本发明涉及加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的产生，特别是一种通过中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法。
背景技术：
加兰他敏( Galanthamine)，又名加兰沙明，化学式为C17H21NO3，分子量是287.36。白色或微黄色结晶性粉末。无臭，味苦。熔点127～129℃。溶于乙醇、丙酮、氯仿，难溶于苯、乙醚、水。通常以石蒜科（Amaryllidaceae ）鳞茎为原料，在不同酸度下以乙醇、氯仿反复提取精制而得。氢溴酸加兰他敏用于重症肌无力、进行性肌营养不良、脊髓灰质炎后遗症、儿童脑型麻痹、因神经系统疾患所致感觉或运动障碍、多发性神经炎等。本药口服剂型可用于记忆减退、轻至中度阿尔茨海默病。该药已获美国食品药物管理局FDA (Food and Drug Administrationand) 和欧洲注册管理局ERB( the European registration bureau)的批准，是目前世界上广泛应用的治疗轻至中度阿尔茨海默病(简称AD.老年性痴呆症早期症状)的药品。具有很高的开发利用价值。
石蒜碱（Lycoris），化学式为C16H17NO4，分子量是287.30，棱住状晶体。熔点275-280℃(分解)。有右旋光性。不溶于水，难溶于乙醇和乙醚。是从石蒜科（Amaryllidaceae ）植物的鳞茎内分离得到的一种具有催吐、祛痰作用的生物碱，并且其经氢化后生成二氢石蒜碱，后者具有较强的抗阿米巴痢疾作用，且毒性较小，已供临床使用，研究表明对小鼠心肌缺血具有保护作用；石蒜碱制成的内胺盐有抗肿瘤作用。
力可拉敏（Lycoris），又名石蒜胺碱、二氢加兰他敏。化学式为C17H23NO3，分子量是289.38，熔点122-124 ºC，常温下为白色结晶性粉末，无臭、味苦，熔点230 ～237℃。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于氯仿、丙酮、乙醚、苯，其盐类易水解。是从石蒜科（Amaryllidaceae ）植物的鳞茎内分离得到的一种具有抑制胆碱酯酶、止痛作用的生物碱，是加兰他敏的二氢衍生物，药理作用同氢溴酸加兰他敏，但作用较弱，毒性小。临床上二氢加兰他敏主要用于治疗重症肌无力和脊髓灰质炎后遗症、脑血管意外所致的偏瘫、坐骨神经炎。力克拉敏在老鼠和兔子试验上显示显著的止痛效果。
目前，生产加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏有以下几种途径：①直接从石蒜科植株中提取； ②半合成法，即先从中国石蒜中提取中间体，再经合成为石蒜碱成品； ③全合成法，但由于步骤多，成本高尚未投入生产；④利用生物技术、培养能产生石蒜碱的石蒜小鳞茎。其中“培养能产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的中国石蒜小鳞茎”属于“环境友好型”工艺，利用石蒜植物小鳞茎培养，可以克服植株原材料不足的问题，保护濒危石蒜植物资源，而且对环境无污染、可周年生产，不受季节气候限制，科学家普遍认为，利用石蒜植株小鳞茎生产加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏代表着石蒜碱生产未来方向。
技术实现要素：
针对加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏提取原料石蒜植株市场缺口较大的问题，本发明目的是提供一种通过中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法。
本发明的技术方案是：利用中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法，中国石蒜鳞茎为外植体材料，经75%酒精杀毒，0.1%氯化汞灭菌处理，置于含有6-BA 5.0 mg/L和0.5 -1.5mg/L NAA的SH培养基中。琼脂0.75%，蔗糖3-9%，pH5.8-5.95，培养温度19~23℃，光照800~1200 lx，每天光照12 h，黑暗12 h。取中国石蒜小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用。经HPLC检测，石蒜小鳞茎中含有加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏，平均含量为26.51、15.91和63.67 μg/g 干重。
具体包括下列步骤：
A、外植体的选择和灭菌处理：以石蒜鳞茎为外植体，2%～3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗，摇床，再用清水冲洗，经75%酒精杀毒，0.1 %氯化汞灭菌处理，无菌水冲洗，备用；
B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体，接种在含有6-BA 5.0 mg/L和0.5 mg/L NAA，2，4-D2.0 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8-5.95；每天光照8 h，黑暗16 h；
C、小鳞茎的诱导：将经过步骤B中得到的外植体，培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA BA的SH培养基中，其中蔗糖40-60g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.80-5.95，每天光照12 h，黑暗12 h。至出现中国石蒜小鳞茎；
D、小鳞茎培养：将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中，其中蔗糖60-90g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.80-5.95，每天光照12 h，黑暗12 h。培养10-15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量；
E、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提取：将步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，超声处理时间为25-35min，得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤，0.45μm滤膜过滤。定容至10mL备用；
F、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测：经HPLC检测，石蒜小鳞茎中含有石蒜碱和力可拉敏，平均含量为26.51、15.91和63.67 μg/g 干重。
前面所述的方法，优选的是，步骤A所述石蒜为石蒜科石蒜属植物‘中国石蒜’（Lycoris chinensis）。
前面所述的方法，优选的是，步骤A所述摇床100-150转摇15-20分钟，用清水冲洗时间为15-20分钟。
前面所述的方法，优选的是，步骤A浸泡灭菌时间为10-13分钟，无菌去离子水冲洗次数为6-8次。
前面所述的方法，优选的是，步骤D所述酵母提取物制备：精确称量25 g的酵母提取物(yeast extract)，加入125 ml 蒸馏水，然后加入100 ml 乙醇，放入4 ℃冰箱提取4 d，弃去上清夜，把剩余的粘稠沉淀物再次溶解于125 ml蒸馏水中再次进行乙醇提取。用100 ml的蒸馏水溶解最终的沉淀物，在高压灭菌锅中121 ℃灭菌2 h贮存于4 ℃冰箱中备用。诱导物的浓度用总的碳水化合物含量来表示，以蔗糖为标准品采用苯酚-硫酸比色法确定其浓度。
前面所述的方法，优选的是，步骤F：色谱条件为：Kromasil C18柱 ：5 µm，150mm×46mm ；以乙腈—水相(20：80，每800 ml水相中含有2.67 ml二丁胺，用磷酸调节pH为9．0±0．05)为流动相；流速1.0 m1/min；检测波长：289 nm；柱温：室温；进样量：10µl。
本发明利用中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏在以下四个方面具有重要意义：本发明应用组织培养技术克服加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏化学合成复杂的问题：
（1）小鳞茎生长迅速，能够在生物反应器中工业化生产，本发明为进行工厂化植物生产加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提供技术基础，占用空间小、培养简单、成本相对较低；不受地区、季节、气候限制，一年四季均可生产；（2）克服石蒜属植株生长缓慢，可缓解石蒜植物资源濒危及严重不足的问题；（3）环境友好、原料丰富，可很好缓解市场对加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏供应缺口大的问题；（4）小鳞茎育种和选育速度很高，可以通过基因工程等方法筛选高产株系，提高小鳞茎的生产能力，提高加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的产量。
本发明所用培养基配制简单，诱发时间短，小鳞茎生长快，加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量高，易于操作、大规模生产。
本发明以‘中国石蒜’鳞茎为材料，开展以中国石蒜鳞茎培养小鳞茎的工作，这为保护石蒜种质资源，促进利用生物反应器方法获取加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提供了一条新途径，为解决加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏生产中石蒜原料的短缺、提高加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏产量，提供植物生物反应器生产的方法。
具体实施方式
下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。
本发明提供的是一种利用石蒜属植物小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的方法，以‘中国石蒜’鳞茎为材料，经75%酒精杀毒，0.1 %氯化汞灭菌处理，置于含有SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5 mg/L NAA +2，4-D2.0 mg/L培养基中，然后置于小鳞茎诱导培养基中：SH+6-BA 5.0 mg/L+1.0mg/L NAA的SH培养基，最后转接于6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中。培养15天后，进行加兰他敏、石蒜碱，力克拉敏提取。将小鳞茎用烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，超声处理时间为25-35min，收集上清液， 0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用。经HPLC检测，石蒜小鳞茎中含有石蒜碱和力可拉敏，平均含量为26.51、15.91和63.67 μg/g 干重。
具体包括下列步骤：
A、外植体的选择和灭菌处理：以‘中国石蒜’鳞茎为外植体，2%～3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗，摇床100-150转摇15-20分钟，再用清水冲洗，经75%酒精杀毒30秒，0.1 %氯化汞灭菌处理，浸泡灭菌10-13分钟，无菌水冲洗6-8次，备用；
B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体，接种在含有6-BA 5.0 mg/L和0.5 mg/L NAA ，2，4-D2.0 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.80-5.95；每天光照8 h，黑暗16 h。
C、小鳞茎的诱导：将经过步骤B中得到的外植体，培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA BA的SH培养基中，其中蔗糖40-60g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.80-5.95，每天光照12 h，黑暗12 h。至出现中国石蒜小鳞茎；
D、小鳞茎培养： 将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中，其中蔗糖60-90g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8-5.95，每天光照12 h，黑暗12 h。培养10-15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量；
其中酵母提取物制备：精确称量25 g的酵母提取物(yeast extract)，加入125 ml 蒸馏水，然后加入100 ml 乙醇，放入4 ℃冰箱提取4 d，弃去上清夜.把剩余的粘稠沉淀物再次溶解于125 ml蒸馏水中再次进行乙醇提取。用100 ml的蒸馏水溶解最终的沉淀物，在高压灭菌锅中121 ℃灭菌2 h贮存于4 ℃冰箱中备用。诱导物的浓度用总的碳水化合物含量来表示，以蔗糖为标准品采用苯酚-硫酸比色法确定其浓度。该处理措施得到的酵母提取物，对中国石蒜小鳞茎的培养有促进作用，对小鳞茎内的加兰他敏等生物碱的含量提高有促进作用。
E、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提取：将步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，超声处理时间为25-35min，得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用；
F、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测：经HPLC检测，石蒜小鳞茎中含有石蒜碱和力可拉敏，平均含量为26.51、15.91和63.67 μg/g 干重 。
步骤A）所述的中国石蒜基源植物为‘中国石蒜’（Lycoris chinensis），取石蒜鳞茎为外植体，2%～3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗，外植体经75%酒精杀毒30秒，再经0.1 %氯化汞灭菌处理10-13分钟。该处理措施可以有效对石蒜鳞茎表皮和内部进行灭菌，为植物组织无菌培养做好外植体的准备工作。
步骤B）置于含有6-BA 5.0 mg/L和0.5 mg/L NAA ，2，4-D2.0 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8-5.95；每天光照8 h，黑暗16 h。通过多个实验配方对比，在SH基本培养基中添加6-BA 5.0 mg/L和0.5 mg/L NAA，2，4-D2.0 mg/L激素，能有效的促进中国石蒜小鳞茎的形成。
SH培养基为Schenk and Hildebrandt基本培养基，所述的SH培养基的成分按常规为：硝酸钾（KNO3）2500.00 mg/L，硫酸镁（MgSO4）195.05 mg/L，磷酸二氢铵 [(NH4) H2 PO4 ]300.00 mg/L，氯化钙（CaCl2）151.00 mg/L，氯化钴（CoCl2·6H2O）0.10 mg/L，硫酸铜（CuSO4·5H2O）0. 20mg/L，硼酸（H3BO3）5.0 mg/L，碘化钾（KI）1.00 mg/L，硫酸锰（MnSO4•H2O）10.00 mg/L，钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）0.10 mg/L，硫酸锌（ZnSO4•7H2O）1.00 mg/L，硫酸亚铁（FeSO4•7H2O）27.8 mg/L，Na2-EDTA•2H2O 37.3mg/L，甘氨酸2.00 mg/L，盐酸硫胺素(维生素B1) 0.10 mg/L，盐酸吡哆醇(维生素B6) 0.50mg/L，IVB烟酸0.5 mg/L，肌醇100 mg/L。通过多个实验配方对比，在SH基本培养基比MS基本培养基更能促进中国石蒜小鳞茎的快繁，减少小鳞茎玻璃化、褐变的比例，有利于批量生产。
步骤C）培养5-7天后，将经过步骤B中得到的外植体，培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA的SH培养基中，其中蔗糖40-60g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.80-5.95，每天光照12 h，黑暗12 h，至出现中国石蒜小鳞茎；通过多个实验配方对比，在SH基本培养基中添加6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA，蔗糖40-60g/L更有利于小鳞茎的快繁和干重增加。
步骤D）将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中，其中蔗糖60-90g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.80-5.95，每天光照12 h，黑暗12 h。培养10-15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量；通过多个实验配方对比，在SH基本培养基中添加6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L，蔗糖60-90g/L更有利于小鳞茎的快繁和干重增加，同时有助于提高小鳞茎内加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的含量。
步骤E） 步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，超声处理时间为25-35min，得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用；甲醇为提取液，超声波萃取可以有效提高石蒜体内生物碱的提取率。
步骤F）加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测：色谱条件为：Kromasil C18柱 ：5 µm，150mm×46mm ；以乙腈—水相(20：80，每800 ml水相中含有2．67 ml二丁胺，用磷酸调节pH为9．0±0．05)为流动相；流速1.0 m1/min；检测波长：289 nm；柱温：室温；进样量：10µl。加兰他敏，石蒜碱，力克拉敏的标准品由福建利科生物技术有限公司提供，批号061210-2，纯度 ≥ 98.0%。经HPLC检测，石蒜小鳞茎中含有加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏，平均含量为26.51、15.91和63.67 μg/g 干重。使用该检测条件，可以非常有效的检测出甲醇提取液中石蒜碱和力可拉敏。
实施例1
一种利用中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的方法，包括下列步骤：
A）外植体的选择和灭菌处理：以‘中国石蒜’鳞茎为外植体，2%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗，摇床100转摇15分钟，再用清水冲洗，经75%酒精杀毒30秒，0.1 %氯化汞灭菌处理，浸泡灭菌10分钟，无菌水冲洗6次，备用；
B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体，接种在含有6-BA 5.0 mg/L和0.5 mg/L NAA ，2，4-D2.0 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8；每天光照8 h，黑暗16 h。
C、小鳞茎的诱导：将经过步骤B中得到的外植体，培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA BA的SH培养基中，其中蔗糖40g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.80，每天光照12 h，黑暗12 h。至出现中国石蒜小鳞茎；
D、小鳞茎培养： 将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中，其中蔗糖60g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.80，每天光照12 h，黑暗12 h。培养15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量；
E、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提取：将步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，超声处理时间为25min，得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用；
F、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测：经HPLC检测，石蒜小鳞茎中含有加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏，平均含量为31.51、20.91和75.33μg/g 干重。
实施例2
一种利用中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的方法，包括下列步骤：
A）外植体的选择和灭菌处理：以‘中国石蒜’鳞茎为外植体，3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗，摇床120转摇25分钟，再用清水冲洗，经75%酒精杀毒30秒，0.1 %氯化汞灭菌处理，浸泡灭菌11分钟，无菌水冲洗8次，备用；
B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体，接种在含有6-BA 5.0 mg/L和0.5 mg/L NAA ，2，4-D1.0 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8；每天光照8 h，黑暗16 h。
C、小鳞茎的诱导：将经过步骤B中得到的外植体，培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA BA的SH培养基中，其中蔗糖50g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.85，每天光照12 h，黑暗12 h。至出现中国石蒜小鳞茎；
D、小鳞茎培养： 将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.2g/L的培养基中，其中蔗糖70g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.85，每天光照12 h，黑暗12 h。培养15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量；
E、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提取：将步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，超声处理时间为25min，得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用；
F、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测：经HPLC检测，石蒜小鳞茎中含有加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏，平均含量为28.22、17.15和66.78μg/g 干重。
实施例3
一种利用中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的方法，包括下列步骤：
A）外植体的选择和灭菌处理：以‘中国石蒜’鳞茎为外植体，3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗，摇床120转摇30分钟，再用清水冲洗，经75%酒精杀毒30秒，0.1 %氯化汞灭菌处理，浸泡灭菌12分钟，无菌水冲洗8次，备用；
B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体，接种在含有6-BA 5.0 mg/L和1.0 mg/L NAA ，2，4-D1.0 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.90；每天光照8 h，黑暗16 h。
C、小鳞茎的诱导：将经过步骤B中得到的外植体，培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA BA的SH培养基中，其中蔗糖40g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.90，每天光照12 h，黑暗12 h。至出现中国石蒜小鳞茎；
D、小鳞茎培养： 将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中，其中蔗糖60g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.90，每天光照12 h，黑暗12 h。培养15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量；
E、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提取：将步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，超声处理时间为25min，得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用；
F、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测：经HPLC检测，石蒜小鳞茎中含有加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏，平均含量为23.21、13.15和59.71μg/g 干重。
实施例4
一种利用中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的方法，包括下列步骤：
A）外植体的选择和灭菌处理：以‘中国石蒜’鳞茎为外植体，3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗，摇床150转摇20分钟，再用清水冲洗，经75%酒精杀毒30秒，0.1 %氯化汞灭菌处理，浸泡灭菌12分钟，无菌水冲洗8次，备用；
B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体，接种在含有6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA ，2，4-D1.0 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.85；每天光照8 h，黑暗16 h；
C、小鳞茎的诱导：将经过步骤B中得到的外植体，培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA BA的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.85，每天光照8 h，黑暗16 h。至出现中国石蒜小鳞茎；
D、小鳞茎培养： 将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中，其中蔗糖80g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.85，每天光照12 h，黑暗12 h。培养15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量；
E、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提取：将步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，超声处理时间为30min，得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用；
F、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测：经HPLC检测，石蒜小鳞茎中含有加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏，平均含量为23.10、12.43和52.86μg/g 干重。
本发明提供了一种用中国石蒜小鳞茎组织培养产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法，以‘中国石蒜’鳞茎为外植体，经灭菌、接种，培养一段时间后，在鳞片伤口处产生小鳞茎，继续对小鳞茎进行增殖培养。取中国石蒜小鳞茎组织烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。本发明应用组织培养技术克服石蒜属植物资源紧张，加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏化学合成复杂的问题。所用基本培养基以SH培养基为基础，辅以6-苄氨基腺嘌呤、α-萘乙酸、酵母提取物等成分；为进行工厂化生产加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏提供基础，环境友好，原料丰富，可很好缓解市场对加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏供应缺口大的问题。
本发明的完成得益于国家自然科学基金（项目批号31301802）的资助。