本发明属于人工诱导中华鲟单性生殖领域，特别是涉及一种遗传灭活的中华鲟同源精子诱导中华鲟卵子进行雌核发育的方法。
背景技术：
：中华鲟是我国特有的一种古老的大型鱼类，体型大、生长快、肉质好，尤其其鱼籽大是鲟鱼中的珍品。中华鲟属于国家一级保护动物，在2010年被世界自然保护联盟(IUCN)列入极度濒危保护物种。中华鲟属于典型的两性生殖鱼类，也就是自然状态下需要成熟的雌鱼和雄鱼才能繁殖。中华鲟的性成熟时间长，雄性至少需要8-10年以上，雌性至少需要12-14年以上时间。中华鲟的性别比例为1:1，且无第二性征，在早期无法辨别性别。在中华鲟繁殖保护上希望养殖中尽可能多为雌鱼以便于快速生产更多的放流苗种，迅速恢复野外种群，以最小的投入产生最大的保护效益。而正常的两性生殖的方式无法繁殖出较高比例的雌性苗种。雌核发育是一种单性生殖方式，就是仅仅依靠卵子的遗传物质发育成为后代的生殖方式。目前自然界中有一部分鱼存在自发雌核发育的情况，例如分布于我国黑龙江的方正银鲫在繁殖季节会借助鲤鱼精子刺激进行雌核发育繁殖，然而其它多数两性生殖的鱼类很难进行大规模的自发雌核发育研究，但可以通过人工诱导的方式进行单性生殖。目前人工诱导雌核发育是快速生产单性苗种(例如全雌性或多数雌性苗种的一种方式)、快速产生高度纯系子代、进行极度濒危物种保护的一种方式。在俄罗斯鲟、高首鲟、闪光鲟、密西西比铲鲟、欧洲鳇、小体鲟、西伯利亚鲟、匙吻鲟、杂交鲟等鲟鱼的人工诱导雌核发育已有报道，尚没有关利用中华鲟精子诱导中华鲟雌核发育研究进行报道。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种利用遗传灭活的中华鲟精子诱导中华鲟卵子进行单雌性繁殖的方法，由本发明技术成功培育出了中华鲟雌核发育苗种。该技术可以快速生产高度纯合的中华鲟苗种，为进一步揭示中华鲟性别决定机制、生产单雌性苗种及为中华鲟全基因测序研究和进一步探索单性生殖保护技术具有重要的意义。本发明技术方案如下：(1)中华鲟精子遗传物质的灭活：采集中华鲟精子，选取活力在80％以上的中华鲟精子与精子稀释液混合，于0-2℃预冷的培养皿中，进行紫外线灭活；(2)中华鲟卵子采集及与中华鲟灭活精子授精：选择成熟的中华鲟雌鱼，水温18-19.5℃，人工注射LHRH-A2催产，在效应时间来临时采用腹部挤压的方法采集卵子，用所述步骤(1)灭活后精子进行授精，精子洒在卵上进行卵受精，加入养殖用水摇匀，再加水洗涤，放入含有滑石粉养殖用水的脱粘瓶中进行充气脱粘处理；(3)热休克加倍处理：在步骤(2)脱粘处理一段时间后，进行热休克处理；(4)雌核发育卵的培育：步骤(3)结束后的卵继续脱粘，脱粘结束后放入喷淋式孵化筛进行孵化培育；(5)雌核苗的分子鉴定：利用微卫星DNA标记筛选的方法，筛选使用灭活精子的亲鱼特异等位基因的微卫星位点，不少于两对；完成同源精子诱导中华鲟雌核的发育。优选地，所述步骤(1)精子紫外遗传灭活是在0-2℃低温环境下操作，经稀释后的中华鲟精液放置于在冰上预冷培养皿中，厚度≤1mm。进一步优选地，：所述精子稀释有两种方式，一种方式是利用中华鲟精液经过3000-5000g离心力离心3-5分钟的上清液作为精子稀释液进行中华鲟精子稀释，中华鲟精子与上清液的体积比为1:2-1:5；另一种方式是配置与中华鲟精子等渗透压的稀释液进行稀释，中华鲟精子与等渗透压稀释液的体积比为1:2～1:4，所述等渗透压的稀释液为：蔗糖20-100mmol/L，20mmol/LTris-HCl，KCl1-2mmol/L，pH8.5。优选地，所述步骤(2)采集后的卵子暂放在干燥光滑的盆子中用湿毛巾覆盖保持湿度，在18-19.5℃暂时保存。优选地，所述步骤(1)紫外线灭活方法为将培养皿置于铺有碎冰的摇床上，震荡频率为60-90rpm，在无菌操作台的紫外灯照射度为335.6μw/cm2，照射时间7-8分钟时间，紫外灯功率为20W，波长为254nm。优选地，所述步骤(2)授精方法为以1mL配比500-1000粒卵的比例，洒在卵上，之后加入1倍卵子体积的养殖用水摇匀1分钟，之后再加一倍的水洗涤，之后放入18-19.5℃含有10％-15％的滑石粉的养殖用水悬浊液的脱粘瓶中进行充气脱粘处理。优选地，所述步骤(3)热休克加倍处理方法为，受精卵在水温18℃脱粘处理17.5-18.9分钟(中华鲟在18℃的卵裂时间τ为70min，脱粘处理＝0.25τ-0.27τ＝17.5-18.9分钟)后进行热休克处理，处理的温度范围在35-38℃，持续时间为2min。优选地，所述步骤(4)放入喷淋式孵化筛进行培育，孵化水温为18-19.5℃。优选地，所述方法中步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)总时间为50-70分钟。本发明技术原理：成熟的卵子具有在一定的外界刺激下(比如机械刺激、电刺激、化学刺激和遗传灭活的精子刺激)可以启动发育，进行细胞分裂和后继的发育成为成熟的个体的潜力，但是卵细胞中遗传物质为的体细胞的一半，刺激发育的卵子进行增生的后代细胞中的遗传物质DNA含量为体细胞的一半，这样发育出的个体是单倍体，单倍体会表现出个体小、畸形、发育到一定阶段致死的特征。因此还要通过一定的技术手段在卵子发育的早期进行遗传物质加倍处理，使得发育中每个细胞的DNA的含量恢复到母本体细胞的水平，这样雌核发育的后代才是正常个体。采用同源精子生产出的雌核苗种可以有效保证中华鲟物种的纯正性，避免异源精子微量遗传物质的渗入，尤其对于中华鲟全基因组测序研究具有重要的意义。本发明有益效果：1、利用本发明技术培育出的中华鲟雌鱼。可以通过后代雌雄比例判断初步判断中华鲟性别决定遗传机制是XY还是ZW型。如果是XY型，那么将产生全雌性(XX)的中华鲟苗种，进一步与遗传上雌性生理上是雄性(XX)的个体进行交配，将会生产出全雌性(XX)的中华鲟后代。该技术对于中华鲟种群的迅速扩大具有重要的意义。如果中华鲟是ZW性别决定机制决定，那么后代将会出现1：1雌性个体(WW)和雄性个体(ZZ)，这种超雌性个体与雄性个体进行交配后后代将全部是雌性后代(ZW)。2、该技术可以快速生产高度纯合的中华鲟苗种。该技术为进一步揭示中华鲟性别决定机制、生产单雌性苗种及中华鲟全基因组测序研究和进一步研究单性生殖保护技术具有重要的意义。3、紫外灭活使精子的遗传物质失去活性，以避免参与子代个体发育，又具有一定的活性保留刺激卵子发育的能力。4、滑石粉脱去受精卵表面的粘性，防止卵子粘连堆积在一起而导致受精卵缺氧窒息，并便于后期卵子发育观察和死卵的清理操作。5、热休克处理目的在于抑制受精卵的第二极体(1n)排出，从而使得雌核发育的卵子(n)后代恢复正常的体细胞倍性(2n)。热休克成功的关键主要是在于控制热休克处理的时机、温度和热处理持续时间。6、本申请方法中步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)总时间为50-70分钟，对总时间进行限定，消除受精卵相互粘性，避免受精卵粘连堆积造成卵子内部缺氧而死亡，受精卵在孵化时候更容易散开，使得每个受精卵与水充分接触，便于卵子内部与外界环境进行氧气和代谢物的交换，更有利于受精卵发育和提高存活率，也便于以后观察和死卵和发霉卵的剔除。7、采用适宜的精子稀释方式，利用精子上清液或等渗透压稀释液进行稀释，可以保证精子在处理过程中不会受到细胞膜内外渗透压不一致造成的损伤。附图说明下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：图1微卫星遗传标记鉴定结果具体实施方式下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。实施例1(1)中华鲟精子遗传物质的灭活：利用中国长江三峡集团公司中华鲟研究所培育6尾中华鲟(雌雄各3只)体重范围在60-80kg。精子活力在80％-85％。2013年12月和2014年12月分别取卵子和精子进行了雌核发育研究。紫外线照射灭活中华鲟精子的遗传物质：吸取上述中华鲟加入8ml精子稀释液，将培养皿放置在紫外中，紫外灯照射度为335.6μw/cm2，照射时间7-8分钟时间，紫外灯功率为20W，波长为254nm，照射时间梯度为0min、4min、5min、6min、7min、8min照射后进行镜检，统计精子的存活率、精子寿命、快速运动时间。精子稀释方式是配置与中华鲟精子等渗透压的稀释液进行稀释，中华鲟精子与等渗透压稀释液的体积比为1:2，所述等渗透压的稀释液为：蔗糖80mmol/L，20mmol/LTris-HCl，KCl2mmol/L，pH8.5。(2)中华鲟卵子采集及与中华鲟灭活精子授精：用所述步骤(1)灭活后精子进行授精，将灭活的精子洒在卵子上，加水后迅速摇匀，1min后，放入19℃含有15％滑石粉悬浊液的脱粘瓶中充气脱粘。(3)热休克加倍处理：在19℃水温中，在受精操作之后18分钟，在38℃热水中进行热激，持续时间2分钟；热休克处理后放回19℃的15％滑石粉悬浊液中曝气脱粘，脱粘时间为70分钟。(4)雌核发育卵的培育：步骤(3)结束后的卵继续脱粘，脱粘结束后放入喷淋式孵化筛进行孵化培育；放入孵化床孵化筛中在19℃淋水孵化，孵化筛卵拨动频次在5-8次/分钟。未经过热休克处理的雌核发育苗种出现单倍体综合征(胚孔封闭不完全，胚胎发育缓慢，脊柱弯曲，尾部上翘等异常特征)，在卵黄囊吸收完之前已经全部死亡。经过热休克处理的受精卵，孵化48小时后进行受精率统计，110小时后统计孵化率，开口期统计苗种存活率(表1)。表1紫外灭后的精子时间与诱导后产生卵子发育之间的比例关系紫外照射时间原肠中期(％)尾牙期(％)出苗(％)开口期存活率(％)4分钟73.232.362005分钟58.3329.9426.6906分钟40.3422.2223.2807分钟75.1429.7413.592.338分钟71.8238.3228.034.60分钟(对照)81.2772.3461.2652.2由表1可知，7分钟和8分钟紫外处理的精子可以将精子的遗传物质灭活，并仍保持有激发卵子发育的能力，并在38℃的热休克可以有效抑制第二极体的排出，产生正常倍性(2n)的雌核苗种。(5)雌核苗的分子鉴定：对孵化苗种剪取少量鳍条，利用微卫星DNA标记筛选的方法，筛选使用灭活精子的亲鱼特异等位基因的微卫星位点，不少于两对；遗传物种均为来自母本，子代未含父本遗传物质信息，父本精子未参与。证明为雌核发育的苗种。(6)等该苗种生长的六个月后，进行2ml血液用于中华鲟基因组survey研究。实施例2一种同源精子诱导中华鲟雌核发育的方法，所述方法包括以下步骤：(1)中华鲟精子遗传物质的灭活：采集中华鲟精子，选取活力在80％以上的中华鲟精子与精子稀释液混合，于0℃预冷的培养皿中，进行紫外线灭活；(2)中华鲟卵子采集及与中华鲟灭活精子授精：选择成熟的中华鲟雌鱼，水温18℃，人工注射LHRH-A2催产，在效应时间来临时采用腹部挤压的方法采集卵子，用所述步骤(1)灭活后精子进行授精，精子洒在卵上进行卵受精，加入养殖用水摇匀，再加水洗涤，放入含有滑石粉养殖用水的脱粘瓶中进行充气脱粘处理；(3)热休克加倍处理：在步骤(2)脱粘处理一段时间后，进行热休克处理；(4)雌核发育卵的培育：步骤(3)结束后的卵继续脱粘，脱粘结束后放入喷淋式孵化筛进行孵化培育；(5)雌核苗的分子鉴定：利用微卫星DNA标记筛选的方法，筛选使用灭活精子的亲鱼特异等位基因的微卫星位点，不少于两对；完成同源精子诱导中华鲟雌核的发育。所述步骤(1)精子紫外遗传灭活是在0-2℃低温环境下操作，经稀释后的中华鲟精液放置于在冰上预冷培养皿中，厚度≤1mm。所述精子稀释方式是利用中华鲟精液经过30000g离心力离心3分钟的上清液作为精子稀释液进行中华鲟精子稀释，中华鲟精子与上清液的体积比为1:2。所述步骤(1)紫外线灭活方法为将培养皿置于铺有碎冰的摇床上，震荡频率为60rpm，在无菌操作台的紫外灯照射度为335.6μw/cm2，照射时间7分钟时间，紫外灯功率为20W，波长为254nm。所述步骤(2)授精方法为以1mL配比500粒卵的比例，洒在卵上，之后加入1倍卵子体积的养殖用水摇匀1分钟，之后再加一倍的水洗涤，之后放入18℃含有10％的滑石粉的养殖用水悬浊液的脱粘瓶中进行充气脱粘处理。所述步骤(3)热休克加倍处理方法为，受精卵在水温18℃脱粘处理17.5分钟后进行热休克处理，处理的温度范围在35℃，持续时间为2min。所述步骤(4)放入喷淋式孵化筛进行培育，孵化水温为18℃。所述方法中步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)总时间为50分钟。实施例3一种同源精子诱导中华鲟雌核发育的方法，所述方法包括以下步骤：(1)中华鲟精子遗传物质的灭活：采集中华鲟精子，选取活力在80％以上的中华鲟精子与精子稀释液混合，于2℃预冷的培养皿中，进行紫外线灭活；(2)中华鲟卵子采集及与中华鲟灭活精子授精：选择成熟的中华鲟雌鱼，水温19.5℃，人工注射LHRH-A2催产，在效应时间来临时采用腹部挤压的方法采集卵子，用所述步骤(1)灭活后精子进行授精，精子洒在卵上进行卵受精，加入养殖用水摇匀，再加水洗涤，放入含有滑石粉养殖用水的脱粘瓶中进行充气脱粘处理；(3)热休克加倍处理：在步骤(2)脱粘处理一段时间后，进行热休克处理；(4)雌核发育卵的培育：步骤(3)结束后的卵继续脱粘，脱粘结束后放入喷淋式孵化筛进行孵化培育；(5)雌核苗的分子鉴定：利用微卫星DNA标记筛选的方法，筛选使用灭活精子的亲鱼特异等位基因的微卫星位点，不少于两对；完成同源精子诱导中华鲟雌核的发育。所述步骤(1)精子紫外遗传灭活是在0-2℃低温环境下操作，经稀释后的中华鲟精液放置于在冰上预冷培养皿中，厚度≤1mm。精子稀释方式是配置与中华鲟精子等渗透压的稀释液进行稀释，中华鲟精子与等渗透压稀释液的体积比为1:2，所述等渗透压的稀释液为：蔗糖90mmol/L，20mmol/LTris-HCl，KCl2mmol/L，pH8.5。所述步骤(1)紫外线灭活方法为将培养皿置于铺有碎冰的摇床上，震荡频率为60-90rpm，在无菌操作台的紫外灯照射度为335.6μw/cm2，照射时间7-8分钟时间，紫外灯功率为20W，波长为254nm。所述步骤(2)授精方法为以1mL配比1000粒卵的比例，洒在卵上，之后加入1倍卵子体积的养殖用水摇匀1分钟，之后再加一倍的水洗涤，之后放入19.5℃含有15％的滑石粉的养殖用水悬浊液的脱粘瓶中进行充气脱粘处理。所述步骤(3)热休克加倍处理方法为，受精卵在水温18℃脱粘处理18.9分钟后进行热休克处理，处理的温度范围在38℃，持续时间为2min。所述步骤(4)放入喷淋式孵化筛进行培育，孵化水温为19.5℃。所述方法中步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)总时间为70分钟。实施例4一种同源精子诱导中华鲟雌核发育的方法，所述方法包括以下步骤：(1)中华鲟精子遗传物质的灭活：采集中华鲟精子，选取活力在80％以上的中华鲟精子与精子稀释液混合，于0-2℃预冷的培养皿中，进行紫外线灭活；(2)中华鲟卵子采集及与中华鲟灭活精子授精：选择成熟的中华鲟雌鱼，水温18.5℃，人工注射LHRH-A2催产，在效应时间来临时采用腹部挤压的方法采集卵子，用所述步骤(1)灭活后精子进行授精，精子洒在卵上进行卵受精，加入养殖用水摇匀，再加水洗涤，放入含有滑石粉养殖用水的脱粘瓶中进行充气脱粘处理；(3)热休克加倍处理：在步骤(2)脱粘处理一段时间后，进行热休克处理；(4)雌核发育卵的培育：步骤(3)结束后的卵继续脱粘，脱粘结束后放入喷淋式孵化筛进行孵化培育；(5)雌核苗的分子鉴定：利用微卫星DNA标记筛选的方法，筛选使用灭活精子的亲鱼特异等位基因的微卫星位点，不少于两对；完成同源精子诱导中华鲟雌核的发育。所述步骤(1)精子紫外遗传灭活是在0-2℃低温环境下操作，经稀释后的中华鲟精液放置于在冰上预冷培养皿中，厚度≤1mm。精子稀释方式是配置与中华鲟精子等渗透压的稀释液进行稀释，中华鲟精子与等渗透压稀释液的体积比为1:2，所述等渗透压的稀释液为：蔗糖95mmol/L，20mmol/LTris-HCl，KCl2mmol/L，pH8.5。所述步骤(1)紫外线灭活方法为将培养皿置于铺有碎冰的摇床上，震荡频率为80rpm，在无菌操作台的紫外灯照射度为335.6μw/cm2，照射时间7-8分钟时间，紫外灯功率为20W，波长为254nm。所述步骤(2)授精方法为以1mL配比800粒卵的比例，洒在卵上，之后加入1倍卵子体积的养殖用水摇匀1分钟，之后再加一倍的水洗涤，之后放入19℃含有13％的滑石粉的养殖用水悬浊液的脱粘瓶中进行充气脱粘处理。所述步骤(3)热休克加倍处理方法为，受精卵在水温18℃脱粘处理18分钟后进行热休克处理，处理的温度范围在37℃，持续时间为2min。所述步骤(4)放入喷淋式孵化筛进行培育，孵化水温为18.5℃。所述方法中步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)总时间为60分钟。实施例5一种同源精子诱导中华鲟雌核发育的方法，所述方法包括以下步骤：(1)中华鲟精子遗传物质的灭活：采集中华鲟精子，选取活力在80％以上的中华鲟精子与精子稀释液混合，于1℃预冷的培养皿中，进行紫外线灭活；(2)中华鲟卵子采集及与中华鲟灭活精子授精：选择成熟的中华鲟雌鱼，水温19.5℃，人工注射LHRH-A2催产，在效应时间来临时采用腹部挤压的方法采集卵子，用所述步骤(1)灭活后精子进行授精，精子洒在卵上进行卵受精，加入养殖用水摇匀，再加水洗涤，放入含有滑石粉养殖用水的脱粘瓶中进行充气脱粘处理；(3)热休克加倍处理：在步骤(2)脱粘处理一段时间后，进行热休克处理；(4)雌核发育卵的培育：步骤(3)结束后的卵继续脱粘，脱粘结束后放入喷淋式孵化筛进行孵化培育；(5)雌核苗的分子鉴定：利用微卫星DNA标记筛选的方法，筛选使用灭活精子的亲鱼特异等位基因的微卫星位点，不少于两对；完成同源精子诱导中华鲟雌核的发育。所述步骤(1)精子紫外遗传灭活是在0-2℃低温环境下操作，经稀释后的中华鲟精液放置于在冰上预冷培养皿中，厚度≤1mm，所述精子稀释方式是利用中华鲟精液经过4000g离心力离心4分钟的上清液作为精子稀释液进行中华鲟精子稀释，中华鲟精子与上清液的体积比为1:3。所述步骤(1)紫外线灭活方法为将培养皿置于铺有碎冰的摇床上，震荡频率为80rpm，在无菌操作台的紫外灯照射度为335.6μw/cm2，照射时间7.5分钟时间，紫外灯功率为20W，波长为254nm。所述步骤(2)授精方法为以1mL配比800粒卵的比例，洒在卵上，之后加入1倍卵子体积的养殖用水摇匀1分钟，之后再加一倍的水洗涤，之后放入19.5℃含有10％-15％的滑石粉的养殖用水悬浊液的脱粘瓶中进行充气脱粘处理。所述步骤(3)热休克加倍处理方法为，受精卵在水温18℃脱粘处理18分钟后进行热休克处理，处理的温度范围在36℃，持续时间为2min。所述步骤(4)放入喷淋式孵化筛进行培育，孵化水温为18.5℃。所述方法中步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)总时间为60分钟。上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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