一种沙生柽柳组织培养生根方法与流程

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种沙生柽柳组织培养生根方法。

背景技术：

沙生柽柳（Tama Tamarix jintaenia）属杨柳科柳属，为我国荒漠区特有物种，天然分布范围小，仅分布于我国新疆塔里木盆地塔克拉玛干沙漠及盆地东部的库姆塔格沙漠，一直延伸到甘肃敦煌的西沿，生于远离有水河床和湖盆周围的流沙内部，同时沙生柽柳分布生境严酷，面临着濒危威胁，被列为国家珍惜濒危植物名录。沙生柽柳在我国干旱荒漠区的生态适应性极强，生态地位及其生态意义重大。但是，目前我国天然分布的沙生柽柳由于地下水位逐渐下降和流动沙丘间沙表土壤盐分不断增高，天然更新受到极大限制，实生苗正日趋减少，实施沙生柽柳引种栽培，为荒漠区防沙治沙植物选育及柽柳灌丛的恢复重建提供新材料，对研究亚洲中部荒漠植物区系特点和本属的系统发育有科学意义。

植物组织培养是从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等的无性繁殖方法，即通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得完整再生植株或生产具有经济价值的其他产品的繁殖技术。

在大多数苗木的繁殖过程中，传统的有性繁殖也可以达到其生根快繁的目的，但在繁殖过程中易改变母本植物原有的优良性状，使其后代发生变异。

作为目前应用广泛的无性繁殖方法，组织培养不受地理环境和季节条件的限制，能避免植物在生长过程中出现性状分离；此外，该方法具有繁殖速率快、成本低、成活率高、成苗速度快等特点，解决了有性繁殖中出现的一系列问题，从而获得大量无菌生根苗。因此，该方法可使沙生柽柳在较短时间内达到快速、高效繁殖的目的，创造出较高的经济效益。

沙生柽柳主要以无性繁殖为主，插穗成活、保存是扦插繁育的前提和基础，了解掌握沙生柽柳无性繁殖特性，提高无性繁殖苗成活率和保存率，对沙生柽柳无性繁殖苗的生根机理研究显得极有重要。组织培养方法是无性繁殖领域进行物种快速繁殖的重要方法，进年来在苗木、花卉、药材快速繁殖方面已广泛应用并已取得显著效果，而利用组织培养快速生根的方法在沙生柽柳无性繁殖研究中木涉及。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种沙生柽柳组织培养生根方法，利用组织培养促进其生根的方法达到沙生柽柳快速繁殖的目的。

本发明提供一种沙生柽柳组织培养生根方法，包括以下步骤：

（1）外植体的选择：选择沙生柽柳当年生嫩枝作为生根培养的外植体；

（2）外植体前处理；

（3）外植体的灭菌及剪取；

（4）生根培养：生根培养培养基配方为：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2g/L＋蔗糖15-30 g/L；pH值为5.8-6.0；生根培养培养条件为：温度24±2℃、光照强度1500-2000lx、光照时间10-14 h/d；所述MS基础培养基中不含蔗糖，琼脂浓度为5g/L。

作为优选，步骤（2）中所述外植体前处理是选择晴朗天气的下午剪取沙生柽柳当年生枝条作为生根培养的外植体，在室内先将采集的外植体剪至10-15cm，之后用自来水冲洗表面的泥沙；然后用洗衣粉清洗枝条，将洗衣粉泡沫冲洗干净后用玻璃棒蘸取一滴吐温80进行深层清洗，之后将外植体置于流水下冲洗2-6小时。

作为优选，步骤（3）中所述外植体的灭菌是将冲洗干净的外植体置于超净工作台上，先用75%的乙醇浸泡10-15s，用无菌水冲洗3-4遍，再用0.1%的升汞浸泡3-6 min，根据老嫩程度不同，老枝条浸泡时间较长，为5-6 min；嫩枝条浸泡时间短，为3-4min，之后用无菌水冲洗5-7遍。

作为优选，步骤（3）中所述外植体的剪取是将已灭菌的外植体基部切口剪除，用已灭菌的滤纸吸干外植体表面的水分，剪成长1-2cm长并带芽的小段，接种于生根培养基中，每瓶接种一个外植体。

作为优选，步骤（4）中所述生根培养培养基配方为：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2g/L＋蔗糖15-20 g/L。

作为优选，步骤（4）中所述生根培养培养基配方为：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2g/L＋蔗糖15g/L。

本发明还提供一种沙生柽柳组织培养培养基，所述培养基的配方为：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2g/L＋蔗糖15-30g/L。

作为优选，所述培养基的配方为：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2g/L＋蔗糖15-20g/L。

作为优选，所述培养基的配方为：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2g/L＋蔗糖15g/L。

本发明通过利用无性繁殖领域的组织培养方法，解决沙生柽柳生根难的问题，并提出最适合外植体生根的培养基配方。具体步骤主要包括外植体的选择、外植体接种前处理、外植体的灭菌及剪取、生根培养基的配置及配方说明、接种后生根及根生长情况观察。

本发明通过三个不同阶段的培养，筛选并公开了适合沙生柽柳组培生根的具体培养基及其不同激素组合的培养基配方，即不同阶段使用的基本培养基和种类，培养基附加的植物生长调节剂、蔗糖的浓度，培养基酸碱度（PH），外植体培养的外部环境条件，如光照、温湿度等。

本发明利用组织培养的方法，通过三个阶段的筛选确定了适合沙生柽柳组培生根的基本培养基配方与激素组合，突破了在沙生柽柳无性繁殖过程中单独采用扦插繁殖的方法，大大提高了该树种的繁殖速度和效果，对该属植物其它品种及其扦插繁殖难以生根物种起到很好的参考与借鉴作用。

本发明采用的无性繁殖方法能保持原有品种的优良性状，所提出的最适合生根的培养基，可使沙生柽柳外植体较早生根、且出根时间整齐、出根量大、生根后幼苗粗壮、叶子嫩绿、长势好；另外，本发明采用组织培养方法进行难生根树种的无性繁殖，具有繁殖速度快、繁殖系数大、管理方便、生产成本低、成苗率高、培养周期短、可周年生产和有利于实现工厂化生产、不受季节的限制的特点和优点，可为大规模工厂化生产提供有利条件。

另外，由于沙生柽柳根系发达，又具有良好的抗风蚀、沙埋能力及耐盐碱性，因此，将该发明应用于生产实践可为荒漠化综合防治及荒漠区土地改良提供充足、优质的种苗来源。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1-图8分别为应用不同的组织培养基培养沙生柽柳的实验结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

一、本发明的一种沙生柽柳组织培养方法生根方法的实验过程如下：

1、外植体的选择：

适宜外植体的选择是组织培养的基础，本发明选择沙生柽柳当年生枝条作为生根培养的外植体，研究其组培生根情况。

2、外植体前处理：

选择晴朗天气的下午剪取沙生柽柳当年生枝条作为生根培养的外植体；

‚室内先将采集的外植体剪至10-15cm，之后用自来水冲洗表面的泥沙；

ƒ先用洗衣粉清洗枝条，将洗衣粉泡沫冲洗干净后用玻璃棒蘸取一滴吐温80进行深层清洗，之后将外植体置于流水下冲洗2-6小时。

3、外植体的灭菌及剪取：

外植体的灭菌：将冲洗干净的外植体置于超净工作台上，先用75%的乙醇浸泡15s，用无菌水冲洗3-4遍，再用0.1%的升汞浸泡3-6 min（根据老嫩程度不同，老枝条浸泡时间较长，一般为5-6 min；嫩枝条浸泡时间短，一般为3-4min），之后用无菌水冲洗5-7遍；

‚灭菌后外植体的剪取：将已灭菌的外植体基部切口剪除，用已灭菌的滤纸吸干外植体表面的水分，剪成长1-2cm长并带芽的小段，接种于生根培养基中，每瓶接种一个外植体。

4、生根培养：

本发明中沙生柽柳的生根培养以MS为基础培养基（其中大量元素、微量元素、铁盐、有机母液含量均没有变化，不含蔗糖，琼脂浓度为5g/L），并配以不同浓度的吲哚丁酸（IBA）、蔗糖、活性炭（AC），具体实验过程分为三个阶段，各阶段培养基及其配方如下：

第一阶段：筛选适用于沙生柽柳生根培养的基本培养基及最佳生长激素浓度：

1： MS基础培养基；

2：MS基础培养基＋IBA 0.1 g/L＋蔗糖30 g/L；

3：MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖30 g/L；

4：MS基础培养基＋IBA 0.3 g/L＋蔗糖30 g/L；

5：MS基础培养基＋IBA 0.4 g/L＋蔗糖30 g/L；

6：MS基础培养基＋IBA 0.5 g/L＋蔗糖30 g/L；

7：1/2MS基础培养基；

8：1/2MS基础培养基＋IBA 0.1 g/L＋蔗糖30 g/L；

9：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖30 g/L；

10：1/2MS基础培养基＋IBA 0.3 g/L＋蔗糖30 g/L；

11：1/2MS基础培养基＋IBA 0.4 g/L＋蔗糖30 g/L；

12：1/2MS基础培养基＋IBA0.5 g/L＋蔗糖30 g/L；

第二阶段：在第一阶段筛选出的最佳激素浓度的基础上调整蔗糖的浓度进一步筛选最佳激素组合的培养基配方：

S1：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖0 g/L；

S2：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖5 g/L；

S3：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖10 g/L；

S4：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖15 g/L；

S5：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖20 g/L；

S6：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖25 g/L；

S7：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖30 g/L；

S8：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖35 g/L。

第三阶段：在第二阶段筛选出的最佳培养基中加入不同浓度的活性炭（AC）。

5、接种后生根情况：

接种后分别调查已接种外植体的生根情况，主要包括第一次发根时间、根长、根的数量、根系及植株生长情况。

6、培养条件设置：温度24±2℃、光照强度1500-2000lx、光照时间10-14 h/d 。

以上每个培养阶段使用的基本培养基均为MS基础培养基，附加不同种类、不同浓度的植物生长调节剂、蔗糖、活性炭，培养基pH均为5.8-6.0。

二、本发明的一种沙生柽柳组织培养方法生根方法的实验结果为：

本发明首先选择沙生柽柳枝条作为组培生根外植体，将其灭菌后剪成长约1.5-2cm的小段，接种于第一阶段的生根培养基中进行组织培养生根培养基的筛选，培养基以MS为基本培养基，并附加不同浓度的IBA、蔗糖，结果如表1所示。

表1 第一阶段培养

由表1可以看出，第一阶段筛选出沙生柽柳生根时间最早且植株长势最好的培养基为9号培养基：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2＋蔗糖30 g，从而可以确定适合沙生柽柳外植体外植体生根培养的基本培养基为1/2MS基础培养基，激素浓度为IBA 0.2mg/l，并以此为基础进行第二阶段的培养。第二阶段的实验结果如表2所示。

表2 第二阶段培养

研究表明，蔗糖除起着能源的作用之外，还具有调节培养组织木质部分分化的作用，并随着与生长激素组合的蔗糖浓度的改变，愈伤组织中木质部和韧皮部的相对含量发生了很大的变化；生长激素IBA具有刺激形成层细胞分裂、刺激枝的细胞伸长和根细胞生长、促进木质部、韧皮部细胞分化，促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成的作用，主要用于大多数木本植物的扦插升生根繁殖，而组织培养中较低浓度的IBA对外植体生根作用较好。因此第二阶段培养中仍以MS为基本培养基，以第一阶段培养过程中生根良好的9号培养基为第二阶段生根培养的基本培养基，即以IBA 0.2mg/l为基础，调整培养基中蔗糖的含量。结果发现当蔗糖浓度为15mg/l时，沙生柽柳生根效果最好，主要表现为第一次生根时间较早，主根发达，根毛较多，根上部植株长势良好，颜色嫩绿，其生根率为88.3%。

在第三阶段，在培养基中加入不同浓度活性炭后，培养基呈现黑色，生根效果均不明显，故最终选择不在培养基中加入活性炭。即S4培养基配方为最优的培养基配方。

采用上述沙生柽柳生根培养基和培养方法后，沙生柽柳的生根时间缩短至15-21天，一月后，苗木生长加快。

实施例1

本发明的沙生柽柳组织培养生根方法具体步骤如下：

1、外植体的选择：

适宜外植体的选择是组织培养的基础，本发明选择沙生柽柳当年生嫩枝作为生根培养的外植体，研究其组培生根情况。

2、外植体前处理：

选择晴朗天气的下午剪取沙生柽柳当年生枝条作为生根培养的外植体；

‚室内先用将采集的外植体剪至12cm，之后用自来水冲洗表面的泥沙；

ƒ先用洗衣粉清洗枝条，将洗衣粉泡沫冲洗干净后用玻璃棒蘸取一滴吐温80进行深层清洗，之后将外植体置于流水下冲洗4小时。

3、外植体的灭菌及剪取：

外植体的灭菌：将冲洗干净的外植体置于超净工作台上，先用75%的乙醇浸泡12s，用无菌水冲洗3遍，再用0.1%的升汞浸泡4min，之后用无菌水冲洗6遍；

‚灭菌后外植体的剪取：将已灭菌的外植体基部切口剪除，用已灭菌的滤纸吸干外植体表面的水分，剪成长1.cm长并带芽的小段，接种于生根培养基中，每瓶接种一个外植体。

4、生根培养：

生根培养基配方为：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖15 g/L，pH值为5.9；培养条件为：温度24℃、光照强度1800lx、光照时间12h/d ；其中MS基础培养基中不含蔗糖，琼脂浓度为5g/L。

实施例2

本发明的沙生柽柳组织培养生根方法具体步骤如下：

1、外植体的选择：

适宜外植体的选择是组织培养的基础，本发明选择沙生柽柳当年生嫩枝作为生根培养的外植体，研究其组培生根情况。

2、外植体前处理：

选择晴朗天气的下午剪取沙生柽柳当年生嫩枝作为生根培养的外植体；

‚室内先用将采集的外植体剪至10cm，之后用自来水冲洗表面的泥沙；

ƒ先用洗衣粉清洗枝条，将洗衣粉泡沫冲洗干净后用玻璃棒蘸取一滴吐温80进行深层清洗，之后将外植体置于流水下冲洗6小时。

3、外植体的灭菌及剪取：

外植体的灭菌：将冲洗干净的外植体置于超净工作台上，先用75%的乙醇浸泡10s，用无菌水冲洗3遍，再用0.1%的升汞浸泡6 min，之后用无菌水冲洗7遍；

‚灭菌后外植体的剪取：将已灭菌的外植体基部切口剪除，用已灭菌的滤纸吸干外植体表面的水分，剪成长2cm长并带芽的小段，接种于生根培养基中，每瓶接种一个外植体。

4、生根培养：

生根培养基配方为：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖20 g/L，pH值为5.8；培养条件为：温度22℃、光照强度1500lx、光照时间14h/d ；其中MS基础培养基中不含蔗糖，琼脂浓度为5g/L。

实施例3

本发明的沙生柽柳组织培养生根方法具体步骤如下：

1、外植体的选择：

适宜外植体的选择是组织培养的基础，本发明选择沙生柽柳当年生嫩枝作为生根培养的外植体，研究其组培生根情况。

2、外植体前处理：

选择晴朗天气的下午剪取沙生柽柳当年生嫩枝作为生根培养的外植体；

‚室内先用将采集的外植体剪至15cm，之后用自来水冲洗表面的泥沙；

ƒ先用洗衣粉清洗枝条，将洗衣粉泡沫冲洗干净后用玻璃棒蘸取一滴吐温80进行深层清洗，之后将外植体置于流水下冲洗2小时。

3、外植体的灭菌及剪取：

外植体的灭菌：将冲洗干净的外植体置于超净工作台上，先用75%的乙醇浸泡15s，用无菌水冲洗4遍，再用0.1%的升汞浸泡3min，之后用无菌水冲洗5遍；

‚灭菌后外植体的剪取：将已灭菌的外植体基部切口剪除，用已灭菌的滤纸吸干外植体表面的水分，剪成长1cm长并带芽的小段，接种于生根培养基中，每瓶接种一个外植体。

4、生根培养：

生根培养基配方为：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖25 g/L，pH值为6.0；培养条件为：温度26℃、光照强度2000lx、光照时间10h/d ；其中MS基础培养基中不含蔗糖，琼脂浓度为5g/L。

实施例4

本发明的沙生柽柳组织培养生根方法具体步骤如下：

1、外植体的选择：

适宜外植体的选择是组织培养的基础，本发明选择沙生柽柳当年生嫩枝作为生根培养的外植体，研究其组培生根情况。

选择晴朗天气的下午剪取沙生柽柳当年生枝条作为生根培养的外植体；

‚室内先用将采集的外植体剪至12cm，之后用自来水冲洗表面的泥沙；

ƒ先用洗衣粉清洗枝条，将洗衣粉泡沫冲洗干净后用玻璃棒蘸取一滴吐温80进行深层清洗，之后将外植体置于流水下冲洗4小时。

3、外植体的灭菌及剪取：

外植体的灭菌：将冲洗干净的外植体置于超净工作台上，先用75%的乙醇浸泡12s，用无菌水冲洗3遍，再用0.1%的升汞浸泡4min，之后用无菌水冲洗6遍；

‚灭菌后外植体的剪取：将已灭菌的外植体基部切口剪除，用已灭菌的滤纸吸干外植体表面的水分，剪成长1.cm长并带芽的小段，接种于生根培养基中，每瓶接种一个外植体。

4、生根培养：

生根培养基配方为：1/2MS基础培养基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖30 g/L，pH值为5.9；培养条件为：温度23℃、光照强度1900lx、光照时间11h/d ；其中MS基础培养基中不含蔗糖，琼脂浓度为5g/L。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。