本发明属于农药领域，涉及一种微生物农药，具体来说涉及一种防治柑橘树脚腐病的生物农药，及其制备方法。
背景技术：
：目前，农业上对植物病虫害的防治方法主要是化学防治方法，化学防治容易引起抗药性产生，大量使用时会造成农药残留物超标，危害人类及其他生物的生存，引起环境污染，破坏生态平衡。化学农药的广泛应用使公众越来越担心其安全性和对环境造成的污染问题。随着人们环保意识的增强和对绿色无公害农产品需求的扩大，使得植物病害的生物防治越来越受到人们的关注，生物防治因其具有对环境、生态和人类健康安全的优点，在世界各国得到了厂泛的重视并发挥着越来越重要的作用。生物农药是指用来防治农林牧业有害生物的生物活体及其代谢产物和转基因产物，一般分为生物体农药和生物化学农药两大类，其中生物体农药又分为动物体农药、植物体农药和微生物体农药：生物化学农药又分为动物源生物化学农药、植物源生物化学农药和微生物源生物化学农药等。目前，利用生物农药防治植物病害是当今植病界十分活跃的研究领域之一，并已显示出良好的应用前景。生物农药是公认的很有前途的生防因子。生物农药以其种类和数量众多、分布广泛、作用方式多样、对非靶标生物安全及不污染环境等优点而倍受重视。在国内外的研究中，利用生物农药防治植物病害特别是土传病害的报道很多且都取得了良好的效果。柑橘树脚腐病，又名裙腐病、烂蔸病、褐腐病，该病可由多种疫霉属真菌侵入引起。在柑橘老产区，感病后的树体树势衰退，产量急剧下降，而且造成柑橘植株的大量死亡，严重影响柑橘产量和果品质量，已成为生产上的一种常见病害。脚腐病主要发生于主干基部，引起皮层腐烂。发病初期，病部树皮呈水渍状，有酒糟气味，颜色变褐常渗出褐色胶液。气候干燥时，病斑干裂。温暖潮湿时，病部不断向纵横扩展，向下蔓延至根群，向上蔓延一般不超过离地面30厘米，横向扩展，浩成环割，最终导致植株死亡。病树部分大枝上或整个树冠叶片的中脉及侧脉呈黄色，引起叶落、枝枯，树势衰弱，开花多，花期短，结果少，所结的果实着色早，皮粗味酸。果实发病时，先为圆形的淡褐色病斑，后渐变成褐色水渍状。病健部分界明显，只侵染白皮层，不烂及果肉。干燥时病斑干韧，手指按下稍有弹性；潮湿时则呈水渍状软腐，长出白色菌丝，有腐臭味。发病严重的果实不久即脱落。目前柑橘树脚腐病在生产上主要以化学药剂防治为主，采用化学药剂防治容易造成农药在土壤和作物上的残留，对土壤、地下水、河流、湖泊造成污染，尤其是给人类的生存、发展和健康带来危害。化学农药的大量使用也使病菌对常用药剂产生了一定的抗药性，使其防治效果不断下降。所以必须寻找新的途径以克服化学药剂防治带来的农药残留和病菌抗药性等问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种防治柑橘树脚腐病的生物农药，该生物农药具有安全、环境友好等特点，防治柑橘树脚腐病效果好，降低了多菌灵的使用次数，减少对多菌灵的抗性药。为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种防治柑橘树脚腐病的生物农药，由木霉菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、细黄连霉菌发酵液及中药提取物制备而成，所述中药提取物为金钱柳、花椒和马鞭草的提取物。本发明的生物农药是将拮抗细菌发酵液与中药提取物按一定比例制成微生物农药，具有防效好、安全、环境友好等特点，降低了化学农药的使用次数，减少抗性药，是生产绿色食品所必须的生物农药。进一步，所述的防治柑橘树脚腐病的生物农药，所述中药提取物为金钱柳、花椒和马鞭草的水提取物，所述金钱柳、花椒和马鞭草的重量比为1-2：1-2：1-2；所述中药提取物由下述制备方法制得：取花椒、马鞭草和金钱柳干品混合得中药混合物，加入中药混合物重量3-5倍的水浸泡1-3小时，90-100℃保持10-30分钟，自然冷却，过滤弃残渣，得滤液即为中药提取物。优选的，所述金钱柳、花椒和马鞭草的重量比为1：1：1。进一步，所述的防治柑橘树脚腐病的生物农药，所述生物农药由以下重量百分比的组份组成：木霉菌发酵液200-300倍稀释液5％-10％；枯草芽孢杆菌发酵液200-300倍稀释液10％-25％；细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液10％-25％；金钱柳、花椒和马鞭草的提取物3％-5％；及余量的水。进一步，所述的防治柑橘树脚腐病的生物农药，所述生物农药由以下重量百分比的组份组成：木霉菌发酵液200-300倍稀释液6％-8％；枯草芽孢杆菌发酵液200-300倍稀释液15％-23％；细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液12％-20％；金钱柳、花椒和马鞭草的提取物3.5％-4.5％；及余量的水。更进一步，所述的防治柑橘树脚腐病的生物农药，所述生物农药由以下重量百分比的组份组成：木霉菌发酵液200-300倍稀释液7％；枯草芽孢杆菌发酵液200-300倍稀释液18％；细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液15％；金钱柳、花椒和马鞭草的提取物4％；及余量的水。本发明还提供了一种防治柑橘树脚腐病的生物农药的制备方法，包括如下进行的步骤：(1)分别取木霉菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、细黄连霉菌发酵液根据需要进行稀释得木霉菌发酵液稀释液、枯草芽孢杆菌发酵液稀释液、细黄连霉菌发酵液稀释液；(2)取所需量的木霉菌发酵液稀释液，然后将所需量的枯草芽孢杆菌发酵液稀释液和细黄连霉菌发酵液稀释液加入到木霉菌发酵液稀释液中得到培养液A；(3)将所需量的中药提取物加入所需量的水中，混合均匀，加热煮沸30-45min，自然冷却至室温得到培养液B；(4)将培养液A和培养液B混合搅拌均匀后30℃-50℃放置48h以上，即得到防治柑橘树脚腐病的生物农药。进一步，所述的防治柑橘树脚腐病的生物农药的制备方法，所述步骤(4)中，所述搅拌方式应同一方向匀速搅拌。本发明的防治柑橘树脚腐病的生物农药，其中木霉菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、细黄连霉菌发酵液可以是采用本领域任何常规方法生产所得，也可以购买商业成品直接使用。在本发明的一个具体实施例中，所述的木霉菌发酵液的制备方法为：取固体琼脂平板培养基，将木霉菌接种于固体琼脂平板培养基，在25-35℃下培养30-80小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在25-35℃下在摇床中培养20-30小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌液体培养基内，25-35℃下在摇床中60-80小时得木霉菌发酵液；种子液与液体培养基的重量份数比为l：8-20。在本发明的一个具体实施例中，所述的枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法为：取固体琼脂平板培养基，将枯草芽孢杆菌接种于固体琼脂平板培养基，在25-35℃下培养30-80小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在25-35℃下在摇床中培养20-30小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌培养基内，25-30℃下在摇床中60-80小时得枯草芽孢杆菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为l：8-20。在本发明的一个具体实施例中，所述的细黄连霉菌发酵液的制备方法为：取固体琼脂平板培养基，将细黄连霉菌接种于固体琼脂平板培养基，在25-35℃下培养30-80小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在25-35℃下在摇床中培养20-30小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌培养基内，25-30℃下在摇床中60-80小时得细黄连霉菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为l：8-20。木霉菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、细黄连霉菌发酵液之后可根据需要加灭菌水进行稀释。进一步，所述固体琼脂平板培养基按重量份计由以下组分制备而成：胰蛋白胨1-2份，酵母提取物0.5-1份，氯化钠0.5-1份，琼脂1-1.5份，水800-1000份；所述固体琼脂平板培养基pH为7-7.5。制备方法为：将各组分加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7-7.5，过滤，装瓶封口后进行湿热灭菌，无菌操作倒入平板，冷却至室温得固体培养基。进一步，所述固体琼脂平板培养基中的菌种接种量为0.001-0.005份。进一步，所述液体培养基按重量份计由以下组分制备而成：淀粉10-30份，牛肉膏10-30份，蛋白胨10-30份，NaCl4-8份，水1000-3000份；所述液体培养基pH为7-7.5。制备方法为：将各组分加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7-7.5，过滤，装瓶封口后进行湿热灭菌，冷却至室温得液体培养基。进一步，所述的湿热灭菌是装瓶封口的培养基放入高压蒸汽灭菌锅内，于0.8-1.05kg/cm2，115-130℃条件下，湿热灭菌15-30min。本发明还提供了一种防治柑橘树脚腐病的生物农药的优选的使用方法，在果实幼果期喷施，使用浓度100倍，具有保护作用。果实生长期和其他防治措施结合使用，使用浓度100倍，减少化学药剂抗性药，减少农药残留。本发明的有益效果在于：(1)本发明的防治柑橘树脚腐病的生物农药，是将拮抗细菌发酵液与中药提取物按一定比例制成(微)生物农药，具有防效好、安全、环境友好等特点，降低了化学农药的使用次数，减少抗性药，是生产绿色食品所必须的生物农药。(2)本发明的防治柑橘树脚腐病的生物农药的制备方法，操作简单，对环境友好，适于大规模生产。具体实施方式所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，还包括各具体实施方式间的任意组合，仍属于本发明的保护范围。第一部分防治柑橘树脚腐病的生物农药实施例1固体琼脂平板培养基的制备：1份胰蛋白胨，0.5份酵母提取物，0.5份氯化钠，1份琼脂，水800份，将各组分加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7，过滤，装瓶封口后放入高压蒸汽灭菌锅内，0.8kg/cm2，115℃，湿热灭菌15min，无菌操作倒入平板，冷却至室温得固体培养基。液体培养基的制备：取淀粉10份，牛肉膏10份，蛋白胨10份，NaCl4份，水1000份；加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7，过滤，装瓶封口后放入高压蒸汽灭菌锅内，0.8kg/cm2，115℃，湿热灭菌15min，冷却至室温得液体培养基。木霉菌发酵液的制备方法如下：取固体琼脂平板培养基，将木霉菌接种于固体琼脂平板培养基，接种菌为0.001份，在25℃下培养30小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在25℃下在摇床中培养20小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌液体培养基内，25℃下在摇床中60小时得木霉菌发酵液；种子液与液体培养基的重量份数比为l：8。枯草芽抱杆菌发酵液的制备方法如下：取固体琼脂平板培养基，将枯草芽孢杆菌接种于固体琼脂平板培养基，接种菌为0.001份，在25℃下培养30小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在25℃下在摇床中培养20小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌培养基内，25℃下在摇床中60小时得枯草芽孢杆菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为l：8。细黄连霉菌发酵液的制备方法如下：取固体琼脂平板培养基，将细黄连霉菌接种于固体琼脂平板培养基，接种菌为0.001份，在25℃下培养30小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在25℃下在摇床中培养20小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌培养基内，25℃下在摇床中60小时得细黄连霉菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为l：8。花椒提取物、马鞭草提取物和金钱柳提取物是由下述制备方法制得：取等量花椒、马鞭草和金钱柳干品各1份，加水10份浸泡2小时后，100℃保持10分钟，自然冷却，过滤弃残渣，得滤液即可。防治柑橘树脚腐病的生物农药的配方：木霉菌发酵液200倍稀释液5％；枯草芽抱杆菌发酵液200倍稀释液10％；细黄连霉菌发酵液200倍稀释液10％；金钱柳、花椒和马鞭草提取物3％；水余量。防治柑橘树脚腐病的生物农药的制备方法：(1)分别取木霉菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、细黄连霉菌发酵液，加入灭菌水稀释至所需倍数，得木霉菌发酵液稀释液、枯草芽孢杆菌发酵液稀释液、细黄连霉菌发酵液稀释液；(2)取所需量的木霉菌发酵液稀释液，然后将所需量的枯草芽孢杆菌发酵液稀释液和细黄连霉菌发酵液稀释液加入到木霉菌发酵液稀释液中得到培养液A；(3)将所需量的马鞭草提取物、金钱柳提取物、花椒提取物及余下的水混合均匀加热煮沸30-45min，自然冷却至室温得到培养液B；(4)将培养液A和培养液B混合搅拌均匀后30℃-50℃放置48h以上，即得到防治柑橘树脚腐病的生物农药。实施例2固体琼脂平板培养基的制备：1.5份胰蛋白胨，0.6份酵母提取物，0.6份氯化钠，1.5份琼脂，水1000份，将各组分加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7.5，过滤，装瓶封口后放入高压蒸汽灭菌锅内，0.9kg/cm2，120℃，湿热灭菌25min，无菌操作倒入平板，冷却至室温得固体培养基。液体培养基的制备：取淀粉20份，牛肉膏20份，蛋白胨20份，NaCl5份，水2000份；加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7.5，过滤，装瓶封口后放入高压蒸汽灭菌锅内，0.9kg/cm2，120℃，湿热灭菌25min，冷却至室温得液体培养基。木霉菌发酵液的制备方法如下：取固体琼脂平板培养基，将木霉菌接种于固体琼脂平板培养基，接种菌为0.002份，在30℃下培养36小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在30℃下在摇床中培养24小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌液体培养基内，30℃下在摇床中72小时得木霉菌发酵液；种子液与液体培养基的重量份数比为l：15。枯草芽抱杆菌发酵液的制备方法如下：取固体琼脂平板培养基，将枯草芽孢杆菌接种于固体琼脂平板培养基，接种菌为0.002份，在30℃下培养36小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在35℃下在摇床中培养24小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌培养基内，30℃下在摇床中72小时得枯草芽孢杆菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为l：9。细黄连霉菌发酵液的制备方法如下：取固体琼脂平板培养基，将细黄连霉菌接种于固体琼脂平板培养基，接种菌为0.002份，在25℃下培养36小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在30℃下在摇床中培养24小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌培养基内，35℃下在摇床中70小时得细黄连霉菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为l：18。花椒提取物、马鞭草提取物和金钱柳提取物是由下述制备方法制得：取等量花椒、马鞭草和金钱柳干品各1份，加水15份浸泡2小时后，100℃保持20分钟，自然冷却，过滤弃残渣，得滤液即可。防治柑橘树脚腐病的生物农药的配方：木霉菌发酵液250倍稀释液10％；枯草芽抱杆菌发酵液200倍稀释液15％；细黄连霉菌发酵液300倍稀释液15％；金钱柳、花椒和马鞭草提取物4％；水余量。防治柑橘树脚腐病的生物农药的制备方法：(1)分别取木霉菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、细黄连霉菌发酵液，加入灭菌水稀释至所需倍数，得木霉菌发酵液稀释液、枯草芽孢杆菌发酵液稀释液、细黄连霉菌发酵液稀释液；(2)取所需量的木霉菌发酵液稀释液，然后将所需量的枯草芽孢杆菌发酵液稀释液和细黄连霉菌发酵液稀释液加入到木霉菌发酵液稀释液中得到培养液A；(3)将所需量的马鞭草提取物、金钱柳提取物、花椒提取物及余下的水混合均匀加热煮沸40min，自然冷却至室温得到培养液B；(4)将培养液A和培养液B混合搅拌均匀后35℃放置48h以上，即得到防治柑橘树脚腐病的生物农药。第二部分生物农药对柑橘树脚腐病的防治效果验证为了证明本发明的生物农药对柑橘树脚腐病的效果进行了多次试验，防治效果较好，下述实验中所用生物农药是采用实施例1的方法制备的，另外，还做了三组平行对照试验，对照A的生物农药配方不含木霉菌发酵液，对照B的生物农药配方不含枯草芽抱杆菌发酵液，对照C的生物农药配方不含细黄连霉菌发酵液，其余同实施例1。每组田间实验4年总计实验示范400棵有腐烂病的柑橘树，每棵树只喷施一次。试验结果如表1-4：实验结果表明，本发明对柑橘腐烂病当年治愈率为97-100％，次年有3-4棵柑橘树脚腐病复发，平均复发率为3.57％，最高复发率为4.12％，最低复发率为3.06％。表1本发明的生物农药田间试验结果年份病树当年治愈治愈率次年复发复发率20131009797％44.12％20141009898％33.06％20151009797％33.09％2016100100100％44.00％平均1009898％3.53.57％总计40039298％143.57％表2对照A的生物农药田间试验结果年份病树当年治愈治愈率次年复发复发率20131007878％810.26％20141007474％79.46％20151007676％79.21％20161007272％68.33％平均1007575％79.33％总计40030075％289.33％表3对照B的生物农药田间试验结果年份病树当年治愈治愈率次年复发复发率20131008686％55.81％20141008585％67.06％20151008787％55.75％20161008585％55.88％平均10085.7585.75％5.256.12％总计40034385.75％216.12％表4对照C的生物农药田间试验结果年份病树当年治愈治愈率次年复发复发率20131008383％67.23％20141007979％78.86％20151008282％78.54％20161008181％67.41％平均10081.2581.25％6.58.00％总计40032581.25％268.00％结合上述试验，本发明的生物农药田间实验结果表明有下述特点：本发明农药治愈率高，复发率低。本发明对柑橘腐烂病当年治愈率为97-100％，次年有3-4棵柑橘树脚腐病复发，平均复发率为3.57％，最高复发率为4.12％，最低复发率为3.06％。本发明无需多次喷施，每个病患处只需一次就可康复。本发明农药无污染，适合于绿色食品生产，有利于提高果品品质。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页1 2 3