本发明涉及棉花病虫害防治技术领域，尤其涉及一种棉花病害生物防治方法。
背景技术：
植物病害是影响我国农业生产的最主要的因素，对生产生活产生严重的威胁。棉花是我国较为重要的经济作物，但是随着棉花病害的威胁逐渐增加，带来了严重的经济损失。全国每年因病害的损失价值达到数十亿。棉花的病害的种类多种多样，无论是在幼苗期、成长期还是成熟期都有相应的病害发生。当棉花的幼苗成株时，在这期间最容易出现的主要是枯萎病和黄萎病。为了减少病害降低经济损失，农民开始大量的使用化学农药，虽然得到了一定的效果，但是由于化学农药的大量使用，对环境产生的污染也就逐渐严重。因此科研人员开始寻一种对人类和环境无害并具良好防治效果的新的植物病虫害防治策略。
国家知识产权局于2015年8月26日公布的一篇专利申请号为201510191999.7，名称：一种华南地区棉花苗期的病害防治方法，此专利提出如下技术方案：首先将棉种进行消毒处理，将土壤消毒剂加入消毒后的棉种中并搅拌均匀，将搅拌均匀的棉种播撒在田间，待棉种出苗后及时喷洒农药。化学防治方法存在如下的技术问题：其一，在防止时期，向棉苗长期喷洒化学药剂，一方面使病原菌产生了严重的抗逆性，导致喷洒的化学药剂毫无效果，另一方面喷洒的大量化学药剂污染了环境，不利于环保；其二，该化学药剂中含有大量的重金属，会对土壤和水资源造成重金属污染。这两个问题大大限制了该防治方法的使用范围，因此，该防治方法难以在棉花病虫害防治领域推广和使用。
传统的防治方法大多是喷洒化学药剂，虽然达到了一定的效果，但是病原菌产生了严重的抗逆性，这样不但效果没了而且也严重污染了环境。因此，科研人员开始寻一种对人类和环境无害并具良好防治效果的新的植物病虫害防治策略。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种对环境无污染、防止效果良好且成本低的棉花病害生物防治方法。本发明通过发酵培养甲基营养芽孢杆菌，并结合整体的制备方法来实现对棉花的生物防治，从而不会对环境造成污染。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种棉花病害生物防治方法，具体步骤如下：
(1)选取籽粒饱满、纯度高的棉种置于45～50℃的水中浸泡3～4h，并上下搅拌均匀，棉种与水的重量比为1：2～3；
(2)将步骤(1)中浸泡完成的棉种捞起晾干后播种在装有营养土的盆中，并浇适量的水保持营养土湿润；
(3)移取50μL的甲基营养芽孢杆菌置于100mL的液体LB培养基中，将LB培养基在转速为100～200r/min、温度为35～40℃的条件下，摇床培养20～30h，即得菌悬液；
(4)移取步骤(3)中所制备的菌悬液置于无菌的离心管中，用灭菌后的牙签蘸取离心管中的菌液在LB平板上“之”字划线，并将LB平板置于37℃的恒温培养箱中培养12～20h，即得单菌落；
(5)用接种环挑取步骤(4)中所制备的单菌落置于装有100～200mL摇瓶发酵培养基的三角瓶中，三角瓶在温度为37℃的条件下摇床发酵24～36h，即得发酵液；
(6)量取步骤(5)中所制备的发酵液置于离心管中，离心管在转速为8000r/min的条件下离心20～30min，即得上清液和沉淀，除去沉淀，即得上清液；将上清液用超滤膜过滤，即得甲基营养芽孢杆菌发酵液，备用；
(7)待步骤(2)中棉种发芽后棉苗长至15～20cm时，将步骤(6)中所制备的甲基营养芽孢杆菌发酵液喷洒在棉苗上，其后适量浇水，保持盆土湿润。
进一步地，所述步骤(2)中营养土的成分为泥炭、椰糠、珍珠岩和控释肥。
进一步地，所述营养土的体积占盆容积的3/4。
进一步地，所述步骤(3)中LB培养基的成分及配比：氯化钠1g、蛋白胨1g、酵母菌0.5g、琼脂1.7g、去离子水100mL。
进一步地，所述步骤(6)中采用截留分子量为100～120kDa的超滤膜。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
(1)本发明中使用甲基营养芽孢杆菌进行发酵培养，该菌种对人畜无害、对环境友好、具有较强的抗逆性且繁殖速度快等优点，因此具有良好的应用前景；本发明中甲基营养芽孢杆菌在生长过程中产生的细胞壁降解酶类、细菌素类、抗生素类等抗菌活性物质可以抑制病原微生物活动使其失活，不会对环境造成污染，有利于环保，因此，该防止方法具有良好的防治效果，从而保证棉苗的健康生长。
(2)本发明中将甲基营养芽孢杆菌发酵液喷洒在棉苗上，该菌种还能产生类似细胞分裂素、植物生长激素等物质，促进棉花的生长，从而提高棉花的产量，增加种植户的经济效益。
(3)本发明中采用甲基营养芽孢杆菌进行生物防治，一方面避免了化学药剂对人畜的危害，另一方促进了环境生态平衡，实现了农业的可持续发展，该防治方法适合在种植领域推广和使用。
(4)本发明中营养土的成分为泥炭、椰糠、珍珠岩和控释肥，该营养土具有良好的保肥性、持水性和透气性以及适合根系生长的pH值，该营养土可以改善土壤理化性状和微生物环境，促进棉花的正常生长及发育，从而增加种植户的经济效益；本发明中采用截留分子量为100～120kDa的超滤膜，采用该超滤膜可以滤去残余菌体，从而保证了甲基营养芽孢杆菌发酵液的纯度。
综上所述，本发明中的防治方法对人畜无害，也不会污染环境，促进了农业的可持续发展，适合在棉花病害防治领域推广和使用。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
一种棉花病害生物防治方法，具体步骤如下：
(1)选取籽粒饱满、纯度高的棉种置于45℃的水中浸泡3h，并上下搅拌均匀，棉种与水的重量比为1：2；
(2)将步骤(1)中浸泡完成的棉种捞起晾干后播种在装有营养土的盆中，并浇适量的水保持营养土湿润；
(3)移取50μL的甲基营养芽孢杆菌置于100mL的液体LB培养基中，将LB培养基在转速为100r/min、温度为35℃的条件下，摇床培养20h，即得菌悬液；
(4)移取步骤(3)中所制备的菌悬液置于无菌的离心管中，用灭菌后的牙签蘸取离心管中的菌液在LB平板上“之”字划线，并将LB平板置于37℃的恒温培养箱中培养12h，即得单菌落；
(5)用接种环挑取步骤(4)中所制备的单菌落置于装有100mL摇瓶发酵培养基的三角瓶中，三角瓶在温度为37℃的条件下摇床发酵24h，即得发酵液；
(6)量取步骤(5)中所制备的发酵液置于离心管中，离心管在转速为8000r/min的条件下离心20min，即得上清液和沉淀，除去沉淀，即得上清液；将上清液用超滤膜过滤，即得甲基营养芽孢杆菌发酵液，备用；
(7)待步骤(2)中棉种发芽后棉苗长至15cm时，将步骤(6)中所制备的甲基营养芽孢杆菌发酵液喷洒在棉苗上，其后适量浇水，保持盆土湿润。
在本实施例中，所述步骤(2)中营养土的成分为泥炭、椰糠、珍珠岩和控释肥。
在本实施例中，所述营养土的体积占盆容积的3/4。
在本实施例中，所述步骤(3)中LB培养基的成分及配比：氯化钠1g、蛋白胨1g、酵母菌0.5g、琼脂1.7g、去离子水100mL。
在本实施例中，所述步骤(6)中采用截留分子量为100kDa的超滤膜。
实施例2
一种棉花病害生物防治方法，具体步骤如下：
(1)选取籽粒饱满、纯度高的棉种置于50℃的水中浸泡4h，并上下搅拌均匀，棉种与水的重量比为1：2.5；
(2)将步骤(1)中浸泡完成的棉种捞起晾干后播种在装有营养土的盆中，并浇适量的水保持营养土湿润；
(3)移取50μL的甲基营养芽孢杆菌置于100mL的液体LB培养基中，将LB培养基在转速为150r/min、温度为40℃的条件下，摇床培养25h，即得菌悬液；
(4)移取步骤(3)中所制备的菌悬液置于无菌的离心管中，用灭菌后的牙签蘸取离心管中的菌液在LB平板上“之”字划线，并将LB平板置于37℃的恒温培养箱中培养18h，即得单菌落；
(5)用接种环挑取步骤(4)中所制备的单菌落置于装有150mL摇瓶发酵培养基的三角瓶中，三角瓶在温度为37℃的条件下摇床发酵30h，即得发酵液；
(6)量取步骤(5)中所制备的发酵液置于离心管中，离心管在转速为8000r/min的条件下离心25min，即得上清液和沉淀，除去沉淀，即得上清液；将上清液用超滤膜过滤，即得甲基营养芽孢杆菌发酵液，备用；
(7)待步骤(2)中棉种发芽后棉苗长至20cm时，将步骤(6)中所制备的甲基营养芽孢杆菌发酵液喷洒在棉苗上，其后适量浇水，保持盆土湿润。
在本实施例中，所述步骤(2)中营养土的成分为泥炭、椰糠、珍珠岩和控释肥。
在本实施例中，所述营养土的体积占盆容积的3/4。
在本实施例中，所述步骤(3)中LB培养基的成分及配比：氯化钠1g、蛋白胨1g、酵母菌0.5g、琼脂1.7g、去离子水100mL。
在本实施例中，所述步骤(6)中采用截留分子量为110kDa的超滤膜。
实施例3
一种棉花病害生物防治方法,具体步骤如下：
(1)选取籽粒饱满、纯度高的棉种置于50℃的水中浸泡4h，并上下搅拌均匀，棉种与水的重量比为1：3；
(2)将步骤(1)中浸泡完成的棉种捞起晾干后播种在装有营养土的盆中，并浇适量的水保持营养土湿润；
(3)移取50μL的甲基营养芽孢杆菌置于100mL的液体LB培养基中，将LB培养基在转速为200r/min、温度为40℃的条件下，摇床培养30h，即得菌悬液；
(4)移取步骤(3)中所制备的菌悬液置于无菌的离心管中，用灭菌后的牙签蘸取离心管中的菌液在LB平板上“之”字划线，并将LB平板置于37℃的恒温培养箱中培养20h，即得单菌落；
(5)用接种环挑取步骤(4)中所制备的单菌落置于装有200mL摇瓶发酵培养基的三角瓶中，三角瓶在温度为37℃的条件下摇床发酵36h，即得发酵液；
(6)量取步骤(5)中所制备的发酵液置于离心管中，离心管在转速为8000r/min的条件下离心30min，即得上清液和沉淀，除去沉淀，即得上清液；将上清液用超滤膜过滤，即得甲基营养芽孢杆菌发酵液，备用；
(7)待步骤(2)中棉种发芽后棉苗长至20cm时，将步骤(6)中所制备的甲基营养芽孢杆菌发酵液喷洒在棉苗上，其后适量浇水，保持盆土湿润。
在本实施例中，所述步骤(2)中营养土的成分为泥炭、椰糠、珍珠岩和控释肥。
在本实施例中，所述营养土的体积占盆容积的3/4。
在本实施例中，所述步骤(3)中LB培养基的成分及配比：氯化钠1g、蛋白胨1g、酵母菌0.5g、琼脂1.7g、去离子水100mL。
在本实施例中，所述步骤(6)中采用截留分子量为120kDa的超滤膜。
实验结果
以实施例1所制备的甲基营养芽孢杆菌发酵液，做药效总结如下：
1、病例选择
选取感染棉花立枯病、棉花黄萎病的棉苗200株，将200株棉苗分为对照组100株和实验组100株。
2、药物选择
对照组在棉苗长至15～20cm时，向感染棉花立枯病、棉花黄萎病的棉苗喷洒70％甲基托布津可湿性粉剂，观察棉苗的生长状况，并做好相关记录。
实验组在棉苗长至15～20cm时，向感染棉花立枯病、棉花黄萎病的棉苗喷洒喷洒实施例1中制备的甲基营养芽孢杆菌发酵液，观察棉苗的生长状况，并做好相关记录。
3、判断标准
0级：棉苗恢复正常。
1级：1～2片叶子局部发病。
2级：子叶及1～2片真叶局部发病。
3级：真叶发病或脱落仅剩新叶。
4级：棉苗枯死。
4、结果
对照组中有15株棉苗恢复正常，50株棉苗真叶发病，35株棉苗枯死；实验组中61株棉苗恢复正常，30株棉苗的叶子局部发病，9株棉苗枯死。
以上结果显示，本实施例1制备的甲基营养芽孢杆菌发酵液对棉花立枯病、棉花黄萎病均有良好的防止效果且防止效果达到91％，该防止方法对环境无污染，适合在种植领域推广和应用。
综上所述，上述实施方式并非是本发明的限制性实施方式，凡本领域的技术人员在本发明的实质内容的基础上所进行的修饰或者等效变形，均在本发明的技术范畴。