植物方面的效用。
在某些实施方案中，PCS固定到离心容器内部，不论是其为可移动地可连接插入，还是其成型或装配到离心容器中或以其他方式长久地附着到离心容器。在某些实施方案中，PCS包括可附着到植物茎的至少一个棒、杆、棱或鳍状物。在一些实施方案中，PCS包括可附着到至少一株植物诸如植物幼苗的至少一个大约1/8”直径棒。在一些实施方案中，多于一株植物与(诸如附着到)PCS结合。图5示出PCS的一个实例。在一些实施方案中，多于一株植物附着到PCS，不论每株植物单独固定到共同PCS的不同部分(如图8所示)，或者不论多于一株植物附着到共同PCS的相同部分(如图6所示)。
在某些实施方案中，PCS包括大约1/8”直径木制棒。在某些实施方案中，PCS大约为待离心的植物的长度。在某些实施方案中，PCS的这种长度包括植物的长度加上仍然附着到幼苗的种子的长度或宽度。
在某些实施方案中，包括棒的PCS设定在离心样品容器中，所述棒的一个末端、尖端或突出物倚靠离心样品容器的内壁，以便所述棒的一些部分延伸至或横跨离心样品容器的内部。图5-9示出这种的各种示例性实施方案。
在某些实施方案中，植物茎的基本区域诸如至少约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、98％、99％或100％由所述植物结合(例如附着到或固定)的PCS的一侧支持，并且PCS设定到离心样品容器中，以便当植物离心时，PCS保持植物茎的长轴与由离心所引起的加速度平行。在某些实施方案中，所述长轴为植物的根茎轴(root-shoot axis)。在某些实施方案中，至少一株植物与(诸如附着到)至少一个PCS结合，并且将植物-PCS组合离心。在某些实施方案中，PCS接触其支持的每株植物。在某些实施方案中，PCS向其接触的植物提供充分的支持，以至于接触PCS的植物能够向不接触PCS的其他附近植物提供充分的支持，以便在离心期间充分地支持甚至不与PCS直接接触的植物以满足本文其他地方描述的非浸没性离心的要求。
如本文所提供的，PCS可包括足够坚固以便防止靶组织在离心期间接触储备处理剂和/或以便在离心期间维持期望的靶组织对齐的任何材料。在某些实施方案中，PCS还防止对植物的致命损伤，所述对植物的致命损伤否则将由在离心期间塌缩、折叠、撕裂、剪切或折断植物器官和/或组织引起。相似地，植物可以任何形式与PCS结合，只要植物-PCS组合向所述植物提供充分的结构支持，以便防止靶组织在离心期间接触储备处理剂和/或以便在离心期间维持期望的靶组织对齐。在某些实施方案中，PCS还可防止离心期间产生的加速力将植物器官或组织损伤而无法恢复。
在某些实施方案中，PCS至少与其所结合的植物的茎一样长。在某些实施方案中，PCS的长度还取决于种子是否仍附着到幼苗。在某些实施方案中，幼苗的茎沿着包括大约与幼苗一样长或更长的木制棒的PCS的长度附着。在某些实施方案中，植物茎附着到具有套的PCS，所述套包括柔性材料，诸如塑料石蜡、塑料套、铝箔或用来非破坏性地和可移动地使一个物品附着到另一个的任何其他材料，包括绳圈、金属线、橡皮筋等。设想了使植物结合、附着或固定到PCS的其他形式，只要PCS和植物的组合向所述植物的表面提供充分的磨擦，以便防止靶组织在离心力施加期间变得浸没于储备处理剂中，和/或只要PCS和植物的组合维持靶组织对齐，以便在离心力施加期间将至少一些处理剂推向与靶组织的至少一个细胞接触。
在某些实施方案中，例如当植物单独缠绕到单个PCS时，在植物和PCS之间直接产生了在离心期间将植物保持在适当位置的摩擦力。在某些实施方案中，PCS与植物的结合可以是直接的，诸如其中将所述植物保持在适当位置的摩擦力在捆扎在一起的至少两株植物之间发生。在某些实施方案中，这种捆扎足够紧，以便提供必需的摩擦力来防止靶组织在离心力施加期间变得浸没于储备处理剂中和/或维持靶组织对齐，以便在离心力施加期间将至少一些靶药剂推向与靶组织的至少一个细胞接触。
在某些实施方案中，PCS可为填充植物周围的空间的支持泡沫，以便所述PCS提供防止靶组织在离心力施加期间变得浸没于储备处理剂中所需的摩擦力和/或提供维持靶组织对齐所需的摩擦力，以便在离心力施加期间将至少一些靶药剂推向与靶组织的至少一个细胞接触。在一个优选的实施方案中，包括泡沫的PCS还将防止植物在离心期间遭受致命损伤。满足本文先前提到的PCS的一般说明的任何其他类型的支持性和/或粘着性基质均可与本发明结合使用。
在某些实施方案中，PCS与一批捆扎在一起的许多植物结合，并且被套围绕，所述套在此实施方案中也是PCS的部件，其帮助提供PCS实现自身功能(例如，套-棒PCS系统)所需的摩擦力。在某些实施方案中，棒用植物来缠绕以便进一步提高套-杆PCS系统的性能。图9示出PCS系统的示例性实施方案。
这些方法不限于离心期间任何特定的靶组织的对齐或植物的对齐。在某些实施方案中，不同组织需要相对于离心期间产生的加速力的不同的靶组织定向和或不同的植物体定向。例如，如果靶向组织为SAM，那么PCS可用来防止SAM在离心力施加期间变得浸没或接触储备处理剂。PCS还可用来确保在离心开始时将接触SAM或围绕SAM的组织(例如，叶原基和/或围绕SAM的老叶)的至少一些处理剂推入SAM的至少一个细胞中。
例如，本文描述了向玉米SAM递送处理剂的方法。在本文实例所示，植物排列在Beckman Coulter Allegra X-14系列离心机中，以便PCS将保持植物的茎根轴植物与由离心产生的加速力以及离心机中心最近的植物的SAM端和离离心机中心最远的植物的根端平行。以此方式，在离心期间，离心期间产生的加速力将把在SAM表面附近或SAM表面处的一些处理剂推入SAM的至少一个细胞中。
在靶向SAM组织的非浸没性离心的某些实施方案中，几打单倍体幼苗一起捆扎在包括套和棒的PCS中，并且基本上以相同的定向对齐，所述定向与图9所示的定向相似。然后植物与加倍剂(例如，秋水仙素)溶液接触几分钟，然后置于离心容器中并离心，以便SAM不接触储备加倍剂，然而在离心开始时接触植物的一些加倍剂在离心力施加期间推入SAM的至少一个细胞中，从而向植物的SAM内的细胞递送加倍剂。在一个优选的实施方案中，束PCS还防止由离心期间产生的加速力引起的对植物的致命损伤。在一些实施方案中，PCS可包括套或垫(matt)，只要所述套或垫用作本文描述的PCS的功能。
PCS可与基本上任何离心处理结合使用，不管其是否执行以上所述的功能。例如，用户可选择在浸没性旋转期间使用PCS，即使在那种情况下PCS不防止靶组织浸没于储备液中，并且即使在浸没性离心期间靶组织的对齐并不必要。在某些实施方案中，在浸没性离心期间使用PCS以对齐植物和/或靶向组织，并且能够更有效地向靶向植物组织递送处理液。在某些实施方案中，在浸没性离心期间使用PCS以在离心期间保持靶组织浸没于储备处理剂中，同时使剩余的或基本上剩余的植物体保持在所述储备处理剂之外。在某些实施方案中，在浸没性离心期间使用PCS，因为其使离心之前或之后或者后续离心之前或之后的植物处理更简单或更有效。
提高加倍效率
本文提供的方法可用来帮助向选定单倍体植物组织递送包含染色体加倍剂的植物处理剂，因此提高加倍效率。
“加倍效率”(DE)是通过产生DH1种子的指定的DH0植物的数目除以进行染色体加倍处理的那个指定的DH0植物的总数来计算的DH成功的总体规范。
如本文所用，进行染色体加倍处理的单倍体植物诸如单倍体幼苗被称为DH0植物。成功加倍的DH0植物可产生单倍体卵子和/或精子，并且如果DH0植物成功地自交，那么合子染色体数目可在具有2n孢子体的预期活力和生育力的基本上纯合型后代(在本文称为DH1植物)中恢复。
某些实施方案提供获得双单倍体玉米胚的方法，所述方法包括：进行向植物组织递送植物处理剂的任何前述方法，其中所述植物为单倍体植物，并且其中所述处理剂为染色体加倍剂，并且其中所述加倍剂诱导至少一种双单倍体植物的形成。本文还提供获得双单倍体植物的方法，所述方法包括：从由本文描述的方法获得的种子中收获双单倍体胚。在某些实施方案中，当从种子中收获胚时，种子附着到玉米穗。在其他实施方案中，当收获胚时，种子未附着到玉米穗。某些实施方案还提供向双单倍体胚供应充分的营养物，以便允许双单倍体胚发育成双单倍体植物。
某些实施方案还提供获得双单倍体玉米植物的方法，所述方法包括：获得通过本文提供的任何方法产生的双单倍体玉米胚，并且向所述胚供应充足的营养物以允许所述胚发育成双单倍体玉米植物种子。双单倍体玉米胚可通过包括以下的方法来产生：进行向茎尖分生组织中递送包含植物处理剂的溶液的任何前述方法，其中所述植物处理剂为染色体加倍剂，并且允许加倍剂诱导染色体加倍。
还提供获得包含双单倍体玉米胚的种子的方法，所述方法包括：收获包含由获得双单倍体玉米胚的方法获得的双单倍体胚的种子。双单倍体玉米胚可通过包括以下的方法来获得：进行向植物组织递送植物处理剂的任何前述方法，其中胚处理剂为染色体加倍剂，并且允许加倍剂诱导在至少一个种子中形成至少一种双单倍体胚。在某些实施方案中，收获的种子为生理上成熟的种子。
还提供获得双单倍体玉米植物的方法，所述方法包括：播种包含由获得包含双单倍体玉米胚的种子的方法获得的包含双单倍体玉米胚的种子，并且允许播种的种子发育成双单倍体玉米植物。在某些实施方案中，包含双单倍体玉米胚的种子获自第三方。换言之，收获种子的团体不一定是播种包含双单倍体胚的种子并且允许播种的种子发育成双单倍体玉米植物的团体。
另外的定义和描述
“植物群体(population of plant)”或“植物群体(plant population)”意指包括任何数目(包括一个)的个体、物体或数据的集合，从个体、物体或数据中采集样品以进行评估，例如，估计QTL效应。最常见地，所述术语涉及育种植物群体，成员选自所述育种植物群体并且杂交以在育种程序中产生后代。植物群体可包括单个育种杂交或多个育种杂交的后代，并且可为实际的植物或植物来源的材料或植物的计算机模拟表示。群体成员不必与选择用于后续周期的分析的群体成员或经最终选自以获得最后后代植物的那些群体成员相同。常常，植物群体来源于单个双亲杂交，但是还可来源于相同或不同亲本间的两种或更多种杂交。虽然植物群体可包括任何数目的个体，但是本领域技术人员将认识到，植物育种人员通常使用范围为一百个或两百个个体至几千个的群体大小，并且最高表现的5％-10％的群体是通常选择来用于后续杂交以便提高群体后续代的性能的群体。
如本文所用，“培养”描述了促进或改善植物在其生命周期中任何点(包括萌发)处的生长的任何活动。“照管”在本文与培养同义使用，例如在温室中照管植物等同于在温室中培养植物。
如本文所用的“生长培养基”包括能够支持植物发育的任何基质，包括盆栽土、田间土壤和实验室培养基，包括但不限于N6或基于MS的植物组织培养基。
如本文所用，“萌发”描述了在根(root radical)首次从种皮中出现时开始的植物生命周期中的一个点。这个时期可与被认为是“发芽”的时间段重叠，在所述发芽期间种子开始发出芽。
以下公开的实施例仅仅是可以另外的形式体现的本发明的代表。因此，本文公开的特定结构细节、功能细节和程序细节将不被理解为限制性的。
实施例
本文使用的单倍体玉米植物通过用来自单倍体诱导系的花粉对F1或F2玉米植物进行授粉来获得。将穗在种子成熟时收获、去壳，并且将单倍体种子通过本领域的标准方法来恢复。
可用来重复以下实验的单倍体诱导系的非限制性实例包括Stock 6(Coe 1959)、RWS(Rober等1005)、KEMS(Deimling等1997)、KMS或ZMS(Chalyk等3994；Chalyk和Chebotar 1000)，或来源于这些单倍体诱导系的其他诱导系。所述诱导系还可携带至少一种标记性状以有助于鉴别单倍体后代。单倍体库(haploid pool)的纯度可制成95％或更大，并且可使用本领域已知的各种方法来验证。
实施例1.用植物处理剂秋水仙素进行的单次非浸没性旋转成功地提高加倍效率。
四个不同的玉米F1杂种来源的单倍体诱导群体的玉米种子用于此实验；群体中的两个，雄性1和雄性2，来源于两个不同的雄性近交系，并且剩余的两个群体，雌性1和雌性2来源于两个不同的雌性近交系。使每个种质的种子在土壤中萌发，并且在温室中在标准玉米生长条件下照管后续的幼苗，直至幼苗达到V1至V2生长期。
接着，然后将若干随机选择的每个种质的幼苗从土壤中移除、洗涤以去除残留的土壤，然后经受接触步骤，所述接触步骤包括将幼苗在包含1250ppm秋水仙素的液体加倍剂中浸泡10分钟。
在接触步骤之后，将幼苗捆扎在具有木制棒的PCS中，所述PCS与图9中描述的PCS相似。将幼苗和棒用几层铝箔紧紧地缠绕在一起。注意将幼苗缠紧，但不能太紧以致于损伤幼苗的组织。将套的折叠和层排列成使得仍然依附到植物的表面的任何液体药剂在离心期间不会陷入套内。
一旦排列于离心机中，幼苗就经受在335g下非浸没性离心3min。
离心后，将幼苗从离心容器中移除，用水冲洗以去除任何剩余的植物处理剂，然后移植到生长室内的10英寸盆中，在所述生长室内将所述幼苗在标准玉米生长条件下照管，直至它们生长至成熟并开花。
尝试用从处理中存活的每株植物进行自花授粉以产生花粉，并且在随后的生长期间，确定每个样品中的授粉成功、受精成功和最终加倍效率。
来自每个种质的若干随机选择的幼苗的对照样品未接受暴露至植物处理剂，但是如同它们的处理过的对应物那样以其他方式同一地操作。
表1示出未能产生花粉的所有对照植物。因此，它们不能自交或产生自交种子，因此产生的DE为零。另一方面，接受非浸没性离心处理的样品展现出良好的总体结实(seed set)以及42％至71％范围的平均群体DE，取决于种质。
表1.当不同的单倍体玉米种质经受单次非浸没性离心时对DH成功的影响。授粉成功为产生丝和花粉并且因此能自交的植物的数目；受精成功为产生具有至少一粒种子的穗的加倍处理过的单倍体植物的数目。DE为加倍效率，等于受精成功除以每个种质和处理中处理的植物的数目。
此实施例证明，在各式各样的玉米种质中，与当前方法相比，这些方法将加倍剂有效地递送至植物分生组织，并且增加加倍效率。在某些实施方案中，可将其他植物处理剂递送至另外的玉米种质和除了玉米之外的物种中的各式各样的可替代组织。无论何时期望向特定植物组织递送化学药剂，特别是如果因为组织是内部的或者由其他组织覆盖和/或保护而难以到达(像茎分生组织)，那么这些方法比起使用当前方法的那些方法将提供更多成功。
秋水仙碱是有毒的，因此在此实施例中选择10min浸泡以进行接触步骤，并且它显示了DE的显著差异。应当理解，根据植物年龄、离心速度、秋水仙素浓度和/或其他参数，在其他条件下，可将包括更长或更短持续时间的接触步骤优化以实现期望的结果。
实施例2.用植物处理剂秋水仙素进行的单次浸没性离心成功地提高加倍效率。
5种不同的F1杂种来源的单倍体商业玉米株系的种子经随机选择，并且在温室中萌发。将所得的幼苗在V1-V2生长期时从土壤或生长培养基中移除，并且将土壤或生长培养基用水从植物中冲洗掉。将每个单倍体株系内的几个随机幼苗的一个样品置于离心样品容器中，而不考虑植物的茎根轴相对于在计划的离心期间产生的加速力将如何定向。接着，将包含1000ppm秋水仙素的植物处理液倒入容器中，以便溶液浸没每个植物SAM，然后在SAM浸没于植物处理剂中的情况下将样品在50g下离心10min。
离心后，将植物移除、用水冲洗以去除任何剩余的秋水仙素溶液，然后在光、湿度和温度受控的温室中恢复并照管几天，之后移植到苗圃温室。
对照样品不接受离心或秋水仙素暴露，但是如同处理样品那样以其他方式同一地操作。在植物的后续生长期间，确定每个样品中的最初存活、授粉成功、受精成功和加倍效率(DE)。
在离心期间经受与植物处理剂的接触的每个近交系与它们的对应的未处理对照相比，显示授粉成功、受精成功和DE的较大提高(表2)。与其对照相比，在离心样品中总平均DE提高25％，而最初存活仅下降15％。还注意到，对于每个样品，最初存活等于最终存活，并且虽然接受实验处理的近交样品中至少25％的所有个体均产生花粉和丝，但是在接受对照处理时那些相同的5个近交样品中的3个具有0％授粉成功。
表2.使不同单倍体基因型经受单次浸没性离心的结果。授粉成功为产生丝和花粉并且因此能自交的植物的数目；受精成功为产生具有至少一粒种子的穗的加倍处理过的单倍体植物的数目。DE为加倍效率，等于受精成功除以每个种质和处理中处理的植物的数目。
这些数据显示单次浸没性离心处理将植物处理剂有效地递送至植物组织。在此情况下，加倍剂被有效地递送至单倍体植物的分生组织，具有显著提高那些植物的加倍效率的效果，而对植物存活具有极少影响。
实施例3.连续离心处理成功地提高加倍效率。
5种不同的F1杂种来源的单倍体玉米株系的种子经随机选择，并且在温室中萌发。将所得的幼苗在V1-V3生长期时从土壤或生长培养基中移除，并且将土壤或生长培养基用水从植物中冲洗掉。然后将幼苗对齐，并且连同类似于图9示出的内容的于捆扎的PCS中的几根棒一起组装，并且将包含1000ppm秋水仙素的植物处理液倒入容器中，以便溶液浸没每株植物的SAM，然后将整个样品在50g下离心3min，同时SAM保持浸没于植物处理剂中。
在第一离心之后，将植物处理液倾出，并且使幼苗经受在335g下的非浸没性离心3min。在第二离心期间，将PCS和幼苗对齐，以便每株植物的SAM在施加离心力期间不接触储备处理剂。
在第二离心之后，将植物从离心容器中移除，并且用水冲洗以去除任何剩余的秋水仙素溶液，然后在光、湿度和温度受控的温室中恢复并照管几天，之后移植到苗圃温室。
对照样品不接受秋水仙素暴露，但是如同实验样品那样以其他方式同一地操作。在植物的后续生长期间，确定如实施例2所述的每个样品中的最初存活、授粉成功、受精成功、最终存活和加倍效率。
经受连续离心的所有五种基因型与它们的对应的未处理对照相比均显示显著提高的授粉成功、受精成功和加倍效率，没有最初存活的增加(表3)。对于每个样品，最初存活等于最终存活。观测到，与对照相比，接受实验处理的样品中的总体DE增加67％。此外，虽然接受实验处理的近交样品中至少62％的所有个体均产生花粉和丝，但是在接受对照处理时那些相同的5个近交样品中的3个产生0％授粉成功。
表3.使不同单倍体基因型经受第一浸没性离心、随后经受第二非浸没性离心的结果。授粉成功为产生丝和花粉并且因此能自交的植物的数目；受精成功为产生具有至少一粒种子的穗的加倍处理过的单倍体植物的数目。DE为加倍效率，等于受精成功除以每个种质和处理中处理的植物的数目。
这些数据显示连续离心处理将植物处理剂有效地递送至植物组织。在此情况下，加倍剂被有效地递送至单倍体植物的分生组织，具有显著提高那些植物的加倍效率的效果，而对存活基本无影响。
实施例4.其他植物处理剂。
为证明离心帮助向植物组织递送植物处理剂的能力，将呈商业混合形式的植物生长调节剂烯效唑(赤霉酸抑制剂)(0.055％烯效唑)混合于植物处理液中，并且与经受离心的植物接触。
处于V1-3生长期的F1来源的单倍体玉米植物的三个样品各自经受在50g下的单次浸没性离心10min，期间每株植物的SAM保持与包含以下物质的储备处理剂接触：a)不含Sumagic的非活性植物处理液(对照)、b)含有另外1％(体积:体积)Sumagic的植物处理液或c)含有另外2％Sumagic的植物处理液。
离心后，将植物移除、用水冲洗以去除任何剩余的植物处理剂，然后在光、湿度和温度受控的温室中恢复并照管几天，之后移植到苗圃温室。在生长三周之后，可视地评估每株植物从其各自的处理中存活的能力。图1示出从三个处理中的每个中恢复的植物的示例性代表。
图1示出，与1％或2％Sumagic接触时离心的样品更矮，展现出颜色更暗的更大叶片，展现出更粗的茎，并且展现出更多的根生物量。这不但表明这些方法提供除了加倍剂之外的植物处理剂至植物组织的有效递送的能力，而且表明处理液中生长调节剂的添加可改善植物健康。
实施例5.植物在大田环境中显示惊人的生存性
将来源于商业近交01DKD2与诱导系KHI1之间或商业近交83IDI1与KHI1之间的杂交的单倍体玉米幼苗通过单次旋转或连续旋转离心方法处理，并且在光、湿度和温度受控的环境中恢复大约15小时。然后将植物移植到大田中并且照管三周，三周之后评估植物存活率(表5)。
表5.两个近交来源的单倍体株系在与具有不同秋水仙素浓度的三种不同处理液组合的单次浸没性或连续旋转离心处理之后的大田移植存活率。
表5示出，来源于两个遗传趋异的近交的单倍体玉米株系当在处理之后移植到大田环境中时展示了极好的存活率。移植后3周，不管秋水仙素浓度或是否施加第二旋转，任一单倍体株系的存活率均高于80％。
实施例6.植物可从强离心力、随后的大田移植中存活
使来自几个不同F1杂种来源的单倍体诱导群体的单倍体幼苗在温室中生长到V1-V2期，在V1-V2期时将它们从土壤中移除、用水冲洗以去除残留土壤、分成具有相等数目植物的两份样品，然后将各样品连同几根棒一起捆扎成两个与图9示出的PCS相似的PCS。然后使植物经受在50g下的浸没性离心3min，同时SAM保持浸没于处理剂中。
在第一浸没性离心之后，使幼苗经受在335g下的更慢和更短的非浸没性离心3min，并且使另一份样品经受在500g下的更快和更久的非浸没性离心10min。
离心后，将所有幼苗从离心容器中移除，用水冲洗以去除任何剩余的植物处理剂，然后移植到户外的玉米田，在所述户外的玉米田中将所述幼苗在标准玉米生长条件下照管，直至它们生长至成熟并开花。尝试用从处理中存活良好足以产生花粉和丝的每株植物进行自花授粉，并且在确保生长期间，记录每个穗上和每个植物上形成的粒的数目。将经受相同处理的所有幼苗的存活率在所有种质中组合，并且平均化以产生每个处理中的总体存活率。相似地，将所有种质中的加倍效率组合并且平均化以产生每个处理中的总体DE。
表6示出，经受两次离心处理的植物在移植到大田环境之后产生良好的存活率和加倍效率。
表6.经受作为总体连续离心处理的一部分的两种不同非浸没性离心处理中的一种的不同种质的近交中的平均存活率和加倍效率。
此实施例证明，甚至当在处理之后将植物直接移植到大田时，用户可获得向靶向组织进行的处理剂的极好递送(如高DE所证实的那样)以及极好的存活率。此外，证明了与本文其他实施例相比基本上增加离心的持续时间和速度对存活率和加倍效率几乎没有影响，其中离心处理通常在335g下进行3min。因此，所预料的是，其他离心持续时间和时间将用于各式各样的离心参数和处理后植物恢复方法(例如，直接的大田移植vs.生长箱等)中。
实施例7.处理剂的递送以及良好存活在宽泛的植物生长期范围内是可能的。
为证明这些方法如何可用于宽泛的植物生长期范围内，使单倍体植物经受相同的连续离心处理，所述连续离心处理包括第一浸没性离心、随后是第二非浸没性离心。比较三个不同的生长期和对三个生活期之间的DH相关的成功指标的影响。
使来源于雌性近交系91DUQ1或雄性近交系83IDI1的F1杂种来源的单倍体幼苗在标准玉米生长条件中在温室中的土壤中萌发。为确保老苗将拟合入到离心样品容器中，并且为确保所有幼苗接受相同的化学处理，在种植后6天时使所有幼苗经受1％多效唑(PBZ)土壤浸液处理，每株植物10ml。
将幼苗的这个群体细分成3份样品，各自包含几打幼苗。各样品中的一半幼苗来源于91DUQ1，并且另一半来源于83IDI1。在V1-V2生长期(种植后1周)时将第一样品从土壤中移除，在V3-V4期(种植后2周)时将第二样品从土壤中移除，并且在V4-V5生长期(种植后3周)时将第三样品从土壤中移除。
从土壤中移除之后，将各样品中的幼苗在水中冲洗以去除残留土壤，然后连同几根木制棒一起缠绕于与图9示出的PCS相似的PCS中，并且经受在50g下在1250ppm秋水仙素中的第一浸没性离心3min。
在第一浸没性离心之后，将植物处理液倾出。将表面被依附了一些残留药剂的幼苗返回至空离心容器中，并且经受在335g下的非浸没性离心3min。
在第二离心之后，将植物从离心容器中移除，并且用水冲洗以去除任何剩余的秋水仙素溶液，然后在光、湿度和温度受控的温室中恢复并照管几天，之后移植到苗圃温室，在所述苗圃温室中将植物在标准玉米生长条件下照管，直至它们生长至成熟并开花。
尝试用从处理中存活的每株植物进行自花授粉以产生花粉和丝，并且在随后的生长期间，确定每个样品中的授粉成功、受精成功和最终加倍效率。在此实验中，各生长期样品中的加倍效率通过产生包含至少四个粒的至少一个穗的植物的数目除以所处理的植物的总数来计算。
图4中的一个明显趋势是，在早期生活期时，处理的样品倾向于展现出更高的授粉成功、受精成功和倍增效率。然而，应当指出，数据清楚地证明了使用这些方法对至少达到V4-V5的植物的效用，那样此处的生长期样品在评估的所有三个标准方面产生良好评分。尤其令人鼓舞的事实是，这个组的加倍效率平均为近30％、中位数为36.7％，表明这些方法也可用来向至少高达V6的较老植物递送加倍剂。
图4还清楚地表明，这些方法可用来向年龄比V1小得多的植物递送加倍剂，因为V1-V2样品展现出超过70％的DE。所预期的是，向幼小植物中的靶向组织进行有效药剂递送的这种趋势可延伸至早在生命周期中的萌发首次开始时的时间点。这些数据还显示，这些方法可通过采用本领域已知的用于将胚从萌发之前的种子中切除的方法(例如，胚拯救)或通过采用使用处理剂穿透种皮以促进未萌发的植物与处理剂之间接触的方法来用于甚至更幼小的植物上。
实施例8.植物可从很强的离心力中存活
使来源于雌性玉米近交系91DUQ1或雄性玉米近交系83IDI1的F1杂种来源的单倍体幼苗在标准玉米生长条件中在温室中的土壤中萌发，并且生长至V1-V2生长期(种植后1周)。然后将幼苗从土壤中移除、冲洗以去除残留土壤，并且划分为各自包含几打幼苗的5份样品。
将一份样品的植物连同几根木制棒一起捆扎成与图9示出的PCS相似的PCS。将这种捆扎的PCS样品置于离心容器中，首先放置根。将其他四份样品的每株植物用石蜡套单独地缠绕到包括棒的PCS，并且置于单独的离心容器中，类似于图7示出的那样，每个容器一个植物-PCS组件。
一旦附着到它们各自的PCS并置于它们各自的离心容器中，就将包含1250ppm秋水仙素的溶液添加到每个容器，直到将每株植物浸没，至少持续直到将每株植物的SAM浸没。然后在SAM浸没于处理液中的情况下将所有样品在50g下离心3min。
在第一离心之后，将处理液从各离心容器中排出，然后使各样品以如表9所示的范围为340g至2000g的六种不同速率中的一种经受非浸没性旋转3分钟。
在第二离心之后，将植物从离心容器中移除，并且用水冲洗以去除任何剩余的秋水仙素溶液，然后移植到10英寸盆中，并且生长室中在标准玉米生长条件下照管，直至它们生长至成熟并开花。
尝试用从处理中存活的每株植物进行自花授粉以产生花粉和穗，并且确定每个样品中的授粉成功。
表7.在单倍体植物样品上进行的五种不同离心速度处理的比较。最初存活为存活至开花的植物的部分。授粉成功为产生花粉和丝并且因此能自交的植物的数目；受精成功为产生具有至少一粒种子的穗的加倍处理过的单倍体植物的数目。DE为加倍效率，等于受精成功除以每个种质和处理中处理的植物的数目。
表7显示，甚至在2000g下离心3min的植物展现出极好的存活率。表7还显示，在离心期间，当植物由PCS单独地支持时获得了极好的加倍率和一致的结果。
因此，可合理地得出以下结论，这些方法将可用于2000g以上的速度，并且用户可期望使用广范围的离心率(包括至少高达4000g或5000g)来恢复至少一些DH1种子，虽然更高的离心率仍可能产生可接受的结果。
实施例9.植物处理剂递送的效率可用孵育来优化
此实验证明了离心之间的孵育步骤可改善植物处理剂的递送。
使来源于雌性近交系91DUQ1或雄性近交系83IDI1的F1杂种来源的单倍体幼苗在标准玉米生长条件中在温室中的土壤中萌发，并且生长至V1生长期(种植后1周)。接着，将幼苗从土壤中移除，用水冲洗以将残留土壤从植物中去除，然后分成4份样品，所述样品包含每个种质的几株幼苗/样品。
然后将各样品捆扎于包括用于支持的铝箔套和木制棒的PCS中，所述PCS与图9示出的PCS相似。一旦捆扎于PCS中，就使各样品与包含600ppm或800ppm秋水仙素的植物处理液接触，以便将每株植物的SAM完全浸没，然后在SAM在离心期间浸没于储备加倍剂中的情况下将各样品在100g下离心3min。
在浸没性离心之后，将植物从离心容器移除，并且同时来自第一离心的一些加倍溶液保持依附至植物，将根和每个茎的下半部在水中冲洗以将任何加倍剂从所述植物端中去除。然后将每个捆扎的样品在封闭潮湿的环境中孵育，持续表8列出的4种孵育期中的一种。
在每个各自的孵育期之后，将捆扎的样品从潮湿的外壳中移除，并且经受在340g下的非浸没性离心3min，其中接触植物的仅有的加倍溶液是来自先前浸没性离心的保持在植物上的加倍溶液，即，在第一离心之后未向植物中添加另外的加倍溶液。
在第二离心之后，将植物从离心容器中移除，并且用水冲洗以去除任何剩余的秋水仙素溶液，然后在光、湿度和温度受控的温室中恢复并照管几天，之后移植到苗圃温室，在所述苗圃温室中将植物在标准玉米生长条件下照管，直至它们生长至成熟并开花。
尝试用从处理中存活的每株植物进行自花授粉以产生花粉，并且确定每个处理中的最终加倍效率。在此实验中，各处理样品中的加倍效率通过产生包含至少四个粒的至少一个穗的各处理样品的植物的数目除以经受那组处理条件的植物的总数来计算。
表8显示，即使在相对低浓度的植物处理剂下，用增加的孵育期获得了良好的加倍效率。
表8.包括两种不同植物处理剂浓度和两种不同孵育期的四种不同处理组合对单倍体植物的加倍效率的影响。使植物经受在600ppm或800ppm的植物处理剂(秋水仙素)浓度下的第一浸没性离心，随后经受3分钟或3小时的孵育期，然后经受非浸没性离心。
表8显示，这些方法可用于各式各样的植物处理浓度和孵育期中，在所述孵育期内，植物与植物处理剂接触。这些结果与以下结论一致：离心步骤之前或之间的孵育期可改善向靶组织进行的植物处理剂的递送。在某些实施方案中，用户可使植物与植物处理剂接触，然后有意地延迟后续离心，以便实现提高的加倍效率。
实施例10.广范围的离心持续时间是对本发明有效的。
使两种遗传上不同的近交系中的一种(83IDI1或91DUQ1)的幼苗在温室中萌发，并且在V1-V3生长期时从土壤或生长培养基中移除，并且用水冲洗以去除残留土壤。然后将所有幼苗固定在与图9示出的PCS相似的包括套和棒的PCS中，并且经受在50g下包含1250ppm秋水仙素的液体处理液的浸没性旋转3min。
在第一浸没性离心之后，将植物处理液倾出，并且将捆扎的幼苗经受在340g下的非浸没性离心3min或180min。
在第二离心之后，将植物从离心容器中移除，并且用水冲洗以去除任何剩余的秋水仙素溶液，然后在光、湿度和温度受控的温室中恢复并照管一周，然后对存活的植物的数目进行计数以确定每个处理中的存活率。
表10.经受两种不同持续时间的非浸没性离心的两种不同种质的幼苗的存活率。
表10显示，甚至在不同的种质间，离心时间可显著增加，而没有降低存活率。甚至在3小时旋转时，本方法也产生极好的生存性。因此，很明显，当与超出本文直接测试的那些离心持续时间的离心持续时间一起使用时，这些方法在广泛的离心范围上、在证明其效用上非常有效。
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