本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种适于离体保存过程中蕨类孢子灭菌方法及接种，
背景技术：
我国的蕨类资源十分丰富，约有2600种，占全世界的1/5，其中很多是中国特有。蕨类植物不仅在生物进化和植物系统发育的研究中起着重要作用，也与人类生活联系密切，许多蕨类植物在药用、观赏等众多方面具有重要价值。可见，关于蕨类的商品化生产和栽培育种的开发具有广阔前景。蕨类植物组织培养过程中，以孢子作为外植体进行组织培养具有不损害母株、繁殖系数大等优点，是蕨类植物生产上使用最广泛的繁殖途径。蕨类孢子非常微小，呈粉尘状，在进行无菌播种时，常用的方法有滤纸包裹或置于离心管等器皿中，再用次氯酸钠或氯化汞消毒，无菌水多次冲洗后接种。由于蕨类孢子过于微小，在多个物种同时接种时，包裹法容易将孢子漏出造成混种，而多层的滤纸包裹又可能导致灭菌不充分；而离心灭菌法的操作过程中，其废液去除困难，容易将孢子吸走，或因消毒液残留而潜在延长灭菌时间，进而导致孢子失活。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，借助当前普遍可得的DNA纯化柱(包含吸附柱和收集管)提供一种操作简便，效率高，适于离体保存过程中的蕨类孢子灭菌及接种方法。
为实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案：
收集孢子，把蕨类孢子叶装入硫酸纸袋中，标记代号后置于通风干燥处，待孢子自由脱落；把DNA纯化柱(规格：吸附柱1ml，收集管2ml)、1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20-30min备用；用对折过的硫酸纸收集脱落在纸袋中的孢子，简单的去除碎叶、环带、鳞毛等杂质后沿着折痕倒入已灭菌的吸附柱中，盖好盖子，放入收集管中，并做好标记，放置于离心管架上；在无菌条件下，加入600μl 75％乙醇，倒立纯化柱1-2次，之后200-1200rpm离心20s。从加乙醇开始，直到完成离心，整个操作过程控制在30s左右；倒弃收集管中废液，在无菌条件下加入600μl无菌水，反复吸打溶液使孢子悬浊，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm离心20s，重复1-2次，洗脱乙醇；倒弃收集管中废液，在无菌条件下加入600μl 0.1-0.2％氯化汞灭菌2-4min或2％次氯酸钠消毒6-8min，反复吸打溶液使孢子悬浊充分灭菌，然后200-1200rpm离心20s；倒弃收集管中废液，在无菌条件下加入600μl无菌水，反复吸打使孢子悬浊，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm离心20s，此操作重复3-4次，使消毒液彻底洗脱；再向离心之后的吸附柱中添加600μl无菌水，反复吸打使之呈孢子悬浊液，吸取100μl孢子悬浊液接种到培养基上，实现接种。
一种蕨类孢子的消毒及接种方法，该方法包括下述步骤：
步骤1：收集孢子，把蕨类孢子叶片装入硫酸纸袋中，标记代号后置于通风干燥处，等孢子自由脱落；
步骤2：把DNA纯化柱，规格：吸附柱1ml，收集管2ml、1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20-30min备用；
步骤3：在对折过的硫酸纸片上铺一层擦镜纸，把自由脱落在硫酸纸袋中的孢子倒在擦镜纸上，轻微抖动擦镜纸进行简单的过滤，孢子可以通过擦镜纸的孔隙，而碎叶、环带、鳞毛等杂质会留在擦镜纸上达到简单过滤的目的，然后把过滤后的孢子沿着折痕倒入已灭菌的吸附柱中，盖好盖子，放入收集管中，做好标记，放置于离心管架上；
步骤4：在无菌操作台上，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 75％乙醇，盖好盖子消毒30s，期间倒立纯化柱1-2次，在孢子消毒的同时，吸附柱内部也得到灭菌，然后200-1200rpm离心20s，加乙醇，倒立纯化柱，离心完成尽量控制在30s内；
步骤5：取出吸附柱，倒弃收集管中废液。吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl无菌水，反复吸打溶液充分漂洗孢子，然后200-1200rpm离心20s，重复1-2次；
步骤6：取出吸附柱，倒弃收集管中废液，吸附柱放回收集管中，放置于离心管架，在无菌操作台中，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 0.1-0.2％氯化汞灭菌2-4min或2％次氯酸钠消毒6-8min，反复吸打溶液使孢子悬浊充分灭菌，然后200-1200rpm离心20s；
步骤7：取出吸附柱，倒弃收集管中废液，吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上，在无菌操作台中，打开吸附柱盖，此时吸附柱及孢子已经过乙醇，氯化汞或次氯酸钠消毒处于无菌状态，用1ml移液枪加入600μl无菌水，反复吸打使孢子悬浊，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm离心20s；
步骤8：重复步骤7，3-4次；
步骤9：用1ml移液枪取600μl无菌水加入吸附柱中，反复吸打使之呈孢子悬浊液，吸取100μl孢子悬浊液接种到培养基上；
步骤10：把培养物移到温度25±2℃暗培养3-5天，再移至光照条件培养2周后孢子萌发。
所述的一种蕨类孢子的消毒及接种方法在蕨类离体保存过程中的应用。
与现有技术相比，本发明所具备的优益性在于：
1.本发明对蕨类植物生物进化和植物系统发育的研究中起着重要作用，也与人类生活联系密切，许多蕨类植物在药用、观赏等众多方面具有重要价值。本发明对蕨类的商品化生产和栽培育种的开发的提供了科学性强的可操作的消毒及接种方法。
2.蕨类植物组织培养过程中，以孢子作为外植体进行组织培养具有不损害母株、繁殖系数大等优点，是蕨类植物生产上使用最广泛的繁殖途径。蕨类孢子非常微小，呈粉尘状，在进行无菌播种时，常用的方法有滤纸包裹或置于离心管等器皿中，再用次氯酸钠或氯化汞消毒，无菌水多次冲洗后接种。由于蕨类孢子过于微小，在多个物种同时接种时，包裹法容易将孢子漏出造成混种，而多层的滤纸包裹又可能导致灭菌不充分；而离心灭菌法的操作过程中，其废液去除困难，容易将孢子吸走，或因消毒液残留而潜在延长灭菌时间，进而导致孢子失活。本发明克服了蕨类植物包裹法和离心灭菌法存在的不足。
3.本发明克服了蕨类植物孢子在消毒过程中易出现的灭菌不充分、混种及消毒液残留的问题，可有效降低污染率，提高接种效率。
4.本发明能高效地进行微量的蕨类孢子的消毒和接种，实验器材易得、成本低廉、操作方便、接种效率高。
具体实施方式
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
1、材料：金毛狗Cibotiumbarometz(Linnaeus)J.Smith。
2、实验器材：超净台、离心机、离心管架、DNA纯化柱、移液枪、1ml枪头、灭菌锅
3、操作步骤：
步骤1：收集孢子，把金毛狗长有孢子的叶片装入硫酸纸袋中，标记代号后置于通风干燥处，等孢子自由脱落。
步骤2：把DNA纯化柱(规格：吸附柱1ml，收集管2ml)、1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20-30min备用。
步骤3：在对折过的硫酸纸片上铺一层擦镜纸，把自由脱落在硫酸纸袋中的孢子倒在擦镜纸上，轻微抖动擦镜纸进行简单的过滤，孢子可以通过擦镜纸的孔隙，而碎叶、环带、鳞毛等杂质会留在擦镜纸上达到简单过滤的目的。然后把过滤后的孢子沿着折痕倒入已灭菌的吸附柱中，盖好盖子，放入收集管中，做好标记，放置于离心管架上。
步骤4：在无菌操作台上，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 75％乙醇，盖好盖子消毒30s，期间倒立纯化柱1-2次，在孢子消毒的同时，吸附柱内部也得到灭菌，然后200-1200rpm离心20s。加乙醇，倒立纯化柱，离心完成尽量控制在30s内。
步骤5：取出吸附柱，倒弃收集管中废液。吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl无菌水，反复吸打溶液充分漂洗孢子，然后200-1200rpm离心20s。重复1-2次。
步骤6：取出吸附柱，倒弃收集管中废液，吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 0.1-0.2％氯化汞灭菌2-4min，反复吸打溶液使孢子悬浊充分灭菌，然后200-1200rpm离心20s。
步骤7：取出吸附柱，倒弃收集管中废液，吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，此时吸附柱及孢子已经过乙醇，氯化汞或次氯酸钠消毒处于无菌状态，用1ml移液枪加入600μl无菌水，反复吸打使孢子悬浊，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm离心20s。
步骤8：重复步骤7，3-4次。
步骤9：用1ml移液枪取600μl无菌水加入吸附柱中，反复吸打使之呈孢子悬浊液，吸取100μl孢子悬浊液接种到培养基上。
步骤10：把培养物移到温度25±2℃暗培养3-5天，再移至光照条件培养一周后孢子萌发。
实施例2：
1、材料：三色凤尾蕨Pterisaspericaulis var.tricolor(Linden)T.Moore ex E.J.Lowe。
2、实验器材：超净台、离心机、离心管架、DNA纯化柱、移液枪、1ml枪头、灭菌锅
3、操作步骤：
步骤1：收集孢子，把三色凤尾蕨的孢子叶片装入硫酸纸袋中，标记代号后置于通风干燥处，等孢子自由脱落。
步骤2：把DNA纯化柱(规格：吸附柱1ml，收集管2ml)、1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20-30min备用。
步骤3：在对折过的硫酸纸片上铺一层擦镜纸，把自由脱落在硫酸纸袋中的孢子倒在擦镜纸上，轻微抖动擦镜纸进行简单的过滤，孢子可以通过擦镜纸的孔隙，而碎叶、环带、鳞毛等杂质会留在擦镜纸上达到简单过滤的目的。然后把过滤后的孢子沿着折痕倒入已灭菌的吸附柱中，盖好盖子，放入收集管中，做好标记，放置于离心管架上。
步骤4：在无菌操作台上，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 75％乙醇，盖好盖子消毒30s，期间倒立纯化柱1-2次，在孢子消毒的同时，吸附柱内部也得到灭菌，然后200-1200rpm离心20s。加乙醇，倒立纯化柱，离心完成尽量控制在30s内。
步骤5：取出吸附柱，倒弃收集管中废液。吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl无菌水，反复吸打溶液充分漂洗孢子，然后200-1200rpm离心20s。重复1-2次。
步骤6：取出吸附柱，倒弃收集管中废液，吸附柱放回收集管中，放置于离心管架。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 0.1-0.2％氯化汞灭菌2-4min或2％次氯酸钠消毒6-8min，反复吸打溶液使孢子悬浊充分灭菌，然后200-1200rpm离心20s。
步骤7：取出吸附柱，倒弃收集管中废液，吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，此时吸附柱及孢子已经过乙醇，氯化汞或次氯酸钠消毒处于无菌状态，用1ml移液枪加入600μl无菌水，反复吸打使孢子悬浊，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm离心20s。
步骤8：重复步骤7，3-4次。
步骤9：用1ml移液枪取600μl无菌水加入吸附柱中，反复吸打使之呈孢子悬浊液，吸取100μl孢子悬浊液接种到培养基上。
步骤10：把培养物移到温度25±2℃暗培养3-5天，再移至光照条件培养2周后孢子萌发。