一种有效测定野葛花粉活力的方法与流程

文档序号:12421300阅读:516来源:国知局

本发明涉及农业领域,具体涉及一种有效测定野葛花粉活力的方法。



背景技术:

野葛为豆科葛属植物,别名葛藤,甘葛等。我国葛根的栽培历史悠久,迄今已有6千多年。我国现有十多种葛属品种,且种质资源极为丰富,产量质量均居全球之首。野葛是我国传统的大宗中药材,富含淀粉及异黄酮类物质,其中淀粉具有可食用性,异黄酮类物质具有降血压血脂,扩张冠状动脉,抗氧化,提高大脑记忆能力,保护肝功能等作用,具有良好的食用价值和药用价值,属于国家卫生部公布的药食两用资源,是重要的地区经济作物之一。在植物体中,成熟的花粉包含着植物体的全部遗传信息,花粉贮藏是有效利用珍稀种质的简捷、高效途径。在进行野葛杂交授粉和人工辅助授粉工作中,通常需要进行花粉贮藏和花粉活力的测定。如何鉴定、采集高纯度和高生活力的花粉对后期的杂交育种工作至关重要。花粉活力是花粉细胞存活能力的指标,是花粉生物学特性研究中的一项重要内容,花粉活力的大小可以估测花粉授精和遗传后代的能力。花粉活力受自身遗传特性和外界因素的影响。现有技术对花粉活力的测定中,染色法测定时染色时间不易把握,且有时候颜色重叠,在显微镜下不易观察;形态学观察法虽然简单,但有些花粉形态正常,其实已经失去活力,统计起来也会有误差;花粉离体培养测定法是相对有效,接近实际结果的测定方法,但不同植物有着不同的离体萌发培养测定条件,还需要进一步摸索。目前,关于有效测定野葛花粉活力的方法还未见报道。



技术实现要素:

为解决上述问题,本发明提供了一种有效测定野葛花粉活力的方法,高效、快速、简便、成本低。

为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:

一种有效测定野葛花粉活力的方法,包括以下步骤:

S1、制备培养液;所述的培养液由以下质量百分比的原料制备而成:蔗糖15%-20%、硼酸0.05%-0.1%、氯化钙0.05%-0.1%,水余量;

S2、花粉采集:于上午10点采集花粉,并将采集到的花粉装入无菌离心管中,避光保存;

S3、花粉培养:将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中,将采集的花粉均匀的撒在培养液上,在黑暗或自然光中培养30-60分钟;

S4、镜检,以花粉管长度达到花粉粒直径的2倍及以上视为萌发,计算萌发率。

所述萌发率通过以下公式进行计算:

萌发率=[(B1+B2+B3+B4+B5+B6+B7+B8)/A]×100%=(B/A)×100%;

式中,A为圆形培养皿的面积,B1-B8为镜检时圆形培养皿均分成8个区域内的每个区域内花粉萌发的面积;B为8个区域中花粉萌发的面积之和。

其中,每个小区域中萌发的花粉的面积统计方法为(以B1区域为例):萌发的花粉区域具有不确定性,但是萌发区域总会有类似三角形,圆形,四边形等形状的区域,此时计算面积则以三角形,圆形或者四边形的面积计算公式去计算,然后将所得的面积进行求和,得到B1区域的面积。

本发明具有以下有益效果:

1、只需培养30-60分钟即可得到野葛花粉的活力,一定程度上缩短了实验时间,该方法操作简单,更适用于实际的生产应用。

2、培养基质的配制简单易操作,相比其它人工、贵重微量元素等费用、成本低。

3、可以实时观察,提前检测花粉活力,避免直接人工授粉后由于野葛花粉活性的缺失而造成的经济损失。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。

以下实施例中,所述萌发率通过以下公式进行计算:

萌发率=[(B1+B2+B3+B4+B5+B6+B7+B8)/A]×100%=(B/A)×100%;

式中,A为圆形培养皿的面积,B1-B8为镜检时圆形培养皿均分成8个区域内的每个区域内花粉萌发的面积;B为8个区域中花粉萌发的面积之和。每个小区域中萌发的花粉的面积统计方法为(以B1区域为例):萌发的花粉区域具有不确定性,但是萌发区域总会有类似三角形,圆形,四边形等形状的区域,此时计算面积则以三角形,圆形或者四边形的面积计算公式去计算,然后将所得的面积进行求和,得到B1区域的面积。

实施例1

一种有效测定野葛花粉活力的方法,包括以下步骤:

S1、制备培养液:称取150g蔗糖,0.1g硼酸,0.1g氯化钙加水定容至1L,溶解,即制得培养液;

S2、花粉采集:于上午10点采集花粉,将所述花粉装入无菌离心管中,避光保存;

S3、花粉培养:将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中,将采集的花粉均匀的撒在培养液上,在自然光中培养45分钟;

S4、镜检,计算萌发率为76%,花粉管生长的一致性高,适于萌发率的观察和计算。

实施例2

一种有效测定野葛花粉活力的方法,包括以下步骤:

S1、制备培养液:称取200g蔗糖,0.05g硼酸,0.1g氯化钙加水定容至1L,溶解,即制得培养液;

S2、花粉采集:于上午10点采集花粉,将所述花粉装入无菌离心管中,避光保存;

S3、花粉培养:将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中,将采集的花粉均匀的撒在培养液上,在黑暗中培养60分钟;

S4、镜检,计算萌发率为82%,花粉管生长的一致性高,适于萌发率的观察和计算。

实施例3

一种有效测定野葛花粉活力的方法,包括以下步骤:

S1、制备培养液:称取175g蔗糖,0.1g硼酸,0.05g氯化钙加水定容至1L,溶解,即制得培养液;

S2、花粉采集:于上午10点采集花粉,将所述花粉装入无菌离心管中,避光保存;

S3、花粉培养:将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中,将采集的花粉均匀的撒在培养液上,在自然光中培养30分钟;

S4、镜检,计算萌发率为78%,花粉管生长的一致性高,适于萌发率的观察和计算。

实施例4

一种有效测定野葛花粉活力的方法,包括以下步骤:

S1、制备培养液:称取150g蔗糖,0.1g硼酸,0.05g氯化钙加水定容至1L,溶解,即制得培养液;

S2、花粉采集:于上午10点采集花粉,将所述花粉装入无菌离心管中,避光保存;

S3、花粉培养:将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中,将采集的花粉均匀的撒在培养液上,在黑暗中培养45分钟;

S4、镜检,计算萌发率为75%,花粉管生长的一致性高,适于萌发率的观察和计算。

实施例5

一种有效测定野葛花粉活力的方法,包括以下步骤:

S1、制备培养液:称取175g蔗糖,0.05g硼酸,0.1g氯化钙加水定容至1L,溶解,即制得培养液;

S2、花粉采集:于上午10点采集花粉,将所述花粉装入无菌离心管中,避光保存;

S3、花粉培养:将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中,将采集的花粉均匀的撒在培养液上,在自然光中培养45分钟;

S4、镜检,计算萌发率为76%,花粉管生长的一致性高,适于萌发率的观察和计算。

验证试验

为了验证本发明有效测定野葛花粉活力的方法的效果,设计以下试验进行验证。

不同培养液配方对野葛花粉活力测定的影响

1、设计22组含蔗糖,硼酸和氯化钙的不同浓度梯度的培养培养液,编号1-21,其中编号19-21用于检测氯化钙浓度对花粉萌发率和花粉管生长一致性的影响情况;另选用花粉基本培养基作为对照,编号22:质量浓度为5%的蔗糖,质量浓度为0.1%的硼酸,质量浓度为0.1%的氯化钙。具体参数如表1所示。

表1对比试验中各成分的配比

2、将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中,将采集的花粉均匀的撒在培养液上,黑暗室温培养后用显微镜观察萌发情况,选择三个视野计算萌发率,取平均值。

具体操作步骤:按上表中数据称取蔗糖、硼酸和氯化钙,分别搅拌溶于水中,并编号1-21。用同样的方法配制对照用的培养基并标注22。上午10点采集花粉;从19种培养液中各取300μL于干净的载玻片上,将载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中;将新鲜的野葛花粉均匀的撒在培养液上。在室温和光照条件下分别培养60分钟后记录萌发率和生长的一致性等实验结果,结果如表2所示。

表2不同配方培养液对萌发率和生长一致性的影响

由表2可知,不同培养液浓度之间的结果差异较大,随着蔗糖浓度的升高,花粉萌发率也随之升高,花粉管生长一致性由低变高,然而受硼酸浓度增大的影响,花粉萌发率先增加后减小,当硼酸浓度>0.1%时,花粉萌发率明显降低,另外,在蔗糖和硼酸浓度一定的条件下,随着氯化钙浓度的升高,花粉萌发率先增加后减小,同样当氯化钙浓度>0.1%时,花粉萌发率明显降低,花粉管生长的一致性呈现出由中变高再变低的趋势。同时由上表可知,在对照培养基中野葛花粉完全不能萌发,说明花粉基本培养基不适用于野葛花粉的培养。

(1)不同培养温度对野葛花粉活力测定的影响

按照上面的试验方法,取三组14号培养液,将采集的花粉均匀的撒在培养液上,分别放在自然光条件下的4℃、15℃、25℃和35℃的条件下培养45分钟后观察实验结果。结果见表3。

表3不同培养温度对野葛花粉活力测定的影响

由表3可以看出,在4℃时花粉基本没有萌发,升高10℃左右后,萌发率达到35%,花粉管生长一致性为中等,当温度达到室温时,萌发率最高,达到79%,花粉管生长一致性也最高,当温度达到35℃较高温时,萌发率降低到12%,花粉管生长一致性也较低,可见此温度不适合花粉活力的测定。

(2)不同光照条件对野葛花粉活力测定的影响。

取三组14号培养液,将采集的花粉均匀的撒在培养液上,分别放在室温下的强光、自然光和黑暗条件下培养45分钟后观察实验结果。结果见表4。

表4不同光照条件对野葛花粉活力测定的影响

由表4可知,在强光条件下,花粉基本没有萌发,在自然光和黑暗条件下,花粉萌发率均达到80%左右,花粉管生长一致性也最高,无明显差别。

(3)不同培养时间对野葛花粉活力测定的影响

取三组14号培养液,将采集的花粉均匀的撒在培养液上,分别放在室温下的自然光条件下培养15、30、45、60、90分钟后观察实验结果。结果见表5。

由表5可知,在培养15分钟后,花粉开始萌发,但萌发率较低,花粉管生长一致性也不高,在培养30-60分钟期间,花粉萌发率平均达到77%左右,花粉管生长一致性也最高,此时适合花粉活力的测定,随着培养时间的延长,到90分钟时,花粉萌发率降到32%左右,花粉管生长一致性也降为中等,开始不适合花粉活力的测定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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