本发明涉及植物组织培养领域。更具体地说，本发明涉及一种岩黄连愈伤组织高效诱导方法。
背景技术：
岩黄连,为罂粟科植物岩黄连(Euphorbia pekinensis Rupr.)，多年生常绿草本，根为圆柱状，长20-30厘米，花期5-8月，果期6-9月。岩黄连广布于全国(除台湾、云南、西藏和新疆)，北方尤为普遍，生于山坡、灌丛、路旁、荒地、草丛、林缘和疏林内。岩黄连根可入药，具有较高的药用价值，具有逐水通便，消肿散结，主治水肿，并有通经之效，用于治疗慢性肾炎，治疗晚期血吸虫病腹水或其他肝硬变腹水等症。近年来其资源遭到了严重破坏，且对生长环境要求苛刻，随着市场需求量的不断增加，野生岩黄连资源濒临枯竭了，生产上难以实现大面积栽培。如何保护野生岩黄连资源并让其大量繁殖是目前急需解决的问题。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决野生岩黄连难以大面积繁殖的问题，并提供至少后面将说明的优点。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种岩黄连愈伤组织高效诱导方法，取岩黄连外植体经洗净消毒后接种至诱导培养基中诱导培养10-15天得到愈伤组织，所述诱导培养基是以B5培养基为基本培养基，还加入6-苄基腺嘌呤0.5-1.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、维生素C 5-20mg/L、活性炭0.1-0.3g/L、蔗糖20-30g/L以及琼脂3.8-4.5g/L，所述诱导培养基的pH值为6.0。
优选的是，将所述愈伤组织接种至增殖培养基中进行增殖培养，所述增殖培养基是以B5培养基为基本培养基，还添加6-苄基腺嘌呤0.1-1.0mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.2-1.0mg/L、维生素C5-20mg/L、活性炭0.1-0.3g/L、蔗糖20-30g/L以及琼脂3.8-4.5g/L，所述增殖培养基的pH值为5.8。
优选的是，所述诱导培养的具体步骤为：将消毒后的所述岩黄连外植体放于温度为23-26℃下，先暗培养1周后，再置于的光照时间为10-12h/d，光照强度1400-2000lux 的条件下培养3-8天。
优选的是，所述增殖培养的条件为：培养温度25±2℃，光照强度1400-2000lux，光照强度为10-12h/d。
优选的是，所述岩黄连外植体洗净消毒方法为：取岩黄连外植体依次用2％清洗剂水溶液浸泡5-10min、线状自来水冲洗5-15min、质量浓度为75％乙醇表面消毒30-45s、质量浓度为0.1％HgCl2消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸吸去表面水分，备用。
优选的是，所述岩黄连外植体为叶片、叶柄，茎中的一种。
优选的是，所述诱导培养基中还加入有水杨酸0.59-0.88mg/L、茉莉酸甲酯0.42-0.79mg/L、精氨酸0.4-1g/L、L-半胱氨酸0.2-0.8g/L以及赖氨酸0.1-0.6g/L。
优选的是，所述增殖培养基中还加入油菜素内酯0.04-0.08mg/L、硼氢化钾7-12mg/L、硫酸亚铁3-6mg/L以及叶酸0.4-0.8mg/L。
本发明至少包括以下有益效果：
(1)6-苄基腺嘌呤一般在诱导培养基中诱导外植体出芽，本发明加入2,4-二氯苯氧乙酸，可以协同6-苄基腺嘌呤加快出芽速度，在愈伤组织增殖过程中，一般用2,4-二氯苯氧乙酸诱导增殖，本发明在增殖培养基中加入6-苄基腺嘌呤，协同2,4-二氯苯氧乙酸诱导愈伤组织快速增殖，本发明可以高效诱导出愈伤组织且能使得愈伤组织快速增殖，从而解决野生岩黄连难以大面积繁殖的问题；
(2)本发明在诱导培养基和增殖培养基中均加入VC，可以防止外植体出芽和愈伤组织发生褐化；
(3)本发明在诱导培养基中加入水杨酸，水杨酸不但可以起到杀菌的作用还能促进芽的生长，茉莉酸甲酯可促进外植体在诱导过程中基因的表达，进而加快诱导过程，精氨酸、L-半胱氨酸以及赖氨酸的加入不但为外植体在诱导过程中提供了营养，而且精氨酸可以促进外植体细胞分裂，L-半胱氨酸是一种还原剂，可以进一步防止组织褐化，赖氨酸能够促进芽的生长发育，加快愈伤组织的形成；
(4)本发明在增殖培养基中添加油菜素内酯、硼氢化钾、硫酸亚铁以及叶酸，油菜素内酯能够激发愈伤组织的潜能，使得愈伤组织繁殖高效高速，硼氢化钾、硫酸亚铁均为还原剂，能够进一步防止愈伤组织褐化，且硼氢化钾、硫酸亚铁能为愈伤组织提供硼、钾 以及铁元素，这三者在愈伤组织生长过程中能为愈伤组织提供营养，叶酸是一种营养素，其能加快愈伤组织生长。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
(1)外植体的选择与消毒：取岩黄连叶片作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗5min、75％乙醇中表面消毒45s、0.1％HgCl2消毒9min、无菌水冲洗5次，最后用消毒滤纸吸去表面水分，得到叶片外植体；
(2)外植体诱导获得愈伤组织：将步骤(1)得到的叶片外植体接种到诱导培养基中培养，诱导培养基是以B5培养基为基本培养基，还加入激素6-苄基腺嘌呤1.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1mg/L、VC20mg/L、活性炭0.2g/L、蔗糖30g/L以及琼脂4.5g/L，调节诱导培养基的pH值为6.0，培养温度为25℃，将叶片外植体先暗培养1周后再光照培养，光照培养的光照强度为1400-2000lux，光照时间为12h/d，黑暗培养12h/d，培养10d后开始萌发，14d开始形成愈伤组织；
(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)中得到的愈伤组织置于增殖培养基中增殖培养30d，培养温度为25±2℃，光照强度为1400-2000lux，光照时间为12h/d，黑暗培养12h/d，增殖培养基是以B5培养基为基本培养基，还添加激素6-苄基腺嘌呤0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.2mg/L、VC5mg/L、活性炭0.3g/L、蔗糖30g/L以及琼脂4.5g/L，调节增殖培养基的pH值为5.8。
实施例2
(1)外植体的选择与消毒：取岩黄连叶柄作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡10min、线状自来水冲洗15min、75％乙醇中表面消毒30s、0.1％HgCl2消毒8min、无菌水冲洗3次，最后用消毒滤纸吸去表面水分，得到叶柄外植体；
(2)外植体诱导获得愈伤组织：将步骤(1)得到的叶柄外植体接种到诱导培养基中培养，诱导培养基是以B5培养基为基本培养基，还加入激素6-苄基腺嘌呤1.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L、VC5mg/L、活性炭0.3g/、蔗糖20g/L以及琼脂3.8g/L，调节诱导培养基的pH值为6.0，培养温度为23℃，将叶柄外植体先暗培养1周后再光照培养，光照培养的光照强度为1400-2000lux，光照时间为10h/d，黑暗培养14h/d，培养10d后开始萌发，14d开始形成愈伤组织；
(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)中得到的愈伤组织置于增殖培养基中增殖培养30d，培养温度为25±2℃，光照强度为1400-2000lux，光照时间为10h/d，黑暗培养14h/d，增殖培养基是以B5培养基为基本培养基，还添加激素6-苄基腺嘌呤1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1mg/L、VC20mg/L、活性炭0.1g/L、蔗糖28g/L以及琼脂4g/L，调节增殖培养基的pH值为5.8。
实施例3
(1)外植体的选择与消毒：取岩黄连茎作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡7min、线状自来水冲洗10min、75％乙醇中表面消毒40s、0.1％HgCl2消毒10min、无菌水冲洗4次，最后用消毒滤纸吸去表面水分，得到茎外植体；
(2)外植体诱导获得愈伤组织：将步骤(1)得到的茎外植体接种到诱导培养基中培养，诱导培养基是以B5培养基为基本培养基，还加入激素6-苄基腺嘌呤0.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L、VC10mg/L、活性炭0.1g/L、蔗糖27g/L以及琼脂4.1g/L，调节诱导培养基的pH值为6.0，培养温度为26℃，将茎外植体先暗培养1周后再光照培养，光照培养的光照强度为1400-2000lux，光照时间为11h/d，黑暗培养13h/d，培养10d后开始萌发，15d开始形成愈伤组织；
(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)中得到的愈伤组织置于增殖培养基中增殖培养30d，培养温度为25±2℃，光照强度为1400-2000lux，光照时间为10h/d，黑暗培养14h/d，增殖培养基是以B5培养基为基本培养基，还添加激素6-苄基腺嘌呤0.7mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.8mg/L、VC12mg/L、活性炭0.2g/L、蔗糖20g/L以及琼脂3.8g/L，调节增殖培养基的pH值为5.8。
实施例4
(1)外植体的选择与消毒：取岩黄连叶片作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗5min、75％乙醇中表面消毒45s、0.1％HgCl2消毒9min、无菌 水冲洗5次，最后用消毒滤纸吸去表面水分，得到叶片外植体；
(2)外植体诱导获得愈伤组织：将步骤(1)得到的叶片外植体接种到诱导培养基中培养，诱导培养基是以B5培养基为基本培养基，还加入激素6-苄基腺嘌呤1.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1mg/L、VC20mg/L、水杨酸0.88mg/L、茉莉酸甲酯0.79mg/L以及精氨酸0.4g/L，L-半胱氨酸0.8g/L，赖氨酸0.1g/L、活性炭0.2g/L、蔗糖30g/L以及琼脂4.5g/L，调节诱导培养基的pH值为6.0，培养温度为25℃，将叶片外植体先暗培养1周后再光照培养，光照培养的光照强度为1400-2000lux，光照时间为12h/d，黑暗培养12h/d，培养10d后开始萌发，14d开始形成愈伤组织；
(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)中得到的愈伤组织置于增殖培养基中增殖培养30d，培养温度为25±2℃，光照强度为1400-2000lux，光照时间为12h/d，黑暗培养12h/d，增殖培养基是以B5培养基为基本培养基，还添加激素6-苄基腺嘌呤0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.2mg/L、VC5mg/L，油菜素内酯0.08mg/L、硼氢化钾12mg/L、硫酸亚铁6mg/L、叶酸0.8mg/L、活性炭0.3g/L、蔗糖30g/L以及琼脂4.5g/L，调节增殖培养基的pH值为5.8。
实施例5
(1)外植体的选择与消毒：取岩黄连叶柄作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡10min、线状自来水冲洗15min、75％乙醇中表面消毒30s、0.1％HgCl2消毒8min、无菌水冲洗3次，最后用消毒滤纸吸去表面水分，得到叶柄外植体；
(2)外植体诱导获得愈伤组织：将步骤(1)得到的叶柄外植体接种到诱导培养基中培养，诱导培养基是以B5培养基为基本培养基，还加入激素6-苄基腺嘌呤1.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L、VC5mg/L、水杨酸0.59mg/L、茉莉酸甲酯0.42mg/L、精氨酸1g/L、L-半胱氨酸0.8g/L以及赖氨酸0.3g/L、活性炭0.3g/L、蔗糖20g/L以及琼脂3.8g/L，调节诱导培养基的pH值为6.0，培养温度为23℃，将叶柄外植体先暗培养1周后再光照培养，光照培养的光照强度为1400-2000lux，光照时间为10h/d，黑暗培养14h/d，培养10d后开始萌发，14d开始形成愈伤组织；
(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)中得到的愈伤组织置于增殖培养基中增殖培养30d，培养温度为25±2℃，光照强度为1400-2000lux，光照时间为10h/d，黑暗培养14h/d，增殖培养基是以B5培养基为基本培养基，还添加激素6-苄基腺嘌呤1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1mg/L、VC20mg/L、油菜素内酯0.04mg/L、硼氢化钾7mg/L、硫酸亚铁3mg/L、 叶酸0.4mg/L、活性炭0.1g/L、蔗糖28g/L以及琼脂4g/L，调节增殖培养基的pH值为5.8。
实施例6
(1)外植体的选择与消毒：取岩黄连茎作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡7min、线状自来水冲洗10min、75％乙醇中表面消毒40s、0.1％HgCl2消毒10min、无菌水冲洗4次，最后用消毒滤纸吸去表面水分，得到茎外植体；
(2)外植体诱导获得愈伤组织：将步骤(1)得到的茎外植体接种到诱导培养基中培养，诱导培养基是以B5培养基为基本培养基，还加入激素6-苄基腺嘌呤0.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L、VC10mg/L、水杨酸0.66mg/L、茉莉酸甲酯0.61mg/L、精氨酸0.7g/L、L-半胱氨酸0.4g/L、赖氨酸0.6g/L、活性炭0.1g/L、蔗糖27g/L以及琼脂4.1g/L，调节诱导培养基的pH值为6.0，培养温度为26℃，将茎外植体先暗培养1周后再光照培养，光照培养的光照强度为1400-2000lux，光照时间为11h/d，黑暗培养13h/d，培养10d后开始萌发，15d开始形成愈伤组织；
(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)中得到的愈伤组织置于增殖培养基中增殖培养30d，培养温度为25±2℃，光照强度为1400-2000lux，光照时间为10h/d，黑暗培养14h/d，增殖培养基是以B5培养基为基本培养基，还添加激素6-苄基腺嘌呤0.7mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.8mg/L、VC12mg/L、油菜素内酯0.06mg/L、硼氢化钾9mg/L、硫酸亚铁5mg/L、叶酸0.5mg/L、活性炭0.2g/L、蔗糖20g/L以及琼脂3.8g/L，调节增殖培养基的pH值为5.8。
为了说明本发明的效果，本申请人取对照组与实施例1和实施例4进行对比，对照组由如下步骤得到：取岩黄连叶片外植体清洗消毒放于诱导培养基中于25℃下培养，该诱导培养基以B5培养基为基本培养基，还加入激素6-苄基腺嘌呤1.1mg/L、活性炭0.2g/L、蔗糖30g/L以及琼脂4.5g/L，调节诱导培养基的pH值为5.8，取三组该诱导培养基，每组培养基上接种20个叶片外植体，将叶片外植体先暗培养1周后再光照培养，光照培养的光照强度为1400-2000lux，光照时间为12h/d，黑暗培养12h/d，培养14d得到愈伤组织，计算三组诱导愈伤组织的诱导率的平均值，并计算三组诱导培养基上外植体的褐化率的平均值；再将愈伤组织放于增殖培养基中增殖培养，培养温度为25℃，光照强度为1400-2000lux，光照时间为12h/d，黑暗培养12h/d，增殖培养基是以B5培养基为基本培养基，还添加激素2,4-二氯苯氧乙酸0.2mg/L、活性炭0.3g/L、蔗糖30g/L以及琼脂4.5g/L， 调节增殖培养基的pH值为5.8，愈伤组织在增殖培养基中培养30d，计算三组增殖倍数的平均值，并计算三组增殖培养基上愈伤组织的褐化率的平均值；
实施例1、实施例2以及实施例3分别取三组上述诱导培养基，每组培养基上接种20个叶片外植体，在步骤2的诱导培养基中培养14d，计算三组诱导愈伤组织的诱导率的平均值，并计算三组诱导培养基上外植体的褐化率的平均值，实施例1、实施例2以及实施例3在步骤3中将愈伤组织在增殖培养基中培养30d，计算三组增殖倍数的平均值，并计算三组诱导培养基上外植体的褐化率的平均值；实施例4、实施例5以及实施例6分别取三组上述诱导培养基，每组培养基上接种20个叶片外植体，在步骤2的诱导培养基中培养14d，计算三组诱导愈伤组织的诱导率的平均值，并计算三组诱导培养基置于增殖培养基中培养30d，计算三组增殖倍数的平均值，并计算三组增殖培养基上愈伤组织的褐化率的平均值；得到具体数据如表1所示：
表1 各试验组诱导率和褐化率表
由表1可以看出，对照组的诱导率在50％左右，有一半的叶片外植体不能有效诱导出愈伤组织，愈伤组织移植到增殖培养基中增殖的倍数也仅在1.78，而实施例1的叶片外植体经过改进，其诱导率上升至90.8％，增殖倍数也上升至3.16，因此可以看出激素6-苄基腺嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸的协同作用明显，可以有效地提高诱导率；实施例4的叶片外植体是在实施例1的基础上进一步改进，在诱导培养基中加入了水杨酸、茉莉酸甲酯、精氨酸、L-半胱氨酸以及赖氨酸，在增殖培养基中加入了油菜素内酯和叶酸，实施例4的诱导率高达95.7％，增殖倍数高达3.95，由此可见，实施例4的方法可以高效诱导愈伤组织 并使愈伤组织增殖。对照组中叶片外植体褐化率为58.9％，愈伤组织的褐化率为60.2％，可见不采取任何防褐化处理，叶片外植体和愈伤组织的褐化严重；实施例1中加入VC，可以明显的降低叶片外植体和愈伤组织的褐化率，由于VC的存在实施例1中叶片外植体褐化率降低至10.3％，愈伤组织的褐化率降低至11.4％；由于加入了L-半胱氨酸和硼氢化钾、硫酸亚铁，实施例4中的叶片外植体褐化率和愈伤组织的褐化率分别降低至3.1％和1.9％，由此可见，实施例4中采取的措施对降低叶片外植体和愈伤组织的褐化率是显著有效的。
实施例2和实施例3的叶柄和茎的诱导率和增殖倍数也分别在90％和3倍以上，实施例5和实施例6的叶柄和茎的诱导率和增殖倍数分别在95％和3.9倍以上，因此本发明对于提高叶柄外植体和茎外植体都是行之有效的
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。