技术领域本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及紫腺小花苣苔组培叶片两步成苗方法。
背景技术：
紫腺小花苣苔为苦苣苔科小花苣苔属植物，多年生草本，根状茎圆柱形，叶片肾形或圆形，花序梗、花序和花期外被线状短柔毛和紫色腺体，花期5-6月，果期6月。中国特有珍稀植物，特产广西平乐，生于石灰岩山地岩石上，海拔约为200-250m。紫腺小花苣苔分布区域极其狭窄，目前仅在广西平乐地区石灰岩山陡崖上发现少量植株，由于生长环境恶劣缺少水肥，加之其种子细小，萌发需要的温度范围、湿度范围和土壤酸碱度范围比较小，自然界难以进行有性繁殖，急需建立有效的繁育和保护体系。本发明旨在通过组织培养技术叶片两步成苗法对紫腺小花苣苔种质资源进行有效的繁育和保护，是目前对紫腺小花苣苔育苗最便捷、稳定的手段，可以节约大量的人力、物力和场地，便于种质交换和转移，避免有害病虫的人为传播。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种紫腺小花苣苔组培叶片两步成苗法，能够短时间内提供大量优质适合栽培的紫腺小花苣苔种苗。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：紫腺小花苣苔组培叶片两步成苗方法，其特征在于：（1）叶片诱导分化不定芽培养：取紫腺小花苣苔幼嫩叶片，在75%乙醇中表面消毒30~45s，无菌水2~3次，投入0.1%Hgcl25min,无菌水2~3次，0.1%Hgcl24min，无菌水2~3次冲洗干后切分为含主脉0.5cm×1cm大小接种在诱导及分化培养基上，在温度为21~25°C，光照强度1800~2600lux，光照时间为8~10小时/天的条件下，9~16天叶片分化出不定芽，（2）不定芽壮苗生根培养：选择紫腺小花苣苔叶片分化1~1.5个月、幼嫩叶片上分化出的具有2片以上叶子、高2~3cm不定芽接种到壮苗生根培养基，在温度为21~26°C，光照强度2000~2800lux，光照时间为8~10小时/天的条件下进行培养，1~2个月不定芽长至高4~6cm的无菌苗，根长平均根数4条以上、平均根长达2.5~4ｃｍ，生根率99.1%。所述诱导及分化培养基为：以MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤（6-BA）1~2.0ｍｇ、α-萘乙酸（NAA）0.3~1.0ｍｇ、琼脂3.8~4.4ｇ和蔗糖20~25ｇ，ｐＨ值5.8。所述壮苗生根培养基为：以1/2MS为基本培养基，每升添加NAA0.5~1.5ｍｇ、6-BA0.2~0.5、吲哚丁酸（IBA）0.5~1.0ｍｇ,琼脂3.8~4.5ｇ和蔗糖25~30ｇ，ｐＨ值5.8。采用本发明所述方法得到的种苗健壮、成活率高，能够短时间内提供大量优质适合栽培的紫腺小花苣苔种苗，并减少了配制培养基和转瓶的步骤，节约了大量人力物力，因此简单易行、生产成本降低，有效解决了紫腺小花苣苔规模化育苗及种质资源保存问题。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。紫腺小花苣苔组培叶片两步成苗法法，包括以下步骤：（1）叶片诱导分化不定芽培养：取紫腺小花苣苔幼嫩叶片，在75%乙醇中表面消毒30~45s，无菌水2~3次，投入0.1%Hgcl25min,无菌水2~3次，0.1%Hgcl23min，无菌水2~3次冲洗干后切分为0.5cm×1cm大小接种在诱导及分化培养基上，在温度为21~25°C，光照强度1800~2600lux，光照时间为8~10小时/天的条件下，10~15天叶片分化出不定芽。最佳的不定芽诱导及分化培养基为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.6mg/L+琼脂0.4%+蔗糖0.25%。（2）不定芽壮苗生根培养：选择紫腺小花苣苔叶片分化1~1.5个月、幼嫩叶片上分化出的具有2片以上叶子、高2~3cm不定芽接种到壮苗生根培养基，在温度为21~25°C，光照强度2000~2800lux，光照时间为8~10小时/天的条件下进行培养，1~2个月不定芽长至高4~6cm的无菌苗，根长平均根数4条以上、平均根长达2.5~4ｃｍ，生根率99.1%。最佳的壮苗生根培养基为：1/2MS+NAA1.0mg/L+6-BA0.3mg/L+IBA0.4mg/L+AC1.0mg/L+琼脂0.4%+蔗糖0.25%备注：6-BA（6-苄氨基嘌呤），NAA（萘乙酸），IAA(3-吲哚乙酸)，IBA(吲哚丁酸)，AC(活性炭)。