一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型的建立方法与流程

文档序号:11072007阅读:1348来源:国知局
一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型的建立方法与制造工艺

本发明属于生物技术领域,涉及一种小鼠cGVHD模型的建立方法。



背景技术:

异基因造血干细胞移植已成为各类血液肿瘤的重要治疗策略,但移植后的主要并发症——慢性移植物抗宿主病成为制约其疗效的主要原因,不仅严重影响患者的生存质量,也是死亡的主要原因,亟需探索慢性移植物抗宿主病的发病机制和防治策略。C5a是补体系统活化产物中的主要强效介质,介导机体重要炎症反应,在增强机体防御功能的同时也可导致严重的免疫炎症损伤。研究已经发现C5a在急性肺损伤、脓毒血症、脑膜炎、类风湿性关节炎和肾小球肾炎等疾病的发生过程中起着重要作用。最新的研究也发现C5a参与急性移植物抗宿主病的病理损伤:全身照射小鼠后,补体表达上调,促进T细胞活化扩增;体内过表达C3aR和C5aR也将促进T细胞活化扩增,加重aGVHD的病理损伤;并且补体衰变加速因子DAF缺失小鼠的aGVHD的病理损伤更为严重。而目前尚未有研究深入探索C5a-C5aR补体途径在cGVHD疾病过程中的致病机理。为明确C5a-C5aR补体途径介导cGVHD疾病的病理机制,并以该途径分子为靶点开展C5a-C5aR补体途径药物研究、细胞靶向治疗等研究,我们在国内外首次建立C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型。该模型的建立,不仅是相关基础研究的重要基础,还为开展疾病防治药物研发等研究奠定基础,具有重要的实际意义。



技术实现要素:

本发明的目的是提供一种C5aR基因敲除小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法。

为了实现以上目的,本发明采用了以下技术方案:

一种C5aR基因敲除小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法,通过以下步骤实现:

(1)以高龄B10.D2(Hc1 H2d H2-T18c)雄性小鼠作为供鼠;

(2)以高龄C5aR-/-(C.129S4(B6)-C5ar1tm1Cge/J)雌性小鼠作为受鼠;

(3)受鼠接受直线加速器全身照射(TBI)预处理后,将获自供鼠的骨髓细胞(BMC)悬液及脾细胞(SpC)悬液注射至受鼠。

优选地,所述供鼠及受鼠均采用16周龄小鼠。

具体地来说,所述步骤(3)中,供鼠BMC悬液的制备如下:以颈椎脱臼法处死供鼠后,放入75%乙醇中浸泡3~5min,无菌剥离股骨和胫骨,用RPMI 1640培养液冲洗骨髓腔,收集含有骨髓的液制成单细胞悬液,过滤后用红细胞裂解液破除红细胞,RPMI 1640洗涤3-4次,计数并用RPMI 1640重悬细胞,调整至4×10^7/0.15mL细胞浓度备用。

具体地来说,所述步骤(3)中,供鼠SpC悬液的制备如下:以颈椎脱臼法处死供鼠后,放入75%乙醇中浸泡3~5min,无菌取出脾脏,去除脾脏周围系膜组织,移入平皿内用RPMI 1640培养液洗涤若干次,碾磨,收集细胞冲洗液制成单细胞悬液,过滤后用红细胞裂解液破除红细胞,用RPMI1640洗涤3-4次,计数并用RPMI 1640重悬细胞,调整至4×10^6/0.15mL细胞浓度备用。

具体地来说,所述步骤(3)中,移植当日受鼠接受直线加速器30x30照射野,680cGy,698跳,源皮距为100cm,单次全身照射预处理,照射后立即补充饮水,休息4~6小时后经尾静脉注射终体积为0.3mL的由0.15mL BMC悬液和0.15mLSpC悬液组成的注射液。

优选地,所述步骤(3)中,注射给受鼠的BMC悬液的用量为4×10^7BMC,SpC悬液的用量为4×10^6。

以往认为移植细胞包括骨髓细胞和脾细胞,仅给予骨髓细胞,小鼠不会发生cGVHD,当移植脾细胞大于10^7个时,方可造成典型cGVHD的症象。而且以往的建模的成功率,累及的器官范围较窄。本发明通过应用移植主要组织相容性抗原(MHC)相合、次要组织相容性抗原(miHA)不合的异基因高龄B10.D2雄性小鼠的骨髓细胞及脾脏细胞,移植给直线加速器精准辐照后的高龄C5aR-/-(C.129S4(B6)-C5ar1tm1Cge/J)雌性小鼠,并不同于以主的报道,减少脾细胞的移植数量、提高骨髓细胞的移植数量,建立一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型。其具有如下特点:(1)该模型具有模拟临床上异基因造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病的特点;(2)该模型累及的病量器官多、典型;(3)该模型组织中缺乏C5aR基因,是验证C5a-C5aR补体途径与cGVHD疾病的相关性的关键性工具;(4)建模型效率高,重复性好;(5)移植后小鼠存活时间长,更接近人类cGVHD的病征表现,为在活体动物内进行防治人类cGVHD的研究提供新的实验平台。

附图说明

图1是D组cGVHD实验组小鼠的临床评分图(图例中每个时间点的评分以均数±标准差表示,n=5)

图2是D组cGVHD实验组小鼠临床表现,A显示尾巴、脚趾结痂;B显示脱毛;C显示弓背及耳内结痂;

图3是D组cGVHD实验组小鼠移植后+60d染色体图;

图4是D组cGVHD实验组小鼠+60d处死后分离的肺、皮肤、肝脏和肠道的病理活检HE染色图。

具体实施方式

本发明结合附图和和实施例作进一步的说明。本实验所用小鼠均购自The Jackson Laboratory,在广州市中山大学实验动物中心进行饲养。

实施例一

本例为本发明的C5aR基因敲除小鼠异基因骨髓移植后慢性移植物抗宿主病模型的建立例,按以下步骤操作:

一、供鼠准备

选用无特定病原体(Specefic pathogen Free,SPF)级B10.D2(Hc1 H2d H2-T18c)雄性,饲养至16周龄,作为供鼠备用。

二、受鼠准备

SPF级C5aR-/-(C.129S4(B6)-C5ar1tm1Cge/J),雌性,16周龄,作为受鼠。将受鼠随机分为4组,每组5只;其中,

A、正常对照组:同步饲养,无干预;

B、放射对照组:TBI+RPMI 1640,即对组内小鼠进行全身照射(TBI)处理,经尾静脉注射PRMI1640培养液;

C、移植对照组:TBI+4×10^7BMC,即对组内小鼠进行全身照射(TBI)处理,经尾静脉注射经PRMI1640培养液处理的骨髓细胞BMC悬液;

D、cGVHD组:TBI+4×10^7BMC+4×10^6SpC,即对组内小鼠进行全身照射(TBI)处理,经尾静脉注射经PRMI1640培养液处理的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液。

三、根据以上分组,采用下述步骤进行移植实验操作

1、异基因骨髓移植前一周对各组受鼠在层流动物房内接受添加抗生素(红霉素250mg/L,庆大霉素32万U/L)的灭菌饮水进行肠道准备,并维持至移植后3周。

2、移植当日(0d),对B、C、D组受鼠接受移植当日受鼠接受直线加速器30x30照射野,680cGy,698跳,源皮距为100cm,单次全身照射预处理,照射后立即补充饮水,休息4~6小时后经尾静脉注射终体积为0.3mL的移植细胞悬液。

对照组B组小鼠中每只从尾静脉输注RPMI 1640培养液0.3mL;

对照组C组小鼠中每只从尾静脉输注RPMI 1640细胞悬液0.3mL,包括4×10^7BMC;

D组小鼠中每只从尾静脉输注RPMI 1640细胞悬液0.3mL,包括4×10^7BMC和4×10^6SpC。

其中,骨髓细胞(BMC)悬液制备操作如下:采用颈椎脱臼法处死供鼠,立即放入75%乙醇中浸泡3~5min;超净工作台中无菌剥离股骨和胫骨,用RPMI 1640培养液冲洗骨髓腔,收集含有骨髓的冲洗液通过4号针头制成单细胞悬液,过滤,用红细胞裂解液破除红细胞,RPMI 1640洗涤3次,计数并用RPMI 1640重悬细胞,调整至4×10^7/0.15mL细胞浓度备用。

脾细胞(SpC)悬液制备操作如下:无菌取出脾脏,小心去除脾脏周围系膜组织,移入平皿内用RPMI 1640培养液洗涤3遍,然后置于200目不锈钢筛网中用2mL注射器内芯轻轻碾磨,收集细胞冲洗液通过4号针头制成单细胞悬液,过滤,用红细胞裂解液破除红细胞,用RPMI1640洗涤3次,计数并用RPMI 1640重悬细胞,调整至4×10^7/0.15mL细胞浓度备用。

移植后每天观察小鼠一般状态,包括体重、皮疹、脱毛、结痂、弓背、腹泻等,移植14天后每3天进行一次临床评分,标准参见表1;濒死小鼠处死取材,其存活时间记至处死次日;实验终点为移植后+60情况。计数方法:断尾取血10μL,加入190μL白细胞稀释液中混匀,然后滴加到细胞计数板上,水平静置1min后计数4个大方格中细胞数(N),WBC=(N÷20)×10^9/L。

移植观察记录表明:A组小鼠正常存活至实验终点;B组小鼠中位存活12.0天,15天内全部死亡;C组小鼠仅输注骨髓细胞,跟既往文献报导一致未出现移植物抗宿主病,并长期存活;D组小鼠出现典型的慢性移植物抗宿主病表现(肺、皮肤、胃肠道、肝脏),并存活至实验终点。以上记录表明D组均移植成功,且存活时间达到60天以上,比现有的类似疾病动物模型建立的存活时间长。

实施例2

本例为小鼠异基因骨髓植入检测例。

取移植后+60天的受鼠进行检测,按以下步骤进行:

1、秋水仙素处理:在做实验前3~4小时,向小鼠腹腔注射0.1%的秋水仙素(2-4μg/g)。

2、取股骨:实验时,用颈椎脱臼法迅速将小鼠处死,立即用剪刀剪去后肢的皮肤和肌肉,连同关节一起取下两侧股骨,剔净其上肌肉。

3、取骨髓细胞:用注射器吸取6ml生理盐水,将注射器针头插入骨髓腔的一端,用生理盐水冲出骨髓细胞至离心管,反复冲洗直至骨腔变白。将收集到的骨髓细胞溶液平衡后放入离心机,以1000r/min离心10min,吸去上清液。

4、低渗:根据细胞量多少,加入0.075mol/L KCl低渗液5-6ml,用吸管轻轻吹打混匀,在37℃恒温水浴箱内低渗20-30分钟。

5、预固定:低渗完毕,立即加1-2ml新配制的Carnoy固定液,轻轻吹打之后,以2000r/min离心10min,小心吸管吸去上清液。

6、固定:沿离心管壁缓慢加入固定液7ml,用吸管吹打成细胞悬液。2000rpm的速度离心10分钟,倾去上清。

7、再固定:重复步骤6的操作至上清基本无色清晰。

8、制备细胞悬液:沉淀物中加入适量固定液,用吸管轻轻吹打成细胞悬液。

9、滴冰片:从冰箱里取出预冷的载玻片,手持吸管在载玻片上方约10cm处向下滴片,2-3滴,使悬液均匀扩散与玻片之上,多余的液体可小心倾去。

10、干燥、火焰固定:玻片于酒精灯外焰迅速来回几下。

11、玻片老化:置于37℃温箱1-2天后,于65℃烤箱中24h。

12、染色:低浓度胰酶消化,清水洗净,Giemsa染液室温下染色10分钟左右。清水冲洗,在室温下自然干燥。

13、镜检:先用低倍镜找到一好的分裂相区域,然后转用高倍镜观察。

如图3所示,D组(cGVHD组)小鼠的染色体图,箭头所示为Y染色体。图中染色体的改变也进一步表明D组小鼠移植成功。

实施例3

本例为cGVHD组小鼠的临床及病理检测例。

一、对D组小鼠进行慢性GVHD的临床评分,其评分标准如表1所示:

表1慢性GVHD的临床评分标准

注:(a)耳朵、尾巴、脚掌每处脱皮或结痂记0.3分,皮肤临床表现最低得0分,最高得3.9分。(b)皮肤得分超过0.6分视为发生GVHD;即使症状消退、小鼠自然死亡或人为因素造成死亡也视为发生GVHD;小鼠无症状死亡视为无GVHD。

生存情况观察至少+60d。濒死小鼠处死取材,其存活时间记至处死次日。

图1为D组小鼠的临床评分示意图。(图例中每个时间点的评分以均数±标准差表示,n=5)

图2为D组小鼠的临床表现,A显示尾巴、脚趾结痂;B显示脱毛;C显示弓背及耳内结痂。

二、对+60d的D组小鼠进行慢性GVHD的病理检测,病理评分标准如下表2所示:

表2慢性GVHD的病理评分标准

注:得分超过2视为发生GVHD。

取移植后+60d的D组受鼠处死后进行检测,按以下步骤进行:

1、固定:取各脏器组织切成小块,10%中性福尔马林溶液内固定24小时;

2、以下程序在Shandon全自动密闭脱水机中完成:

2.1把固定好的组织标本分别在80%乙醇50min,90%乙醇50min,95%乙醇ⅠⅡ各40min,100%乙醇ⅠⅡ各40min;

2.2将脱水后标本分别在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、III中放置30min;

2.3低熔点石蜡Ⅰ、Ⅱ、III中放置各25min(温度设置为62摄氏度);

2.4高熔点石蜡Ⅰ缸25min(温度设置为64摄氏度);

3、组织处理程序结束后,取出标本,置于包埋机的蜡槽中,进行包埋(温度设置为62摄氏度);

4、切片:在切片机上切下4μm切片,漂在干净的水面上,在50-57摄氏度温水中展开,再将组织切片捞起;在70摄氏度烤箱中烘烤15-20min;

5、从烤箱中取出切片,室温稍冷却,将切片放到染色机上进行全自动HE染色,染色程序如下:二甲苯Ⅰ、Ⅱ、III中放置各7min,100%乙醇ⅠⅡ、95%乙醇ⅠⅡ、80%乙醇、蒸馏水各1min;。苏木精染液中15分钟,水洗,0.5%盐酸酒精10s;2%碳酸锂水溶液1min;流水冲洗10min,80%乙醇、95%乙醇ⅠⅡ,80%乙醇,100%乙醇ⅠⅡIII、二甲苯Ⅰ、Ⅱ各1min;

6、取出切片,将切片挂上Shandon封片机进行封片。

7、光学显微镜下观察HE染色组织切片,病理结果描述:光学显微镜下观察HE染色组织切片发现小鼠肺脏表现为阻塞性细支气管炎,细支气管内大量炎性细胞浸润,阻塞细支气管,管壁平滑肌破坏,肺泡结构破坏,肺组织实变;皮肤溃疡,真皮层胶原沉积,炎症细胞浸润,皮下脂肪严重萎缩;肝脏门管区炎性细胞浸润;胃肠道局部炎性细胞浸润;图4显示C5aR-/-cGVHD小鼠+60d处死后分离的肺、皮肤、肝脏和肠道的病理活检HE染色图。

结果显示:C5aR-/-cGVHD小鼠肺部阻塞性细支气管炎,细支气管内大量炎性细胞浸润,管壁平滑肌破坏,肺泡结构破坏(×100,×200);皮肤真皮层胶原沉积,炎性细胞浸润,脂肪严重萎缩(×100,×200);肝脏炎性细胞浸润(×100,×200);胃肠道局部炎性细胞浸润(×100,×200)。

检测结果表明,C5aR-/-cGVHD实验组小鼠在皮肤、肝脏、肺部和肠道均表现出cGVHD症状,与人类异基因移植后所表现的cGVHD症状非常相似。

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