一种间充质干细胞冻存液的制作方法

本发明涉及冻存液技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞冻存液。

背景技术：

目前干细胞冻存液的使用方法为：在细胞培养达到一定密度后，需要冷冻保存在液氮中保持细胞的活性，在日后的使用复苏后能够正常的培养，因此在冻存时需要添加一定比例的冻存液在冻存时保持细胞的完整和对细胞的伤害降至最低。

现有技术中的细胞冻存液往往由胎牛血清与二甲基亚砜按体积比为9：1混合得到，由于使用动物源的胎牛血清，导致细胞冻存液中掺入非人源物质，造成残留或者污染，而且现有的细胞冻存液在干细胞后续复苏培养过程中干细胞的贴壁率为80％左右，死细胞较多，获得的最终细胞数为1.2×10⁷/瓶左右，成本也较高。

技术实现要素：

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种间充质干细胞冻存液，更适合间充质干细胞的冻存，间充质干细胞重新复苏后贴壁率达到90％以上，死细胞较少，培养7天后收获得到的细胞数为2×10⁷/瓶，大大提高了细胞的数量；同时检测细胞表型时，CD44⁺达到99％以上，CD105⁺达到99％以上。

本发明提出的一种间充质干细胞冻存液，其原料按体积百分比包括：1640培养液65.5～75.4％，二甲基亚砜9.8～10.1％，人血白蛋白9.8～11.2％，羟乙基淀粉9.9～10.8％，成纤维细胞生长因子0.5～1.5％。

具体实施方式中，1640培养液的体积百分比可以为65.5％、66％、66.5％、 67％、67.5％、68％、68.5％、69％、69.5％、70％、70.5％、71％、71.5％、72％、72.5％、73％、73.5％、74％、74.5％、75％、75.4％，二甲基亚砜的体积百分比可以为9.8％、9.9％、10.0％、10.1％，人血白蛋白的体积百分比可以为9.8％、9.9％、10％、10.1％、10.2％、10.3％、10.4％、10.5％、10.6％、10.7％、10.8％、10.9％、11％、11.1％、11.2％，羟乙基淀粉的体积百分比可以为9.9％、10％、10.1％、10.2％、10.3％、10.4％、10.5％、10.6％、10.7％、10.8％，成纤维细胞生长因子的体积百分比可以为0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％。

优选地，其原料按体积百分比包括：1640培养液68～72％，二甲基亚砜9.9～10.0％，人血白蛋白10～11％，羟乙基淀粉10.0～10.2％，成纤维细胞生长因子0.8～1.2％。

优选地，人血白蛋白、羟乙基淀粉、成纤维细胞生长因子的重体积比为10.2：10：1.1。

优选地，人血白蛋白、羟乙基淀粉、成纤维细胞生长因子的重体积比为10.8：10.1：1。

优选地，人血白蛋白、羟乙基淀粉、成纤维细胞生长因子的重体积比为10.5：10.2：0.9。

优选地，其原料按体积百分比包括：1640培养液69％，二甲基亚砜10％，人血白蛋白10％，羟乙基淀粉10％，成纤维细胞生长因子1％。

本发明采用1640培养液、人血白蛋白、羟乙基淀粉、成纤维细胞生长因子相互配合，能滋养间充质干细胞，促进间充质干细胞处于半休眠状态，使间充质干细胞的能量消耗维持在较低的水平，促进间充质干细胞在液氮中保持细胞的活性，使之复苏后能够进行正常的培养；其中1640培养液、人血白蛋白、羟 乙基淀粉为冻存间充质干细胞提供营养成分，而人血白蛋白、羟乙基淀粉和二甲基亚砜相互配合能降低细胞内水熔点，维持细胞内外渗透压平衡，成纤维细胞生长因子能使间充质干细胞在冻存期间进行缓慢修复，维持细胞活性。综上所述，本发明相比于现有技术中的冻存液更适合间充质干细胞的冻存。

使用本发明进行间充质干细胞的冻存，当间充质干细胞重新复苏后贴壁率达到90％以上，死细胞较少，培养7天后收获得到的细胞数为2×10⁷/瓶，大大提高了细胞的数量；同时检测细胞表型时，CD44⁺达到99％以上，CD105⁺达到99％以上。

附图说明

图1为本发明实施例5所得间充质干细胞冻存液与现有冻存液进行细胞冻存、复苏，复苏干细胞贴壁率对比图。

图2为本发明实施例5所得间充质干细胞冻存液与现有冻存液进行细胞冻存、复苏，复苏干细胞活性对比图。

图3为本发明实施例5所得间充质干细胞冻存液与现有冻存液进行细胞冻存、复苏，复苏干细胞表型检测图。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

本发明提出的一种间充质干细胞冻存液，其原料按体积百分比包括：1640培养液67.6％，二甲基亚砜9.8％，人血白蛋白11.2％，羟乙基淀粉9.9％，成纤维细胞生长因子1.5％。

实施例2

本发明提出的一种间充质干细胞冻存液，其原料按体积百分比包括：1640 培养液68.8％，二甲基亚砜10.1％，人血白蛋白9.8％，羟乙基淀粉10.8％，成纤维细胞生长因子0.5％。

实施例3

本发明提出的一种间充质干细胞冻存液，其原料按体积百分比包括：1640培养液67.9％，二甲基亚砜9.9％，人血白蛋白11％，羟乙基淀粉10％，成纤维细胞生长因子1.2％。

实施例4

本发明提出的一种间充质干细胞冻存液，其原料按体积百分比包括：1640培养液69％，二甲基亚砜10％，人血白蛋白10％，羟乙基淀粉10.2％，成纤维细胞生长因子0.8％。

实施例5

本发明提出的一种间充质干细胞冻存液，其原料按体积百分比包括：1640培养液69％，二甲基亚砜10％，人血白蛋白10％，羟乙基淀粉10％，成纤维细胞生长因子1％。

将实施例5所得间充质干细胞冻存液进行细胞冻存并对复苏细胞进行检测，具体操作如下：

1、将实施例5所得间充质干细胞冻存液加至干细胞重悬后，保存在冻存管中，5×10⁶/管，程序降温的方式冻存，24h后转移到液氮管中保存；

2、取出一根含冻存细胞的冻存管，37℃水浴复溶后，加到培养瓶中，再加入30mL干细胞专用培养基，放置37°CO₂培养箱中培养；

3、第2日更换培养瓶中培养液，观察细胞贴壁情况；

4、第4日传代，检测细胞数及活性；

5、第7日收获贴壁细胞，检测细胞数及活性，以及干细胞表型。

其结果如图1-3所示，图1为复苏干细胞贴壁率对比图，图2为复苏干细胞活性对比图，图3为复苏干细胞表型检测图。由图1和图2可知：采用本发明实施例5所得间充质干细胞冻存液进行冻存、复苏后，细胞的活性和贴壁率远远高于现有的冻存液，其贴壁率和活性均可达到90％以上；而由图3可知：采用本发明实施例5所得间充质干细胞冻存液进行冻存、复苏后，细胞表型中CD44⁺达到99％以上，CD105⁺达到99％以上。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。