一种小叶章茎段组培快繁的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种小叶章茎段组培快繁的方法。
【背景技术】
[0002]小叶章(Calamagrostis angustifolia Kom.)是禾本科拂子茅属多年生根莖型草本植物，在我国主要分布于东北、华北、内蒙古等地区的平原低洼湿地，是三江平原典型草甸、沼泽化草甸的建群植物和优势植物。
[0003]小叶章具有重要的经济价值和生态价值，例如在东北草地地区其饲用价值仅次于羊草，同时它也是很好的水土保持植物和造纸等轻工业的良好原料。
[0004]近年来，由于三江平原大量湿地开垦成农田，使得湿地生态系统遭到严重破坏，湿地生物多样性降低，小叶章的种群受到严重的破坏，生态功能下降。因此，对小叶章的人工繁殖可以减少对野生资源的破坏。
[0005]目前，小叶章仍处于野生状态，种子萌芽率低，结实率低，而利用植物离体器官直接再生不定芽具有培养时间短，不容易发生变异，在短期内快速繁殖优质苗木而不受到季节的限制等优点。因此，本发明以小叶章幼嫩茎段为外植体，通过直接诱导不定芽、继代增殖、生根和炼苗移栽等过程，从而建立小叶章的组织培养和快速繁殖体系，为小叶章的资源保护、基因工程研究提供可靠的理论基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了解决野生状态小叶章的种子萌芽率低和结实率低的问题，而提供了一种小叶章茎段组培快繁的方法。
[0007]本发明的小叶章茎段组培快繁的方法按以下步骤进行:
[0008]—、茎段外植体的采集:选取当年新生无病虫害和生长健壮的幼嫩茎段作为外植体；
[0009]二、茎段外植体的消毒:将采集的外植体去除叶片后，剪成3cm?4cm长的茎段，用自来水冲洗8min?1min，再用适量的洗洁精水冲洗2?3遍，然后用自来水冲洗干净后置于超净工作台中，用70%?75%酒精浸泡30s?40s，无菌水冲洗2?3次；用0.1 ^HgCl2溶液消毒2111；[11、41]1；[11、61]1；[11、81]1；[11、101]1；[11和151]1；[11，期间不断摇晃，无菌水冲洗5?6次，用无菌滤纸吸干表面水分，备用；
[0010]三、诱导培养:将消毒好的茎段接种于无菌的诱导培养基中，诱导培养出腋芽;所述的诱导培养基为:含有0.lmg/L?0.5mg/L 6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5?5.8;
[0011 ]四、增殖培养:将腋芽切下，切取长度为1.5cm?2cm，然后将腋芽转接到增殖培养基中培养；连续继代培养2次?3次，腋芽分化形成增殖苗；所述的增殖培养基为:含有
0.5mg/L?1.0mg/L2_iP(植物激素异戊稀基腺嘌呤)、0.lmg/L?0.5mg/L6_BA、0.lmg/L?
0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5?5.8;培养条件:温度25±2°C，光照强度30μπιο1.m-2.s—1 ?40ymol.m-2.s—1，光照 14h/d?16h/d;诱导培养28d?30d;
[0012]五、壮苗伸长培养:将步骤四得到的增殖苗的丛生芽切下转接到伸长培养基中，得到伸长的丛生芽；所述的伸长培养基为:含有0.lmg/L?0.5mg/L GA3、0.lmg/L?0.2mg/LNAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5?5.8;
[0013]六、生根培养:切取步骤五伸长的丛生芽，然后转接至生根培养基上进行培养，得到组培生根苗，所述的生根培养基为:含有0.lmg/L?2.0mg/L NAA、30g/L?35g//L蔗糖和6g/L?7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5?5.8，培养条件:温度25 ± 2°C，光照强度30μmo I.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;诱导培养28d?30d;
[0014]七、炼苗移栽:将组培生根苗在炼苗室开盖锻炼2天?3天后，移栽至混合基质中，得到小叶章再生植株;所述混合基质是由草炭土、蛭石和珍珠岩按重量比3: (I?2): (I?3)组成的混合物。
[0015]本发明相对于现有的技术的优点:
[0016](I)本发明采用茎段直接再生不定芽具有培养时间短(能在3个月到4个月之间成苗)，不容易发生变异等优点，能较好的保持母本的生物学性状，从而为小叶章的资源保护、基因工程研究提供可靠的理论基础。
[0017](2)本发明的小叶章茎段组培快繁方法，外植体的腋芽诱导速度快;诱导率高、达87.44%以上；增殖系数可达5.76?6.23，生根率可达100%，组培生根苗健壮、移栽成活率高达95%以上。
[0018]附图及说明
[0019]图1为实施例1的无菌材料图片；
[0020]图2为实施例1的茎段腋芽萌发图片；
[0021]图3为实施例1的茎段增殖培养图片；
[0022]图4是实施例1的壮苗伸长培养图片；
[0023 ]图5是实施例1的生根培养图片；
[0024]图6是实施例1的移栽成活图片。
【具体实施方式】
[0025]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0026]【具体实施方式】一:本实施方式的小叶章茎段组培快繁的方法按以下步骤进行:
[0027]—、茎段外植体的采集:选取当年新生无病虫害和生长健壮的幼嫩茎段作为外植体；
[0028]二、茎段外植体的消毒:将采集的外植体去除叶片后，剪成3cm?4cm长的茎段，用自来水冲洗8min?1min，再用适量的洗洁精水冲洗2?3遍，然后用自来水冲洗干净后置于超净工作台中，用70%?75%酒精浸泡30s?40s，无菌水冲洗2?3次；用0.1 ^HgCl2溶液消毒2111；[11、41]1；[11、61]1；[11、81]1；[11、101]1；[11和151]1；[11，期间不断摇晃，无菌水冲洗5?6次，用无菌滤纸吸干表面水分，备用；
[0029]三、诱导培养:将消毒好的茎段接种于无菌的诱导培养基中，诱导培养出腋芽;所述的诱导培养基为:含有0.lmg/L?0.5mg/L 6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5?5.8;
[0030]四、增殖培养:将腋芽切下，切取长度为1.5cm?2cm，然后将腋芽转接到增殖培养基中培养；连续继代培养2次?3次，腋芽分化形成增殖苗；所述的增殖培养基为:含有
0.5mg/L?1.0mg/L2-1P、0.lmg/L?0.5mg/L6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L鹿糖和6g/L?7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5?5.8;培养条件:温度25 土 2 V，光照强度30μηιο1.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;诱导培养28d?30d;
[0031]五、壮苗伸长培养:将步骤四得到的增殖苗的丛生芽切下转接到伸长培养基中，得到伸长的丛生芽；所述的伸长培养基为:含有0.lmg/L?0.5mg/L GA3、0.lmg/L?0.2mg/LNAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5?5.8;
[0032]六、生根培养:切取步骤五伸长的丛生芽，然后转接至生根培养基上进行培养，得到组培生根苗，所述的生根培养基为:含有0.lmg/L?2.0mg/L NAA、30g/L?35g//L蔗糖和6g/L?7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5?5.8，培养条件:温度25 ± 2°C，光照强度30μmo I.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;诱导培养28d?30d;
[0033]七、炼苗移栽:将组培生根苗在炼苗室开盖锻炼2天?3天后，移栽至混合基质中，得到小叶章再生植株;所述混合基质是由草炭土、蛭石和珍珠岩按重量比3: (I?2): (I?3)组成的混合物。
[0034]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是，诱导培养基为:含有0.5mg/L 6-BA、0.lmg/L NAA、35g/L蔗糖和7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5。其他步骤与参数与【具体实施方式】一相同。
[0035]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是，增殖培养基为:含有
0.5mg/L 2-1P、0.5mg/L6_BA、0.lmg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂粉的 1/2MS培养基，pH值为5.5。其他步骤与参数与【具体实施方式】一相同。
[0036]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是，步骤四增殖培养的培养条件:温度25°C，光照强度30μπκ)1πΓ2.s—S光照15h/d;诱导培养28d。其他步骤与参数与【具体实施方式】一相同。
[0037]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是，伸长培养基为:含有
0.5mg/L GA3、0.lmg/L熟4、308/1蔗糖和68/1琼脂粉的1/21^培养基，？田直为5.5。其他步骤与参数与【具体实施方式】一相同。
[0038]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是，所述的生根培养基为:含有2.0mg/L嫩4、308/1蔗糖和78/1琼脂粉的1/21^培养基，？!1值为5.5。其他步骤与参数与【具体实施方式】一相同。
[0039]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是，步骤六生根培养的培养条件:温度25°C，光照强度40μπιΟ1.πΓ2.s—S光照16h/d;诱导培养30d。其他步骤与参数与【具体实施方式】一相同。
[0040]【具体实施方式】八:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是，混合基质中按重量比草炭土:輕石:珍珠岩=3:1: I。其他步骤与参数与【具体实施方式】一相同。
[0041 ] 实施例1
[0042]本实施例的小叶章茎段组培快繁的方法按以下步骤进行:
[0043]—、茎段外植体的采集:选取当年新生无病虫害和生长健壮的幼嫩茎段作为外植体。
[0044]二、茎段外植体的消毒:将采集的外植体去除叶片后，剪成3cm?4cm长的茎段，用自来水冲洗lOmin，再用适量的洗洁精水冲洗2遍，然后用自来水冲洗干净后置于超净工作台中，用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗2次；用0.1 %HgCh溶液消毒2min、4min、6min、8min、10mir^P15min，期间不断摇晃，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干表面水分，备用(图1);
[0045]三、诱导培养:将消毒好的茎段接种于无菌诱导培养基中，诱导培养出腋芽;所述的诱导培养基(和前面说的无菌诱导培养基是一个)为:1/2MS(MS大量元素减半，其他不变)+6-BA0.5mg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖35g/L+琼脂粉7g/L+pH值为5.5(图2);
[0046]四、增殖培养:将长度1.5?2cm的腋芽切下转接到增殖培养基培养;连续继代2次?3次，腋芽分化形成增殖苗;所述的增殖培养基为:l/2MS+2-1P(植物激素异戊烯基腺嘌呤)0.5mg/L+6-BA0.lmg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖35g/L+琼脂粉7g/L+pH值为5.5;培养条件:温度25°C，光照强度40μπιΟ1.πΓ2.s—S光照16h/d;诱导培养28d(图3);
[0047]五、壮苗伸长培养:将步骤四得到的增殖苗的丛生芽切下转接到伸长培养基中，所述的伸长培养基为:1/2MS+GA30.5mg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖35g/L+琼脂粉6g/L+pH值为5.5(图 4);
[0048]六、生根培养:切取丛生芽转接至生根培养基上进行培养，得到组培生根苗，所述的生根培养基为:1/2MS+NAA2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L+pH值为5.5，培养条件:温度25°C，光照强度40μπιΟ1.m—2.s—1，光照 16h/d;诱导培养30d(图5);
[0049]七、炼苗移栽:将生根苗在炼苗室开盖锻炼3天后，移栽至按重量比的草炭土:蛭石:珍珠岩=3:1:1混合的基质中，得到小叶章再生植株(图6)。
[0050]图2为步骤三诱导培养15d后腋芽可长至3cm左右，叶片开展，形成绿梢，诱导率为87.44%。
[0051 ]图3为步骤四腋芽的单芽形成芽丛，芽伸长生长快，增殖系数可高达5.76。
[0052]图5表明不定根的诱导率为100%，植株健壮，叶色翠绿，根系粗壮。
[0053]本实施例实现了小叶章茎段快速繁殖成小叶章再生植株，且增殖系数可高达5.76和不定根的诱导率为100%。
【主权项】
1.一种小叶章茎段组培快繁的方法，其特征在于:该方法按以下步骤进行: 一、茎段外植体的采集:选取当年新生无病虫害和生长健壮的幼嫩茎段作为外植体； 二、茎段外植体的消毒:将采集的外植体去除叶片后，剪成3cm-4cm长的茎段，用自来水冲洗Smin?lOmin，再用适量的洗洁精水冲洗2?3遍，然后用自来水冲洗干净后置于超净工作台中，用70%?75%酒精浸泡30s?40s，无菌水冲洗2?3次；用0.1 ^HgCl2溶液消毒2min、4min、6min、8min、1min和15min，期间不断摇晃，无菌水冲洗5?6次，用无菌滤纸吸干表面水分，备用； 三、诱导培养:将消毒好的茎段接种于无菌的诱导培养基中，诱导培养出腋芽;所述的诱导培养基为:含有0.lmg/L?0.5mg/L 6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L鹿糖和6g/L?7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5?5.8; 四、增殖培养:将腋芽切下，切取长度为1.5cm?2cm，然后将腋芽转接到增殖培养基中培养;连续继代培养2次?3次，腋芽分化形成增殖苗;所述的增殖培养基为:含有0.5mg/L?1.0mg/L2_iP、0.lmg/L?0.5mg/L6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L鹿糖和6g/L?7g/L琼脂粉的I /2MS培养基，pH值为5.5?5.8 ;培养条件:温度25 ± 2 °C，光照强度30μmo I.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;诱导培养28d?30d; 五、壮苗伸长培养:将步骤四得到的增殖苗的丛生芽切下转接到伸长培养基中，得到伸长的丛生芽;所述的伸长培养基为:含有0.lmg/L?0.5mg/L GA3、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5?5.8; 六、生根培养:切取步骤五伸长的丛生芽，然后转接至生根培养基上进行培养，得到组培生根苗，所述的生根培养基为:含有0.lmg/L?2.0mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5?5.8，培养条件:温度25 ± 2°C，光照强度30ymol.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;诱导培养28d?30d; 七、炼苗移栽:将组培生根苗在炼苗室开盖锻炼2天?3天后，移栽至混合基质中，得到小叶章再生植株;所述混合基质是由草炭土、蛭石和珍珠岩按重量比3: (I?2): (I?3)组成的混合物。2.根据权利要求1所述的一种小叶章茎段组培快繁的方法，其特征在于:诱导培养基为:含有0.5mg/L 6-BA、0.lmg/L NAA、35g/L蔗糖和7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5。3.根据权利要求1所述的一种小叶章茎段组培快繁的方法，其特征在于:增殖培养基为:含有0.5mg/L 2-1P、0.5mg/L6_BA、0.lmg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂粉的 1/2MS培养基，pH值为5.5。4.根据权利要求1所述的一种小叶章茎段组培快繁的方法，其特征在于:步骤四增殖培养的培养条件:温度25°C，光照强度30μπιΟ1.πΓ2.s—S光照15h/d;诱导培养28d。5.根据权利要求1所述的一种小叶章茎段组培快繁的方法，其特征在于:伸长培养基为:含有0.5mg/L GA3、0.lmg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5。6.根据权利要求1所述的一种小叶章茎段组培快繁的方法，其特征在于:所述的生根培养基为:含有2.0mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂粉的1/2MS培养基，pH值为5.5。7.根据权利要求1所述的一种小叶章茎段组培快繁的方法，其特征在于:步骤六生根培养的培养条件:温度25°C，光照强度40μηιο1.m—2.s—S光照16h/d;诱导培养30d。8.根据权利要求1所述的一种小叶章茎段组培快繁的方法，其特征在于:混合基质中按 重量比草炭土:蛭石:珍珠岩= 3:1:1。
【专利摘要】一种小叶章茎段组培快繁的方法，本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种小叶章茎段组培快繁的方法。本发明的目的是为了解决野生状态小叶章的种子萌芽率低和结实率低的问题。本发明的小叶章茎段组培快繁的方法按以下步骤进行：一、茎段外植体的采集、二、茎段外植体的消毒、三、诱导培养、四、增殖培养、五、壮苗伸长培养、六、生根培养、七、炼苗移栽。本发明采用茎段直接再生不定芽具有培养时间短(能在3个月到4个月之间成苗)，不容易发生变异等优点且本发明的小叶章茎段组培快繁方法，外植体的腋芽诱导速度快；诱导率高。本发明的培养方法用于植物快速繁殖。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105706934
【申请号】CN201610124898
【发明人】张玉, 倪红伟, 徐明怡, 冷海楠, 王丽媛, 隋心
【申请人】黑龙江省科学院自然与生态研究所