本发明属于兰科植物组织培养灭菌技术领域，具体涉及一种兰科植物微量种子灭菌及接种方法，适用于离体保存过程中微量兰科植物种子的灭菌及接种。
背景技术：
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兰科(Orchidaceae)的许多物种在观赏、药用及生态保护等方面都有较高的价值，在人们生活和生产过程中发挥了重要作用。由于人为采挖、气候变化等因素其野生资源日益减少、赖以生存的环境不断遭受破坏。同时，兰科植物的种子细如粉尘，在自然环境下很难萌发，种群的维持和更新困难。我国的所有兰科物种都已被列入《中国物种红色名录》，全世界所有的野生兰科植物均被列为《野生动植物濒危物种国际贸易公约》(CITES)的保护范围，对野生兰科植物开展迁地保护研究迫在眉睫。采用组织培养技术对兰科植物进行离体保存研究是保护兰科物种的有效手段。在整个离体保存操作过程中，种子的无菌处理成功与否非常关键。现有技术通常是用纱布或滤纸等包裹种子在次氯酸钠或氯化汞溶液中进行消毒，或种子先消毒再过滤等方法，整个操作流程存在灭菌不充分、操作不方便、易污染等情况。特别地，野外能获得的单个物种的种子数量通常有限(果荚开裂，残留的种子很少)，采回的果荚在接种前也易开裂，而且在多个物种同时接种时极易发生混种。采用现有方法均难以对上述材料顺利实现灭菌和接种要求。
技术实现要素：
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本发明的目的在于针对现有技术存在了上述不足之处，借助当前普遍可得的DNA纯化柱(包含吸附柱和收集管)对野外获取的少量的野生兰科种子进行灭菌和接种，使仅用微量种子也能为野生兰科植物的离体保存提供无菌种源。该方法将对兰科植物种质资源的开发、利用和保护提供重要的技术支持。
为实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案：
一种兰科植物微量种子的灭菌及接种方法，将DNA纯化柱、200μl，1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20-30min备用，用对折过的硫酸纸收集适量开裂的兰科种子，简单的去除果荚碎片杂质后，沿着折痕将种子倒入已灭菌的吸附柱中，然后把吸附柱放入收集管，并将吸附柱做好标记，在无菌条件下，向吸附柱中加入600μl的75％乙醇，倒立纯化柱1-2次，之后200-1000rpm离心20s，从加乙醇开始，直到完成离心，整个操作过程控制在28s-35s；倒弃收集管中废液，向吸附柱中加入600μl无菌水，反复吸打无菌水使种子悬浮，充分漂洗种子，然后200-1000rpm离心20s，洗脱75％乙醇溶液；倒弃收集管中废液，在无菌条件下向吸附柱中加入600μl的0.1-0.2％氯化汞溶液灭菌4-6min或2％次氯酸钠溶液消毒6-10min，期间反复吸打溶液使种子悬浮充分灭菌，然后200-1000rpm离心20s；倒弃收集管中废液，再向吸附柱中加入600μl无菌水，反复吸打无菌水使种子悬浮，充分漂洗种子，然后200-1000rpm离心20s，此操作重复3-4次，使消毒液彻底洗脱；再向离心之后的吸附柱中添加600μl无菌水，改用量程为200μl的枪头反复吸打无菌水获得种子悬浊液；另吸取50-300μl不等体积的种子悬浊液到培养基上，实现接种。
如所述的一种兰科植物微量种子的灭菌及接种方法，其中DNA纯化柱为规格为1ml吸附柱，2ml收集管。
如所述的一种兰科植物微量种子的灭菌及接种方法，其中所述的改用量程为200μl的枪头灭菌前将枪头前部长1.5cm的部分剪去，避免枪头口径过小造成种子堵塞枪头。
如所述的一种兰科植物微量种子的灭菌及接种方法，其中所述的改用量程为200μl的枪头反复吸打无菌水获得种子悬浊液，进一步吸取50μl种子悬浊液到载玻片上，在体视镜镜下统计种子量，便于计算后期种子萌发率。
如所述的一种兰科植物微量种子的灭菌及接种方法，包括如下步骤：
步骤1：把规格为吸附柱1ml，收集管2ml的DNA纯化柱、200μl和1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20-30min备用；
步骤2：用对折过的硫酸纸收集适量开裂的鼓槌石斛种子，去除果荚碎片等杂质后，沿着折痕将种子倒入已灭菌的吸附柱中，盖好盖子。把吸附柱放入收集管，在吸附柱上做好标记，然后置于离心管架上；
步骤3：在无菌操作台上，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 75％乙醇，盖好盖子消毒30s，期间倒立1-2次纯化柱，整体，在种子消毒的同时，吸附柱内部也得到灭菌，加乙醇，倒立纯化柱，上离心机都在消毒30s之内完成，然后600-800rpm离心20s；
步骤4：取出吸附柱，倒弃收集管中废液，吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 0.2％氯化汞灭菌4-6min，反复吸打溶液使种子悬浮得到充分灭菌，然后600-800rpm离心20s；
步骤5：取出吸附柱，倒弃收集管中废液。吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，此时吸附柱及种子已经过乙醇、氯化汞消毒处于无菌状态，用1ml移液枪加入600μl无菌水，反复吸打无菌水使种子悬浮，充分漂洗种子，然后600-800rpm离心20s；
步骤6：重复步骤5，3-4次；
步骤7：用1ml移液枪取600μl无菌水加入吸附柱中，然后用200μl的移液枪反复吸打使之呈种子悬浊液，吸取50μl种子悬浊液到载玻片上，在体视镜下统计种子量，以便于计算后期种子萌发率；另吸取100μl的种子悬浊液接种到培养基上；
步骤8：把培养基移到温度25±2℃暗培养3-5天，后光照培养一周，种子萌发。
如所述的一种兰科植物微量种子的灭菌及接种方法，包括如下步骤：
步骤1：把规格为吸附柱1ml，收集管2ml的DNA纯化柱、200μl和1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20-30min备用；
步骤2：用对折过的硫酸纸收集适量开裂的虎头兰种子，去除果荚碎片等杂质后，沿着折痕将种子倒入已灭菌的吸附柱中，盖好盖子。把吸附柱放入收集管，在吸附柱上做好标记，然后置于离心管架上；
步骤3：在无菌操作台上，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 75％乙醇，盖好盖子消毒30s，期间倒立1-2次纯化柱，整体，在种子消毒的同时，吸附柱内部也得到灭菌，加乙醇，倒立纯化柱，上离心机都在消毒30s之内完成，然后200-300rpm离心20s；
步骤4：取出吸附柱，倒弃收集管中废液。吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 0.2％氯化汞灭菌4-6min，反复吸打溶液使种子悬浮得到充分灭菌，然后200-300rpm离心20s；
步骤5：取出吸附柱，倒弃收集管中废液。吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，此时吸附柱及种子已经过乙醇、氯化汞消毒处于无菌状态，用1ml移液枪加入600μl无菌水，反复吸打无菌水使种子悬浮，充分漂洗种子，然后200-300rpm离心20s；
步骤6：重复步骤5，3-4次；
步骤7：用1ml移液枪取600μl无菌水加入吸附柱中，然后用枪头前部长约1.5cm的部分被剪去的200μl的移液枪，反复吸打使之呈种子悬浊液，吸取50μl种子悬浊液到载玻片上，在体视镜下统计种子量，以便于计算后期种子萌发率，吸取150μl种子悬浊液接到培养基上；
步骤8：把培养物移到温度23±2℃暗培养一周后，再移至光照条件下培养一个月后种子膨大开始萌发。
本发明还提供了一种兰科植物微量种子的灭菌及接种方法用于离体保存过程中微量兰科植物种子的灭菌及接种的方法。
与现有技术相比，本发明结合组织培养技术的灭菌方法和DNA纯化柱等工具，设计了一套特别适用于果荚开裂、细小且微量的兰科植物种子的灭菌和接种方法。该技术克服了兰科植物种子在消毒过程中易出现的灭菌不充分、混种及消毒液残留的问题，能高效地进行微量的兰科植物种子的消毒和接种，有效降低污染率，具有实验器材易得、节约材料、成本低廉、操作方便、接种效率高等优点。可针对微量、细小的兰科种子进行批量高效灭菌、彻底去除消毒液残留等问题。当接种的种子量较多时，也可分装多个或改用更大体积的纯化柱达成目的。
具体实施方式：
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
1、材料：鼓槌石斛DendrobiumchrysotoxumLindley，种子大小约为0.43×0.10mm。
2、实验器材：超净台、离心机、离心管架、DNA纯化柱、移液枪、200μl和1ml枪头、灭菌锅、体视镜、载玻片；
3、操作过程：
步骤1：把DNA纯化柱(规格：吸附柱1ml，收集管2ml)、200μl和1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20-30min备用；
步骤2：用对折过的硫酸纸收集适量开裂的鼓槌石斛种子，简单的去除果荚碎片等杂质后沿着折痕将种子倒入已灭菌的吸附柱中，盖好盖子。把吸附柱放入收集管，在吸附柱上做好标记，然后置于离心管架上。
步骤3：在无菌操作台上，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 75％乙醇，盖好盖子消毒30s，期间倒立1-2次纯化柱(整体)，在种子消毒的同时，吸附柱内部也得到灭菌。加乙醇，倒立纯化柱，上离心机都在消毒30s之内完成，然后600-800rpm离心20s。
步骤4：取出吸附柱，倒弃收集管中废液。吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 0.2％氯化汞灭菌4-6min，反复吸打溶液使种子悬浮得到充分灭菌，然后600-800rpm离心20s。
步骤5：取出吸附柱，倒弃收集管中废液。吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，此时吸附柱及种子已经过乙醇、氯化汞消毒处于无菌状态。用1ml移液枪加入600μl无菌水，反复吸打无菌水使种子悬浮，充分漂洗种子，然后600-800rpm离心20s。
步骤6：重复步骤5，3-4次。
步骤7：用1ml移液枪取600μl无菌水加入吸附柱中，然后用200μl的移液枪反复吸打使之呈种子悬浊液，吸取50μl种子悬浊液到载玻片上，在体视镜下统计种子量，以便于计算后期种子萌发率；另吸取100μl的种子悬浊液接种到培养基上。
步骤8：把培养基移到温度25±2℃暗培养3-5天，后光照培养一周，即可观察到种子萌发。
实施例2：
1、材料：虎头兰Cymbidium hookerianum H.G.Reichenbach，种子大小约为1.57×0.27mm。
2、实验器材：超净台、离心机、离心管架、DNA纯化柱、移液枪、200μl和1ml枪头、灭菌锅、体视镜、载玻片；
3、操作过程：
步骤1：把DNA纯化柱(规格：吸附柱1ml，收集管2ml)、200μl和1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20-30min备用；
步骤2：用对折过的硫酸纸收集适量开裂的虎头兰种子，简单的去除果荚碎片等杂质后沿着折痕将种子倒入已灭菌的吸附柱中，盖好盖子。把吸附柱放入收集管，在吸附柱上做好标记，然后置于离心管架上。
步骤3：在无菌操作台上，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 75％乙醇，盖好盖子消毒30s，期间倒立1-2次纯化柱(整体)，在种子消毒的同时，吸附柱内部也得到灭菌。加乙醇，倒立纯化柱，上离心机都在消毒30s之内完成，然后200-300rpm离心20s。
步骤4：取出吸附柱，倒弃收集管中废液。吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 0.2％氯化汞灭菌4-6min，反复吸打溶液使种子悬浮得到充分灭菌，然后200-300rpm离心20s。
步骤5：取出吸附柱，倒弃收集管中废液。吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，此时吸附柱及种子已经过乙醇、氯化汞消毒处于无菌状态。用1ml移液枪加入600μl无菌水，反复吸打无菌水使种子悬浮，充分漂洗种子，然后200-300rpm离心20s。
步骤6：重复步骤5，3-4次。
步骤7：用1ml移液枪取600μl无菌水加入吸附柱中，然后用枪头前部长约1.5cm的部分被剪去的200μl的移液枪(虎头兰种子会造成200μl枪头堵塞)反复吸打使之呈种子悬浊液，吸取50μl种子悬浊液到载玻片上，在体视镜下统计种子量，以便于计算后期种子萌发率。吸取150μl种子悬浊液接到培养基上。
步骤8：把培养物移到温度23±2℃暗培养一周后，再移至光照条件下培养一个月后种子膨大开始萌发。