一种防治马铃薯干腐病的植物源杀菌剂及其制备方法与流程

本发明涉及植物保护领域。

背景技术：

马铃薯干腐病是由镰刀菌(Fusarium spp)引起的一种真菌病害，是马铃薯窖储期间主要病害之一，损失率约15％-35％，严重时可达50％。目前主要通过化学药剂进行防控，收到较好的效果，但化学药剂长期使用后病原菌易产生抗药性，致使大部分地区病害抗性频率超过50％，防治效果逐年降低，最终导致化学药剂完全失去防效。同时由于大量农药的使用给土壤、水体等生态环境带来严重污染，因此亟待研究和开发高效、低毒、低残留，环境友好型植物源杀菌剂。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有杀菌剂长期使用导致病原菌易产生抗性及其对环境污染严重的缺点；而提供一种植物源杀菌剂及其制备方法。

本发明的一种防治马铃薯干腐病的植物源杀菌剂，它为浓度为0.1～2.0mg/mL绵马贯众素ABBA溶液。

本发明中植物源杀菌剂的制备方法的步骤如下：

一、于6～8月采集新鲜的粗茎鳞毛蕨植物材料，选择根状茎粗大的植株，整株采集，阴干后粉碎过40目筛备用；

二、称取粗茎鳞毛蕨粉末，按质量体积比为1kg：10L的比例将其与体积百分含量为70％的乙醇混合，然后在50℃，45Hz条件下超声浸提20min，再真空抽滤，收集滤液，然后向残渣中加入1L的收集的滤液，在50℃，45Hz条件下超声浸提20min，即得到粗茎鳞毛蕨植物源抑菌剂提取物粗品；

三、用体积百分含量为95％乙醇浸泡DM-130大孔吸附树脂24h，然后装柱；

四、以1～2mL/min的速度将粗茎鳞毛蕨植物源抑菌剂提取液进行上柱；

五、对步骤四DM-130大孔吸附树脂先用蒸馏水洗至无色，然后用体积百分含量为70％乙醇进行洗脱，用管收集洗脱液，洗脱液经滤膜过滤后，即得到植物源杀菌剂。

本发明包含以下有益效果：

本发明植物源抑菌剂具有无毒、低残留、无污染、无抗药性、抑菌活性较强、高选择性。对马铃薯干腐病镰刀菌生长有一定的抑制作用，可有效的控制菌丝径向生长，能够显著降低菌丝的生长量。同时该植物源抑菌剂可以提高块茎组织的抗性，可诱导马铃薯产生抗性，抑制镰刀菌的侵染，减低由于镰刀菌导致的病害发生程度。本发明与化学药剂相比，植物源提取剂作用位点多，药剂持续期长，降解速度快，对环境污染小等优点。

附图说明

图1植物源抑菌剂对镰刀菌菌丝生长量的抑制；

图2为植物源抑菌剂对马铃薯“尤金”块茎抗干腐病的诱导柱状图；其中，CK1为阴性对照，以无菌水接种的健康马铃薯“尤金”块茎；CK2为阳性对照，以植物源抑菌剂接种的健康马铃薯“尤金”块茎；处理1以镰刀菌接种的健康马铃薯“尤金”块茎；处理2以植物源抑菌剂处理接种镰刀菌的健康马铃薯“尤金”块茎；

图3为植物源抑菌剂对马铃薯“克新13”块茎抗干腐病的诱导图；其中，CK1为阴性对照，以无菌水接种的健康马铃薯“克新13”块茎；CK2为阳性对照，以植物源抑菌剂接种的健康马铃薯“克新13”块茎；处理1以镰刀菌接种的健康马铃薯“克新13”块茎；处理2以植物源抑菌剂处理接种镰刀菌的健康马铃薯“克新13”块茎；

图4为“克新13”切片病斑直径图；其中，CK1为阴性对照，以无菌水接种的健康马铃薯“克新13”块茎；CK2为阳性对照，以植物源抑菌剂接种的健康马铃薯“克新13”块茎；处理1以镰刀菌接种的健康马铃薯“克新13”块茎；处理2以植物源抑菌剂处理接种镰刀菌的健康马铃薯“克新13”块茎；

图5为“尤金”切片病斑直径图；其中，CK1为阴性对照，以无菌水接种的健康马铃薯“克新13”块茎；CK2为阳性对照，以植物源抑菌剂接种的健康马铃薯“克新13”块茎；处理1以镰刀菌接种的健康马铃薯“克新13”块茎；处理2以植物源抑菌剂处理接种镰刀菌的健康马铃薯“克新13”块茎；

图6为具体实施方式九中绵马贯众素ABBA的HPLC色谱图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种防治马铃薯干腐病的植物源杀菌剂，它为浓度为0.1～2.0mg/mL绵马贯众素ABBA溶液。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：绵马贯众素ABBA是由鳞毛蕨科(Dryopteridaceae)鳞毛蕨属(Dryopteris Adanson)粗茎鳞毛蕨(Dryopteris crassirhizoma)提取得到的。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它为浓度为0.5～2.0mg/mL绵马贯众素ABBA。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它为浓度为1.0～2.0mg/mL绵马贯众素ABBA。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它为浓度为1.5～2.0mg/mL绵马贯众素ABBA。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式一种防治马铃薯干腐病的植物源杀菌剂的制备方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

一、于6～8月采集新鲜的粗茎鳞毛蕨植物材料，选择根状茎粗大的植株，整株采集，阴干后粉碎过40目筛备用；

二、称取粗茎鳞毛蕨粉末，按质量体积比为1kg：10L的比例将其与体积百分含量为70％的乙醇混合，然后在50℃，45Hz条件下超声浸提20min，再真空抽滤，收集滤液，然后向残渣中加入1L的收集的滤液，在50℃，45Hz条件下超声浸提20min，即得到粗茎鳞毛蕨植物源抑菌剂提取物粗品；

三、用体积百分含量为95％乙醇浸泡DM-130大孔吸附树脂24h，然后装柱；

四、以1～2mL/min的速度将粗茎鳞毛蕨植物源抑菌剂提取液进行上柱；

五、对步骤四DM-130大孔吸附树脂先用蒸馏水洗至无色，然后用体积百分含量为70％乙醇进行洗脱，用管收集洗脱液，洗脱液经滤膜过滤后，此时绵马贯众素ABBA的纯度11.52％，即得到植物源杀菌剂。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：DM-130大孔吸附树脂装柱前进行如下处理：

一、用乙醇洗DM-130大孔吸附树脂，洗至流出液与蒸馆水混合后不产生浑油后，改用蒸馏水以同样流速通过DM-130大孔吸附树脂，洗至无醇味；二、用酸碱处理，最后用蒸馏水以步骤一同样的流速洗DM-130大孔吸附树脂至为中性；然后装柱。

其它与具体实施方式六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六不同的是：步骤四中以1.5mL/min的速度将粗茎鳞毛蕨植物源抑菌剂提取液进行上柱。其它与具体实施方式六相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六不同的是：步骤五经滤膜过滤后的洗脱液，需进行高效液相色谱分析后，得绵马贯众素ABBA，配成浓度为0.1～2.0mg/mL绵马贯众素ABBA溶液，即为植物源杀菌剂；其中，色谱条件柱为water600C18柱，流动相为体积百分含量为100％甲醇，柱温20℃，进样体积为10uL，保留时间为18min。其它与具体实施方式六相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一

体外条件下使用浓度为0.1mg/mL，0.5mg/mL和2.0mg/mL植物源抑菌剂对马铃薯干腐病主要致病菌黄色镰刀菌(Fusarium culmarum)、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)和茄病镰刀菌蓝色变种(Fusarium solani var.coeruleum)进行体外抑制。

参考钟秋平和夏文水方法并修改，无菌操作条件下，待蒸汽灭菌冷却至40～45℃时，加入一定量植物提取液加入，充分混匀，使PDA中植物提取液浓度为0.1mg/mL，0.5mg/mL和2.0mg/mL，待完全溶解后倒平板，以不添加提取液作为对照。平板冷却后用打孔器接种培养7d的黄色镰刀菌(F.culmarum)、燕麦镰刀菌(F.avenaceum)、接骨木镰刀菌(F.sambucinum)和茄病镰刀菌蓝色变种(F.solani var.coeruleum)，将生长一致的供试菌饼(Ф＝6.0mm)置于含不同浓度提取物的培养皿中部，使菌饼带菌丝的一面贴在培养基表面，25℃下培养，待对照组的菌落直径达到培养皿的2/3时，十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复3次，计算菌丝生长抑制率。

结果如表1显示：植物源抑菌剂对马铃薯镰刀菌干腐病有良好的抑制效果，高浓度提取液对不同种镰刀菌的抑菌作用显著高于低浓度提取液的抑菌作用，在浓度2.0mg/mL时抑制率达90％以上。

表1不同浓度植物源提取物对马铃薯镰刀菌干腐病的抑制率

由数据处理得粗茎鳞毛蕨绵马贯众素ABBA对4种镰刀菌的毒力方程y＝a+bx，并有毒力方程计算要几个浓度对马铃薯镰刀菌干腐病的抑制终浓度(EC50)，结果如表2所示，其中对茄病镰刀菌蓝色变种的抑菌效果最好，EC50为0.161mg/mL，对其余3种镰刀菌的EC50在0.215至0.2519mg/mL之间。

表2植物源提取物对马铃薯镰刀菌干腐病的毒力测定

实施例二

参考于汉寿和陈永萱方法并作修改，配成浓度为0.1mg/mL和0.5mg/mL植物源抑菌剂的马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)，以不含植物源抑菌剂作为对照。每瓶含50mL培养基，接种5片在PDA培养7d的茄病镰刀菌蓝色变种的菌饼(Ф＝6mm)，25℃100RPM振荡培养14d，过滤菌丝，烘干后测定菌丝干重。

结果如图1显示，植物源抑菌剂处理能够显著降低菌丝的生长量，随着处理浓度的增加，菌丝体干重逐渐降低，均显著的低于对照(p＜0.05)，当植物源抑菌剂浓度达到时0.5mg/mL时，培养14d后，菌丝干重仅为对照的32.24％。

实施例三

植物源抑菌剂处理马铃薯“尤金”和“克新13”切片，分别取外观整齐、无损伤，健康的“克新13”和“尤金”马铃薯块茎，清水冲洗后，用5％的次氯酸钠表面消毒2min，无菌水冲洗3次，放入无菌超净工作台中自然阴干。在无菌超净台中将块茎分割成厚约0.5cm的薄片，用经高压灭菌的无菌打孔器(Ф＝5mm)在薄片中央打成圆形凹槽，切片用无菌水清洗后，经75％的酒精擦洗并在酒精灯火焰上烧去残余酒精，放于装有无菌滤纸的培养皿中。取100μL浓度为2mg/mL的植物源抑菌剂溶液加入到薯片中央圆形凹槽中。以分别单独加入无菌水和植物源抑菌剂的健康马铃薯块茎为对照。接种方法：取PDA上培养7d的茄病镰刀菌蓝色变种打成菌饼(Ф＝5mm)，倒置接种到处理后的马铃薯切片中央。25℃的温度下培养，湿度为85～90％(保湿24h)，3d和6d分别用十字交叉法测量病斑扩展直径。

结果如表3显示：马铃薯“尤金”和“克新13”切片用2.0mg/mL的植物提取物处理后，进行接种，培养6d后发现，植物提取物处理后均能降低镰刀菌的侵染。如图4和图5显示，马铃薯“尤金”和“克新13”切片用2.0mg/mL的植物源抑菌剂处理后的病斑直径(CK2)与阴性对照(CK1)无差异，说明植物源抑菌剂不会对块茎造成伤害，不产生药害。

表3植物源提取物对镰刀菌侵染马铃薯块茎组织能力的影响

实施例四

植物源抑菌剂处理损伤接种马铃薯块茎，分别取外观整齐、无损伤的，健康的“克新13”和“尤金”马铃薯块茎，用清水冲洗后，用5％的次氯酸钠表面消毒1min，无菌水冲洗3次，自然干燥后放入无菌超净工作台中，在块茎表明等距离用打孔器(Ф＝5mm)在每个块茎上打孔，孔深为3mm。取100μL浓度为2mg/ml的植物源抑菌剂加入马铃薯小孔内，以分别单独加入无菌水和植物源抑菌剂健康马铃薯块茎为对照。接种方法：取PDA上培养7天的黄色镰刀菌(F.culmarum)、燕麦镰刀菌(F.avenaceum)、接骨木镰刀菌(F.sambucinum)和茄病镰刀菌蓝色变种(F.solani var.coeruleum)打成菌饼(Ф＝5mm)，正置于马铃薯小孔内，最后将原马铃薯块茎组织塞回并用透明胶布封口。25℃培养箱中培养，湿度85～90％(保湿24h)，分别在第16d时用十字交叉法测量病斑扩展直径。

结果如图2和图3显示，植物源抑菌剂对马铃薯“尤金”和“克新13”健康块茎损伤接种镰刀菌后的产生明显的抗性诱导效果，浓度为2mg/mL的植物源抑菌剂处理损伤接种块茎的病斑直径(处理2)极显著低于镰刀菌接种处理块茎的病斑直径(处理1)(P≤0.01)，说明植物源抑菌剂的诱导效果显著，能显著降低镰刀菌对块茎的侵染。植物源抑菌剂处理损伤接种块茎的病斑直径(处理2)与阴性对照(CK1)差异不显著，说明植物源抑菌剂对马铃薯“尤金”和“克新13”诱导处理后对镰刀菌侵染的抑制效果明显。植物源抑菌剂处理马铃薯“尤金”健康块茎的病斑直径(CK2)与阴性对照(CK1)差异显著，说明植物源抑菌剂对健康马铃薯“尤金”和“克新13”块茎在没有受到病原菌侵入的时候也产生一定诱导抗性，可以提高块茎的抗性。

实施例五

植物源抑菌剂处理接种处理马铃薯块茎，分别取外观整齐、无损伤的，健康的“尤金”马铃薯块茎，用清水冲洗后，用质量百分含量为5％的次氯酸钠表面消毒1min，无菌水冲洗3次，自然干燥后放入无菌超净工作台中备用。

使用镰刀菌接种马铃薯块茎，取灭菌的钉子，在块茎表面打孔深为3mm，宽度为3mm的小洞，向小洞中加入20μL茄病镰刀菌蓝色变种(F.solani var.coeruleum)分生孢子悬浮(1×10⁵个孢子/mL)，25℃，在黑暗培养，以此作为阳性对照。

培养24h后将植物源抑菌剂均匀的喷在马铃薯块茎上，浓度分别为1.0，0.1和0.01mg/mL，保持块茎湿润10min，然后在空气中干燥5min，直到块茎上无水分为止。25℃，黑暗中培养，以喷施无菌水的块茎作为阴性对照。

培养中的湿度为85～90％(保湿24h)，在第7d时测量块茎病斑扩展直径和深度，计算病斑面积比率。

结果如表4显示，植物源抑菌剂对随机选取的马铃薯健康块茎损伤接种镰刀菌后的产生治疗效果，马铃薯块茎接种马铃薯干腐病病原菌之后再施用植物源抑菌剂，块茎上的病斑面积减小，说明植物源抑菌剂可以对马铃薯干腐病有一定的治疗效果。

表4不同浓度植物源提取物对马铃薯干腐病的治疗效果

实施例六

分别取外观整齐、无损伤的，健康的马铃薯块茎，用清水冲洗后，用5％的次氯酸钠表面消毒1min，无菌水冲洗3次，自然干燥后放入无菌超净工作台中备用。将0、0.01，0.1和1.0mg/mL的植物源抑菌剂分别喷在马铃薯块茎上，使块茎浸湿为止，保持块茎湿润10min，然后在空气中干燥5min，直到块茎上无水分为止，25℃，在黑暗培养。24h后用灭菌的钉子，在块茎表面打孔深为3mm宽度为3mm的小洞，向小孔中加入20μL的茄病镰刀菌蓝色变种(F.solani var.coeruleum)分生孢子悬浮(1×10⁵个孢子/mL)，25℃，黑暗中培养。以单独浸泡在无菌水中的块茎作为阴性对照。在第7d时测量块茎病斑扩展直径和深度，计算病斑面积和比率。

结果如表5显示，植物源抑菌剂对随机选取的马铃薯健康块茎有很好的保护作用，先施用植物源抑菌剂后再接种病原菌，发病率明显降低，说明该植物源药剂对马铃薯块茎有很好的保护作用，能够对干腐病有一定的预防作用。

表5不同浓度植物源提取物对马铃薯块茎的保护作用