本发明涉及组织培养技术领域，更具体地，涉及一种两面针再生苗的组培培养基和培养方法。
背景技术：
两面针（Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.）为芸香科花椒属植物，具有很高的药用价值，其干燥根入药，为我国南方地区常见中药，1977年开始被收入《中国药典》。两面针具有行气止痛、活血化瘀、祛风通络之功效。其中的氯化两面针碱可以抗肝癌和乳腺癌；两面针还是牙膏工业的原料。两面针分布于我国南方各省，生于山野坡地灌木丛中。两面针分布虽然广阔，但资源并不丰富。由于两面针用量巨大，其野生资源几近枯竭，市场上两面针药材的伪品因此也较多。恢复两面针的资源首先需要种苗。可以通过种子萌发、扦插繁殖和组织培养获得种苗。组织培养的研究集中在两面针的快速繁殖，即采用带腋芽的茎段为外植体，通过丛生芽的诱导来实现增殖，但这些方法的繁殖系数较低。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种两面针再生苗的组培培养基。
本发明的第二个目的是提供一种两面针再生苗的组培方法。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
6-糠基氨基嘌呤在两面针组织培养中的应用，所述6-糠基氨基嘌呤在培养基中的浓度为0.2～6 mg/L。
发明人研究发现在两面针中加入6-糠基氨基嘌呤（又名激动素，简称KT）可诱导出两面针愈伤组织，利用愈伤组织进行组织培养，可提高增殖系数，实现快速繁殖。
发明人研究发现，两面针组织培养较为复杂，外植体在诱导长成愈伤组织后，不同生长阶段所需的生长物质的种类和含量显著不同，因此本发明提供了一套从愈伤组织诱导到生根的培养基，即提供一种两面针再生苗的组培培养基，包括愈伤组织诱导培养基、芽分化培养基、芽增殖培养基和生根培养基；所述愈伤组织诱导培养基为MS+1.0～4.0 mg/L KT＋1.0～2.0 mg/LNAA；所述芽分化培养基分为第一次芽分化培养基和第二次芽分化培养基，所述第一次芽分化培养基为MS＋1.0～4.0 mg/L KT＋0.1～0.2 mg/L IBA，所述第二次芽分化培养基为MS＋2.0～6.0 mg/L KT＋0.2 mg/L IBA或者MS＋2.0～6.0 mg/L KT＋0.4～0.8 mg/L NAA；所述芽增殖培养基为MS＋2.0～4.0 mg/L KT＋0.8 mg/L IBA或者MS＋2.0～4.0 mg/L KT＋0.4～0.8 mg/L NAA；所述生根培养基为1/2MS＋0.2～2.0 mg/L KT＋1.0 mg/L IBA。
优选地，所述愈伤组织诱导培养基为MS+4.0 mg/L KT＋2.0 mg/LNAA；所述芽分化培养基为MS+6.0 mg/L KT＋0.2 mg/L IBA；所述芽增殖培养基为MS＋4.0 mg/L KT＋0.8 mg/L NAA；所述生根培养基为1/2 MS＋0.2 mg/L KT＋1.0 mg/L IBA。
本发明还提供一种两面针组织培养的方法，包括以下步骤：
（1）以两面针无根苗的茎段为外植体，进行愈伤组织的诱导；所述愈伤组织诱导培养基为MS+1.0～4.0 mg/L KT＋1.0～2.0 mg/LNAA；
（2）将愈伤组织在分化培养基中分两次进行分化培养，以得到带芽愈伤组织；所述第一次芽分化培养基为MS＋1.0～4.0 mg/L KT＋0.1～0.2 mg/L IBA，所述第二次芽分化培养基为MS＋2.0～6.0 mg/L KT＋0.2 mg/L IBA或者MS＋2.0～6.0 mg/L KT＋0.4～0.8 mg/L NAA；
（3）将带芽的愈伤组织在芽增殖培养基中培养，以获得更多的再生芽，并改善芽的质量；所述芽增殖培养基为MS＋2.0～4.0 mg/L KT＋0.8 mg/L IBA或者MS＋2.0～4.0 mg/L KT＋0.4～0.8 mg/L NAA；
（4）将所得芽从基部切下，转接到生根培养基中诱导生根；所述生根培养基为1/2 MS＋0.2～2.0 mg/L KT＋1.0 mg/L IBA。
优选地，步骤（1）、（2）、（3）、（4）的培养条件均为：温度23～27℃，相对湿度40%～60%，光照强度为32.5～34.5 μmol·m-2·s-1，光周期为光照与黑暗时间各半。
优选地，步骤（1）的两面针无根苗的茎段的获得方法为：取带腋芽的两面针的幼嫩茎段，消毒后，再接种于MS+1.0～2.0 mg/L KT＋0.2～0.4 mg/L NAA培养长成3～4cm的无根苗，再截取无根苗的茎段即可。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以两面针无根苗的茎段为外植体，在含有适宜激素配比的MS培养基上诱导愈伤组织形成；采用先诱导分化，再提高分化率和改善芽的质量的策略，诱导芽的分化，经生根诱导后获得两面针再生苗。本发明建立了经过愈伤组织阶段获得再生苗的组织培养体系，本发明采用了先提高芽分化率，再改善芽的质量的方案，从而获得了高繁殖系数且质量好的种苗，现有通过丛生芽的诱导来实现增殖的方法的增殖系数为2.4～3.6，本发明的方法两面针的繁殖系数达到5.0，高于快速繁殖方法的繁殖系数，如果继代培养愈伤组织1次，则繁殖系数加倍到10.0，如果继代培养愈伤组织2次，则繁殖系数为20.0，这是快速繁殖方法没有的优势，本发明所述培养基和培养方法为大量种植两面针奠定基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
植物材料：两面针无根苗茎段。带腋芽的两面针幼嫩茎段采自广州中医药大学药用植物园，用70%乙醇浸泡30秒，再用0.1%HgCl2浸泡8分钟，用0.5%NaClO浸泡10分钟，最后用无菌水冲洗3次，接种于MS＋2.0 mg·L-1 KT＋0.4 mg·L-1 NAA中培养，12天后开始生长，约12周后可长成3～4 cm的无根苗。
以MS培养基为基础培养基，添加蔗糖30 g·L-1，卡拉胶8.0 g·L-1，pH5.8～6.0作为基础培养基。植物生长物质包括α－萘乙酸（α-naphthalene acetic acid，NAA）、吲哚丁酸（indole-3-butyric acid，IBA）、6-糠基氨基嘌呤（kinetin，KT）。
愈伤组织诱导率：分别在茎段愈伤诱导培养第10、20、30天，观察愈伤组织生长情况，统计诱导率（诱导率=(出愈外植体数/接种外植体总数)×100%）。
愈伤组织分化率：愈伤组织分化培养4周或8周，统计愈伤组织分化率（分化率=(分化出芽的愈伤组织块数/接种的愈伤组织总块数)×100%）。
芽增殖系数：芽分化培养8周后，转接至增殖培养基中培养。培养4周或8周统计芽增殖系数(芽增殖系数=全部增殖芽数/接种芽数)。
生根率：生根培养8周，统计生根率（生根率=(生根的芽数/接种的芽数)×100%）。
实施例1
一、愈伤组织的诱导
在无菌条件下将无根苗的茎切成约6 mm的小段，水平放置在愈伤组织诱导培养基的表面（愈伤组织诱导培养基的组成具体见表1）；每瓶接种3段；每种培养基各接种25瓶。培养条件：温度（25±2）℃，相对湿度40%～60%，光照强度为（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期为光照与黑暗时间各半，一个月继代1次。
两面针茎段在三种不同植物生长物质组合构成的诱导培养基（A1、A2、A3培养基由基础培养基和表1中的植物生长物质组成，其中基础培养基的含量相同）中都能产生愈伤组织，说明适当浓度的KT和NAA能够诱导产生愈伤组织。比较三种培养基产生愈伤组织的效果，在A3培养基中的诱导率最高，达到74.84%；其次是A1培养基，诱导率为66.84%；最差的是A2培养基，诱导率只有58.76%。产生的愈伤组织的质量也有不同，在A3和A1上产生的愈伤组织的颜色是淡黄色、颗粒状、质地疏松而且湿润的；而在A2上产生的愈伤组织的颜色是淡黄色、块状、质地干硬的；因此A3和A1培养基上产生的愈伤组织比较适宜作为愈伤组织分化的材料，由于A3培养基上的诱导率最高，所以选取A3培养基诱导的愈伤组织进行分化实验。
二、愈伤组织的分化
将继代1次，在A3培养基中诱导的愈伤组织块切成5 mm×5 mm大小，接种于分化培养基中（表2，培养基B1、B2、B3由基础培养基和表2的植物生长物质组成，其中基础培养基的含量相同），每瓶接种4块，每种培养基各接种50瓶。培养1个月后，将在培养基B3上产生的愈伤组织再转移到另4种分化培养基中培养（表3），每个培养皿接种8块，每种培养基各接种12个培养皿。培养条件：温度（25±2）℃，相对湿度40%～60%，光照强度为（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期为光照与黑暗时间各半。
结果见表2。在培养基B1中没有芽的分化。而在培养基B2和B3上可以分化出芽，但分化率低，只有4.50%和12.50%，每块愈伤组织的芽平均数为1.00和1.30。在培养基B1上没有分化出芽的原因可能是KT的浓度太低。从表2的结果可以看出，三种培养基中，含4 mg/L KT＋0.2 mg/L IBA的B3培养基对愈伤组织分化有一定的效果，但效果还不够理想。为了进一步提高芽的分化率，将在B3进行过分化培养的不含芽的愈伤组织，转移到其他四种分化培养基中继续进行芽的分化培养（表3，B3、B4、B5、B6由基础培养基和表3的植物生长物质组成，其中基础培养基的含量相同）。
从表3结果可以看出，四种含植物生长物质组合的培养基都可以促进芽的分化，在培养基B4中的愈伤组织的分化效果较好，芽分化率为36.46%，显著高于在其它三个培养基中的分化率，且每块愈伤组织的平均芽数达到3.30。在培养基B3、B5和B6的中的愈伤组织芽分化率分别为20.83%、16.67%和23.96％，它们之间没有显著性差异。四种培养基中，B4的KT含量最高，分化出的芽较小、颜色偏黄、叶片细小，说明芽的质量较差。因此表3的结果表明，高浓度的KT对芽的分化有利，但KT的浓度太高，会使芽的质量变差。
综合表2和表3的结果分析，在芽分化培养中，除了KT的浓度不能过低外，生长素的浓度对芽的分化率也有影响，在KT浓度相同的处理中，生长素浓度高，则有芽分化率高的趋势。另外，表3的B3培养基的芽分化率高于表2中的B3培养基的芽分化率，原因可能是表3的愈伤组织的培养时间较长。
三、芽的增殖
将来自分化培养基B4的带芽愈伤组织转接到芽增殖培养基中（表4），每个培养皿接种6块愈伤组织，每块愈伤组织带1～2个芽，每种培养基各接种8个培养皿。4周后继代1次，接种到培养瓶中，每瓶接种3块带1～2个芽的愈伤组织，每种培养基各接种16瓶。培养条件：温度（25±2）℃，相对湿度40%～60%，光照强度为（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期为光照与黑暗时间各半。
B4培养基中芽的分化率明显高于其它培养基，但芽的质量较差，可能的原因是B4培养基的KT浓度过高。为了获得高的芽分化率而又得到好质量的芽，将B4培养基上的芽重新转接到低KT浓度的B3、B5和B6培养基中进行增殖培养。结果见表4。从表4可以看出，培养4周和8周后，芽增殖效果最好的是B6培养基，其芽增殖系数分别是3.33（培养4周）和5.00（培养8周）。其次是B3培养基，培养4周和8周后，芽增殖系数分别是2.66和3.50。增殖系数较高的这两个培养基的KT浓度都是4.0 mg·L-1，它们的芽生长速度较慢，芽稍短，但芽的颜色较绿，说明芽的质量是好的。B5培养基上的增殖效果最差，它的KT浓度为2.0 mg·L-1。所以，在增殖培养中，KT的浓度过低不利于芽的增殖。
比较B5和B6培养基中的植物生长物质组成，它们的KT与NAA的浓度比值都是5，但两者芽的增殖效果却不同，这说明当细胞分裂素和生长素比值相同，而它们的绝对浓度不同时，芽的分化能力也有差异，也就是说，芽的分化能力不但受细胞分裂素与生长素的比值的影响，还受两种激素的绝对浓度影响。4.0 mg·L-1 KT和0.8 mg·L-1 NAA的生长物质的组合更有利于芽的增殖。
四、生根培养
增殖培养后，将来自培养基B6的高于2 cm的芽块（带少量愈伤组织）转接到1/2 MS培养基中进行生根诱导（表5），每瓶接种4块愈伤组织，每块带1～3个芽，每种培养基接种20瓶。培养条件：温度（25±2）℃，相对湿度40%～60%，光照强度为（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期为光照与黑暗时间各半。
取生长在B6培养基中高于2 cm的芽进行生根培养。培养4周后发现芽下部开始分化形成根。培养8周后的生根情况见表5。三种生根诱导培养基（C1、C2、C3培养基由基础培养基和表5的植物生长物质组成，其中基础培养基的含量相同）中，生根效果较好的是C1和C2，它们的生根率分别是66.75%和46.85%，根多且长；而C3培养基的生根率较低，为25.30%，根也较短。表5的结果表明，随着KT浓度的升高，生根率下降。生根诱导最好的培养基是C1。
五、炼苗与移栽
将在C1培养基中获得的再生苗进行锻炼。把培养瓶放置在室内靠窗处接受散射的自然光照射3天，然后打开培养瓶盖，在相同位置又放置3天。之后取出再生苗，用清水洗净植株基部的培养基，移栽到含1/3砂、2/3土的培养基质中。除了注意在苗期时遮荫外，不需要特别护理。移栽后的两面针幼苗生长良好，移栽成活率为91%。
对比例1
实验方法同实施例1，唯一不同的是：实施例1的步骤一中愈伤组织诱导培养基中不含有KT，其诱导率为1.34%～5.31%。