一种间充质干细胞的保存液以及保存方法与流程

本发明涉及医疗技术领域，特别是涉及一种间充质干细胞的保存液以及保存方法。

背景技术：

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化的潜能，能分化成骨、脂肪软骨等多种细胞；同时MSCs具有免疫调节、炎症趋化、组织修复功能及低免疫原性等生物学特性；可广泛用于骨损修复、骨髓重建、神经损伤修复和免疫调控等领域。MSCs可以从人或者动物的骨髓、胎盘、脂肪组织、脐带血、肝脏、牙髓腔等组织器官中分离、培养，而MSCs普及应用的前提之一是如何体外方便、有效保存。

目前MSCs有三种保存方法：

一、MSC体外培养、传代保存

MSC离体分离后，可以用适当的细胞培养液进行体外培养，然后将体外培养的细胞不间断的进行传代，在需要使用的时候收获细胞备用。由于MSCs具有分化潜能，在培养过程中有可能发生分化，形成组织如骨头、脂肪、软骨等，因此用细胞培养、传代的方法保存MSCs，可能导致MSCs出现不可预知的分化，进而发生功能改变，对后续的使用产生不利影响。

二、MSC体外深低温冰冻保存

MSC离体分离后，用适当浓度的冷冻保护剂如甘油、二甲亚砜等，与MSCs充分混匀后，经过程控降温程序，最终放到-196℃的液氮中保存，由此实现MSC的中长期保存。该方法需要液氮罐等特殊装置，人员操作时有液氮灼烧风险；冻存过程中需加入冷冻保护剂，而使用前需要将冷冻保护剂有效去除，因此不利于后续使用；MSC深低温冻存后复苏过程中容易导致细胞丢失，损失大量细胞，不利于批量MSCs保存。

三、即用即取

只有在需要使用MSCs的时候，才进行离体分离。即采用不同的方法，从人体或者动物体内分离、得到MSCs后，立即使用，不将MSCs放到任何环境下保存。即用即取的方法虽然目前应用较为广泛，可克服细胞分化和冰冻损失细胞的不利因素，但受到场地、操作条件等诸多限制，且实施过程中，需要完整的流程配合，极易造成MSCs的浪费和丢弃，从而成为MSCs推广应用的障碍。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一条抗细胞分化、易于操作、低成本的适合实验研究和临床应用的大批量保存MSCs的方法。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种间充质干细胞的保存液，其配方按重量百分比包括如下组分：枸橼酸钠2.63g/ml、枸橼酸0.327g/ml、葡萄糖3.19g/ml、腺嘌呤0.0275g/ml、磷酸二氢钠0.222g/ml和医用纯水余量。

一种间充质干细胞的保存方法，步骤如下：

①取部分细胞进行细胞计数，其余细胞离心去上清；以每毫升保存液保存106-107细胞的比例，用上述比例制备的保存液重悬细胞，轻柔充分混匀细胞和保存液；

②将细胞悬液转移至无菌的离心管中，用封口膜密封；

③将离心管转移至2-6℃冰箱中保存，每天至少观察记录冰箱温度4次，保证冰箱温度控制在2-6℃；

④保存期内的MSCs可随时在无菌环境中取出，在2-6℃条件下低速离心弃上清，收集细胞，供体内外使用。

如上所述的一种间充质干细胞的保存方法，其中，所述间充质干细胞从人或小鼠的骨髓、脂肪、脐血中提取的。

如上所述的一种间充质干细胞的保存方法，其中，每毫升保存液可保存106-107个间充质干细胞。

如上所述的一种间充质干细胞的保存方法，其中，保存液最低保存该间充质干细胞的保存期限为14天以上。

如上所述的一种间充质干细胞的保存方法，其中，保存过程中用到的保存器皿为封闭式塑料或者玻璃器皿。

与现有技术相比，本发明产生的有益效果主要体现在：

(1)本发明的一种间充质干细胞的保存液以及保存方法，可使MSCs保存后存活率达到75％以上，高于液氮冻存深低温方法的细胞得率；

(2)本发明的一种间充质干细胞的保存液以及保存方法，用本发明的保存液保存MSCs到14天以后，MSCs没有向其他细胞分化，优于培养传代保存方案；

(3)本发明的一种间充质干细胞的保存液以及保存方法，仅需要使用常见的2-6℃冰箱配置，易于操作，不需要添加液氮或者冷冻保护剂，人员操作时安全性较高，节省液氮罐所占空间；

(4)本发明的一种间充质干细胞的保存液以及保存方法，存储方便，适于MSCs大规模储存；

(5)本发明的一种间充质干细胞的保存液以及保存方法，方便运输，也利于MSCs的中远程转运。

附图说明

附图1为MSCs在保存液中保存14天后，台盼蓝染色检测死亡细胞的结果，显微镜放大倍率为100×，200×；

附图2为MSCs在保存液中，随保存时间的变化，细胞存活率的统计图；

附图3为MSCs在保存液中保存的第1天和第14天，碘化丙啶(propidium iodide，PI)检测细胞存活率的流式图。

具体实施方式

为了便于理解本发明的目的、技术方案及其效果，现将结合实施例对本发明做进一步详细阐述。

如图1所示，本发明的一种间充质干细胞的保存液，其配方按重量百分比包括如下组分：枸橼酸钠2.63g/ml、枸橼酸0.327g/ml、葡萄糖3.19g/ml、腺嘌呤0.0275g/ml、磷酸二氢钠0.222g/ml和医用纯水余量。

本发明的一种间充质干细胞的保存方法，步骤如下：

①取部分细胞进行细胞计数，其余细胞离心去上清；以每毫升保存液保存106-107细胞的比例，用上述比例制备的保存液重悬细胞，轻柔充分混匀细胞和保存液；

②将细胞悬液转移至无菌的离心管中，用封口膜密封；

③将离心管转移至2-6℃冰箱中保存，每天至少观察记录冰箱温度4次，保证冰箱温度控制在2-6℃；

④保存期内的MSCs可随时在无菌环境中取出，在2-6℃条件下低速离心弃上清，收集细胞，供体内外使用。

本发明的一种间充质干细胞的保存方法，所述间充质干细胞从人或小鼠的骨髓、脂肪、脐血中提取的。

本发明的一种间充质干细胞的保存方法，每毫升保存液可保存106-107个间充质干细胞。

本发明的一种间充质干细胞的保存方法，保存液最低保存该间充质干细胞的保存期限为14天以上。

本发明的一种间充质干细胞的保存方法，保存过程中用到的保存器皿为封闭式塑料或者玻璃器皿。

本发明还提供了MSCs中长期保存后存活率的验证，具体如下：

(1)以骨来源的MSCs为例，制备MSCs

①取8-12周龄的C57BL/6小鼠股骨和胫骨，手术刀片清理去除所有肌肉组织。骨头放于研磨杯内研磨至骨髓释放，加入PBS冲洗骨头以去除骨髓，再次研磨和冲洗，直到骨头全部变成白色。加入0.5％胶原酶混匀后，摇床上37℃消化1h，然后取70μm孔径滤网，过滤消化后骨混合物，收集过滤液。离心，用PBS重悬后，进行细胞计数。

②用抗-CD45和抗-Ter119的免疫磁珠，按照试剂盒的方法对上述细胞悬液富集MSCs；

(2)MSCs的保存

①用1ml保存液重悬(1)中制备的MSCs，混匀，进行细胞计数。

②以每毫升保存液保存106-107细胞的比例，用保存液重悬细胞，轻柔充分混匀细胞和保存液；

③取20μl细胞悬液与等量的0.8％的台盼蓝(生理盐水作为溶剂配置的)混匀，在3分钟之内压片，光学显微镜下计数未染色的细胞(为活细胞)，计算活细胞数量。

④其余细胞悬液转移至无菌离心管中，用封口膜密封，置于2-6℃冰箱中保存。

(3)MSCs保存效果的检测

①在保存的第1，4，7，14天，对细胞使用台盼蓝拒染法测定细胞活力。取0.8％的台盼蓝20μl与等量的细胞悬液混匀，在3分钟之内压片，光学显微镜下成像，并计数未染色的细胞(为活细胞)与染色细胞(染成蓝色，为死细胞)，计算活细胞占细胞总数的百分数。结果如附图1和2。

②在第1天和第14天，取100μl保存MSCs，加入1mlPBS混匀后，1500rpm离心5min，弃上清，加入流式缓冲液500μl,混匀。加入5μlPI(200μg/ml),2-8℃避光染色15min,在1h内流式检测PI阴阳性细胞。PI嵌入核酸双链中并可以发荧光。它不能进入活细胞，但是可以进入正在或者已经死亡的细胞。因此PI阳性细胞为死细胞，PI阴性细胞为活细胞。结果如附图3。

上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。