用于改进的植物性状的经过设计的复合内生菌组合物和方法与流程

文档序号：14915453发布日期：2018-07-11 00:35阅读：308来源：国知局

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序列表

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发明领域

本发明涉及用于改进植物、尤其农业植物(如玉米、小麦、大麦、高粱、稷、稻、大豆、芥花、油菜籽、棉花、紫花苜蓿、甘蔗、木薯、马铃薯、西红柿和蔬菜)的栽培的组合物和方法。例如，本发明描述了包含可用于向植物赋予改进的农艺性状的额外组分(如细菌)的内生真菌。所公开的发明还描述了通过将包含额外组分的内生真菌引入至那些植物中来改进植物特征的方法。此外，本发明还提供了用进一步包含额外组分的内生真菌处理种子和其它植物部分的方法，以向植物、尤其农业植物赋予改进的农艺特征。此外，本发明提供从个别真菌和细菌组分合成的内共生真菌性内生菌的新颖组合物和方法，以向农业和其它领域提供益处。

发明背景

根据联合国粮农组织(UN FAO)，全世界的人口截至2050年将超过96亿人，这将需要农业的显著改进以满足增长的粮食需求。同时，资源(如水、土壤)的节约、投入物(如肥料、杀虫剂、除草剂)的减少、环境可持续性和气候变化在如何使粮食生长方面是日益重要的因素。需要改进的农业植物和农耕方式，其将使得以较少资源、更多环境可持续投入物并且以具有改进的对多种生物和非生物胁迫(如害虫、干旱、疾病)的反应的植物实现几乎双倍粮食产量的需要。

现今，作物性能主要经由针对作物基因型(例如，植物育种、经过遗传修饰的(GM)作物)与其周围环境(例如，肥料、合成除草剂、杀虫剂)之间的相互作用的技术来优化。虽然这些典范已经在过去的五十年里辅助使全球粮食产量加倍，但产量增长率已经在多种主要的作物中停止并且气候的变化已经与重要作物的产量不稳定性和衰退有关，驱动了对于作物产量改进的新颖解决方法的迫切需要。除了其冗长的发育和调节时间轴以外，公众对于GM-作物和合成化学品的恐惧也已经挑战了其在多种关键作物和多个国家中的使用，导致对于多种GM性状的接受的缺乏和在一些全球市场中排除GM作物和多种合成化学品。因此，显著需要创新的、有效的、环境可持续的并且公众可接受的方法来改进作物的产量和对胁迫的抗逆性。

作物对生物和非生物胁迫的抗逆性的改进已经证明了针对作物改进对于传统基因和化学典范的挑战。这一挑战部分地是归因于在暴露于这些胁迫期间出现的复杂、网络层面的挑战。例如，在胁迫下的植物可屈服于多种生理学和发育损伤，包括脱水、升高的活性氧、对光合碳同化的损害、对同化物的易位的抑制、增加的呼吸作用、归因于发育期的持续时间降低的减少的器官大小、对种子发育的破坏和生殖力的减少。

如同人类使用有益微生物共生体的补充，据说植物已经从生活在其组织内和其组织周围的大量细菌和真菌获得益处以便支撑植物的健康和生长。内生菌是生活在植物内的共生生物(典型地细菌或真菌)，并且寄居于多种植物组织中，通常定殖于宿主叶子、茎、花、果实、种子或根的细胞间隙。迄今，已经在有限的研究中分析了少量的共生内生菌-宿主关系以向受控的实验室环境内的模型宿主植物提供适应性益处，如生物量生产和营养的增强、增加的对胁迫(如干旱和害虫)的耐受性。仍需要开发更好的植物-内生菌系统以向多种农业上重要的植物(如玉米和大豆)赋予益处，例如以对所述农业植物提供改进的产量和对存在于多种农业形势中的环境胁迫的耐受性。

“经过设计的复合内生菌”或进一步包含另一组分(如病毒或细菌)的内生菌的极少实例已经描述于文献中，包括：a survey of cupressaceous trees(Hoffman和Arnold，2010 Appl.Environ.Microbiol.76∶4063-4075，以引用的方式整体并入本文)和one species of tropical grasses(Marquez等人，2007Science 315∶513-515)。Desirò等人(2014ISME J.8∶257-270，以引用的方式整体并入本文)描述了住在内生真菌内的超过一种细菌的存在。已经证明了这些内共生真菌性细菌(endofungal bacteria)中的至少一者能够产生增强植物生长的植物激素并且其它可产生具有抗癌和抗疟疾特性的物质(Hoffman等人，2013PLOS One 8：e73132；Jung和Arnold，2012The Effects ofEndohyphal Bacteria on Anti-Cancer and Anti-Malaria Metabolites of Endophytic Fungi，Honors Thesis，University of Arizona，以引用的方式整体并入本文)。然而，这些经过设计的复合内生菌尚未显示存在于如玉米、大豆、小麦、棉花、稻等具有农业重要性的栽培植物中。同样地，从所述经过设计的复合内生菌分离的细菌或能够存在于宿主真菌内的细菌或能够包含组分细菌的宿主真菌先前未被设想为解决对具有农业重要性的植物的需要以提供改进的产量和对环境胁迫的耐受性的可行机制。

因此，需要提供具有改进的产量和对多种生物和非生物胁迫的耐受性的农业植物的组合物和方法。本文中提供了经过设计的复合内生菌的新颖组合物、用于处理植物和植物部分的经过设计的复合内生菌的制剂、新颖的经过设计的复合内生菌-植物组合物和基于对增强经过设计的复合内生菌组合物的效用和商业化的关键特性的分析产生的以上物质的使用方法。

发明概述

本文公开了一种产生包含在异源真菌内的至少一种细菌的经过设计的复合内生菌的方法，所述方法包括：a)分离并且纯化细菌；b)分离并且纯化真菌；c)在液体培养基中共培养所述细菌与所述真菌；和d)在不超过35摄氏度的温度下孵育所述共培养的细菌和真菌。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述共培养物接种于2％水琼脂上持续最少1周，接着将所述共培养物转移至全强度PDA/LB琼脂。在一些实施方案中，所述共培养的细菌和真菌是在选自由以下组成的组的温度范围下孵育：18℃与36℃之间、20℃与30℃之间、20℃与26℃之间、20.0℃与25.5℃之间、22.0℃与25.0℃之间和23.0℃与24.0℃之间。所述经过孵育的共培养的细菌和真菌用庆大霉素进一步处理。在一些实施方案中，所述共培养的细菌和真菌进一步接种于具有庆大霉素的肉汤和/或琼脂上。在一些实施方案中，所述培养物用氯化镁洗涤不少于三次。在一些实施方案中，庆大霉素的浓度是选自由以下组成的组：5微克/mL、20微克/mL、50微克/mL和75微克/mL。

一方面，本文提供了一种产生包含在异源真菌内的至少一种细菌的经过设计的复合内生菌的方法，所述方法包括：a)分离并且纯化细菌；b)分离并且纯化真菌；c)在液体培养基中共培养所述细菌与所述真菌；和d)在不超过35摄氏度的温度下孵育所述共培养的细菌和真菌，其中步骤a)是在选自由以下组成的组的温度范围下进行的：18℃与36℃之间、20℃与30℃之间、20℃与26℃之间、20.0℃与25.5℃之间、22.0℃与25.0℃之间和23.0℃与24.0℃之间。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述共培养物接种于2％水琼脂上持续最少1周，接着将所述共培养物转移至全强度PDA/LB琼脂。在一些实施方案中，所述共培养的细菌和真菌是在选自由以下组成的组的温度范围下孵育：18℃与36℃之间、20℃与30℃之间、20℃与26℃之间、20.0℃与25.5℃之间、22.0℃与25.0℃之间和23.0℃与24.0℃之间。所述经过孵育的共培养的细菌和真菌用庆大霉素进一步处理。在一些实施方案中，所述共培养的细菌和真菌进一步接种于具有庆大霉素的肉汤和/或琼脂上。在一些实施方案中，所述培养物用氯化镁洗涤不少于三次。在一些实施方案中，庆大霉素的浓度是选自由以下组成的组：5微克/mL、20微克/mL、50微克/mL和75微克/mL。

一方面，本文提供了一种产生包含在异源真菌内的至少一种细菌的经过设计的复合内生菌的方法，所述方法包括：a)分离并且纯化细菌；b)分离并且纯化真菌；c)在液体培养基中共培养所述细菌与所述真菌；和d)在不超过35摄氏度的温度下孵育所述共培养的细菌和真菌，所述方法在步骤b)后进一步包括：用一种或多种抗生素处理所述真菌以从所述真菌消除任何组分细菌。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述共培养物接种于2％水琼脂上持续最少1周，接着将所述共培养物转移至全强度PDA/LB琼脂。在一些实施方案中，所述共培养的细菌和真菌是在选自由以下组成的组的温度范围下孵育：18℃与36℃之间、20℃与30℃之间、20℃与26℃之间、20.0℃与25.5℃之间、22.0℃与25.0℃之间和23.0℃与24.0℃之间。所述经过孵育的共培养的细菌和真菌用庆大霉素进一步处理。在一些实施方案中，所述共培养的细菌和真菌进一步接种于具有庆大霉素的肉汤和/或琼脂上。在一些实施方案中，所述培养物用氯化镁洗涤不少于三次。在一些实施方案中，庆大霉素的浓度是选自由以下组成的组：5微克/mL、20微克/mL、50微克/mL和75微克/mL。

本文还描述了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述合成组合物进一步包含农艺制剂，所述农艺制剂进一步包含以下一者或多者：稳定剂或防腐剂或载体或表面活性剂或抗络合剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、杀昆虫剂和除草剂或其任何组合。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述经过设计的复合内生菌以每个植物元素至少约10∧^个CFU的量存在。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述经过设计的复合内生菌包含选自由以下组成的组的纲的宿主真菌：座囊菌纲、粪壳菌纲、毛霉亚门、盘菌亚门，或前述的任何相应的无性型或有性型分类。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述经过设计的复合内生菌包含选自由以下组成的组的纲的细菌：杆菌、γ-变形菌纲、放线菌。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述经过设计的复合内生菌包含选自由以下组成的组的目的宿主真菌：粪壳菌纲、炭角菌目、毛霉目、煤炱目，或前述的任何相应的无性型或有性型分类。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述经过设计的复合内生菌包含选自由以下组成的组的目的细菌：芽胞杆菌目、肠杆菌目、黄单胞菌目、放线菌目。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述经过设计的复合内生菌包含选自由以下组成的组的科的宿主真菌：球腔菌科、小戴卫霉科、毛霉科、炭角菌亚纲、圆孔壳科，或前述的任何相应的无性型或有性型分类。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述经过设计的复合内生菌包含选自由以下组成的组的科的细菌：类芽胞杆菌科、肠杆菌科、黄单胞菌科、链霉菌科。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述经过设计的复合内生菌包含选自由以下组成的组的属的宿主真菌：拟盘多毛孢属、毛霉属、枝孢菌属，或前述的任何相应的无性型或有性型分类。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述经过设计的复合内生菌包含选自由以下组成的组的属的细菌：泛菌属、类芽孢杆菌属、藤黄色杆菌属、链霉菌属。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述真菌包含与选自由SEQ ID NO：561至SEQ ID NO：758组成的组的核酸序列至少95％同一的核酸序列。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述细菌包含与选自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：560组成的组的核酸序列至少95％同一的核酸序列。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述经过设计的复合内生菌是选自表3中列出的组合物。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述内生真菌与植物元素缔合，但未直接地接触所述植物元素。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述经过设计的复合内生菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和从种子生长的植物中的内源微生物群体，如与未与所述经过设计的复合内生菌缔合或从与所述经过设计的复合内生菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述植物元素是选自由以下组成的组：全植物、幼苗、分生组织、基本组织、维管组织、皮组织、种子、叶子、根、芽、茎、花、果实、匍匐枝、鳞茎、块茎、球茎、花柄长叶和花蕾。

还提供了一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述植物元素是来自选自由以下组成的组的植物：小麦、大豆、玉米、棉花、芥花、大麦、高粱、稷、稻、油菜籽、紫花苜蓿、西红柿、甜菜、高粱、杏树、胡桃、苹果、花生、草莓、莴苣、橙、马铃薯、香蕉、甘蔗、马铃薯、木薯、芒果、番石榴、棕榈、洋葱、油橄榄、胡椒、茶叶、山药、可可树、向日葵、芦笋、胡萝卜、椰子、柠檬、酸橙、大麦、西瓜、甘蓝、黄瓜、葡萄和草坪草。

还提供了多种组合物：一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其被限制在选自由以下组成的组的物体内：瓶、罐、安瓿、包装、器皿、袋、盒、箱、纸袋、纸盒、容器、料仓、装运容器、车厢和柜；在一些实施方案中，其被放置在促进植物生长的培养基中，所述培养基选自由以下组成的组：土壤、水培装置和人工生长培养基；例如，其中所述培养基是土壤，其中所述合成组合物以各种子之间大体上相等间距被放置在所述土壤中；在一些实施方案中，所述合成组合物是货架期稳定的。

还公开了从如下组合物生长的植物：一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步包含植物元素；和一种包含封装异源内生细菌的内生真菌的合成组合物，其进一步进一步包含植物元素并且能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；和一种合成组合物，其包含与经过设计的复合内生菌缔合的植物元素，其中所述经过设计的复合内生菌能够向所述植物元素或与所述植物元素缔合的植物提供具有农艺重要性的性状；其中在一些实施方案中，所述内生真菌能够调节以下至少一者：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和与所述植物元素缔合的植物中或从所述植物元素生长的内源微生物群体，如与未与所述内生真菌缔合或从与所述内生真菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较，其中所述植物或所述植物的后代在其植物元素中的至少一者中包含所述内生真菌、所述内生细菌、经过设计的复合内生菌、真菌宿主或细菌组分。

本文还公开了一种用经过设计的复合内生菌接种植物的方法，所述方法包括使所述植物的植物元素与包含所述经过设计的复合内生菌的制剂接触；和一种用内生真菌接种植物的方法，所述方法包括使所述植物的植物元素与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触，其中所述经过设计的复合内生菌包含所述内生真菌；和一种用内生细菌接种植物的方法，所述方法包括使所述植物的植物元素与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触，其中所述经过设计的复合内生菌包含所述内生细菌。在一些实施方案中，所述接种会改进所述植物中具有农艺重要性的性状。

本文还公开了一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使植物元素与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触；如与与所述经过设计的复合内生菌缔合的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使所述植物从已经与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触的植物生殖元素生长；如与由未与所述经过设计的复合内生菌缔合的植物生殖元素生长的等值线植物相比较。

本文还公开了一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使植物元素与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源宿主真菌内的细菌；如与未与所述细菌缔合的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使植物元素与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源宿主真菌内的第一真菌；如与未与所述第一真菌缔合的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使植物元素与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源真菌内的细菌；如与未与所述真菌缔合的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使所述植物从已经与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触的植物生殖元素生长，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源真菌内的细菌；如与由未与所述细菌缔合的植物生殖元素生长的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使所述植物从已经与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触的植物生殖元素生长，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源宿主真菌内的第一真菌；如与由未与所述第一真菌缔合的植物生殖元素生长的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使所述植物从已经与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触的植物生殖元素生长，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源真菌内的细菌；如与由未与所述真菌缔合的植物生殖元素生长的等值线植物相比较，其中所述经过设计的复合内生菌以能够调节以下至少一者的量存在于所述制剂中：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和从种子生长的植物中的内源微生物群体，如与未与所述经过设计的复合内生菌缔合或从与所述经过设计的复合内生菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较。

本文还公开了一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使植物元素与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源宿主真菌内的细菌；如与未与所述细菌缔合的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使植物元素与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源宿主真菌内的第一真菌；如与未与所述第一真菌缔合的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使植物元素与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源真菌内的细菌；如与未与所述真菌缔合的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使所述植物从已经与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触的植物生殖元素生长，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源真菌内的细菌；如与由未与所述细菌缔合的植物生殖元素生长的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使所述植物从已经与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触的植物生殖元素生长，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源宿主真菌内的第一真菌；如与由未与所述第一真菌缔合的植物生殖元素生长的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使所述植物从已经与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触的植物生殖元素生长，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源真菌内的细菌；如与由未与所述真菌缔合的植物生殖元素生长的等值线植物相比较，其中所述制剂进一步包含以下一者或多者：稳定剂或防腐剂或载体或表面活性剂或抗络合剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、杀昆虫剂和除草剂或其任何组合；和/或其中所述经过设计的复合内生菌以每个植物元素至少约10^2个CFU的量存在。

本文还公开了一种来自通过如下方法产生的植物的植物元素：一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使植物元素与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源宿主真菌内的细菌；如与未与所述细菌缔合的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使植物元素与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源宿主真菌内的第一真菌；如与未与所述第一真菌缔合的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使植物元素与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源真菌内的细菌；如与未与所述真菌缔合的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使所述植物从已经与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触的植物生殖元素生长，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源真菌内的细菌；如与由未与所述细菌缔合的植物生殖元素生长的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使所述植物从已经与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触的植物生殖元素生长，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源宿主真菌内的第一真菌；如与由未与所述第一真菌缔合的植物生殖元素生长的等值线植物相比较；和一种改进植物中具有农艺重要性的性状的方法，所述方法包括使所述植物从已经与包含经过设计的复合内生菌的制剂接触的植物生殖元素生长，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源真菌内的细菌；如与由未与所述真菌缔合的植物生殖元素生长的等值线植物相比较，其中所述经过设计的复合内生菌以能够调节以下至少一者的量存在于所述制剂中：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和从种子生长的植物中的内源微生物群体，如与未与所述经过设计的复合内生菌缔合或从与所述经过设计的复合内生菌缔合的植物元素生长的等值线植物相比较；其中所述具有农艺重要性的性状是选自由以下组成的组：发芽率、出苗率、芽生物量、幼苗根长、幼苗芽长、幼苗质量、幼苗根表面积和产量，或其中所述具有农艺重要性的性状是在正常浇水条件下改进的，或其中所述具有农艺重要性的性状是在水限制条件下改进的。

本文还描述了一种用于制备合成组合物的方法，所述方法包括使多个植物元素的表面与包含经过设计的复合内生菌的制剂缔合，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源真菌内的细菌并且以能够调节以下至少一者的量存在于所述制剂中：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和从种子生长的植物中的内源微生物群体，如与未与所述制剂缔合或从与所述制剂缔合的植物元素生长的等值线植物相比较。

另一方面是一种用于制备合成组合物的方法，所述方法包括使多个植物元素的表面与包含经过设计的复合内生菌的制剂缔合，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源真菌内的细菌并且以能够调节以下至少一者的量存在于所述制剂中：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和从种子生长的植物中的内源微生物群体，如与未与所述制剂缔合或从与所述制剂缔合的植物元素生长的等值线植物相比较；在一些实施方案中，其中所述具有农艺重要性的性状是选自由以下组成的组：发芽率、出苗率、芽生物量、幼苗根长、幼苗芽长、幼苗质量、幼苗根表面积和产量；在一些实施方案中，其中所述具有农艺重要性的性状是在正常浇水条件下改进的或是在水限制条件下改进的；其中所述经过设计的复合内生菌与植物元素缔合，但未直接地接触所述植物元素，例如，所述植物元素是选自由以下组成的组：全植物、幼苗、分生组织、基本组织、维管组织、皮组织、种子、叶子、根、芽、茎、花、果实、匍匐枝、鳞茎、块茎、球茎、花柄长叶和花蕾，例如，所述植物元素是来自选自由以下组成的组的植物：小麦、大豆、玉米、棉花、芥花、大麦、高粱、稷、稻、油菜籽、紫花苜蓿、西红柿、甜菜、高粱、杏树、胡桃、苹果、花生、草莓、莴苣、橙、马铃薯、香蕉、甘蔗、马铃薯、木薯、芒果、番石榴、棕榈、洋葱、油橄榄、胡椒、茶叶、山药、可可树、向日葵、芦笋、胡萝卜、椰子、柠檬、酸橙、大麦、西瓜、甘蓝、黄瓜、葡萄和草坪草。

本文还公开了一种来自通过用于制备合成组合物的方法产生的植物的植物元素，所述方法包括使多个植物元素的表面与包含经过设计的复合内生菌的制剂缔合，其中所述经过设计的复合内生菌包含在异源真菌内的细菌并且以能够调节以下至少一者的量存在于所述制剂中：具有农艺重要性的性状、基因的转录、蛋白质的表达、激素的水平、代谢物的水平和从种子生长的植物中的内源微生物群体，如与未与所述制剂缔合或从与所述制剂缔合的植物元素生长的等值线植物相比较；在一些实施方案中，其中所述具有农艺重要性的性状是选自由以下组成的组：发芽率、出苗率、芽生物量、幼苗根长、幼苗芽长、幼苗质量、幼苗根表面积和产量；在一些实施方案中，其中所述具有农艺重要性的性状是在正常浇水条件下改进的或是在水限制条件下改进的。

本文还公开了一种改进内生细菌在应用中的功效的方法，所述方法包括使用经过设计的复合内生菌，其中所述经过设计的复合内生菌包含所述内生细菌；和一种改进内生真菌在应用中的功效的方法，所述方法包括使用经过设计的复合内生菌，其中所述经过设计的复合内生菌包含所述内生真菌。

一方面是一种改进内生细菌在应用中的功效的方法，所述方法包括使用经过设计的复合内生菌，其中所述经过设计的复合内生菌包含所述内生细菌；和一种改进内生真菌在应用中的功效的方法，所述方法包括使用经过设计的复合内生菌，其中所述经过设计的复合内生菌包含所述内生真菌，其中所述应用是选自由以下组成的组：农业、植物改进、水质改进、雪或冰产生、生物修复、工业化合物产生、药物化合物产生和经过生物工程改造的物质的产生。

一方面是一种改进内生细菌在应用中的功效的方法，所述方法包括使用经过设计的复合内生菌，其中所述经过设计的复合内生菌包含所述内生细菌；和一种改进内生真菌在应用中的功效的方法，所述方法包括使用经过设计的复合内生菌，其中所述经过设计的复合内生菌包含所述内生真菌，其中所述应用是属于选自由以下组成的组的化合物类别的组合物的产生方法：酸、醇、氨基酸、淀粉酶、抗生素、生物气、生物塑料、柠檬酸、酶、酯、脂肪酸、调味剂、谷氨酸、人类或动物激素、人类生长激素、冰、胰岛素、乳酸、脂肪酶、脂质、矿物、氮、油、核酸、果胶酶、防腐剂、蛋白质、雪、糖、疫苗、病毒、维生素和蜡。

本文还公开了一种改进内生细菌在应用中的性能的方法，所述方法包括合成包含细菌的经过设计的复合内生菌，所述细菌包含与所述内生细菌的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列，和用所述经过设计的复合内生菌取代所述应用中的所述内生细菌。一方面，所述内生细菌进一步与植物元素缔合。一方面，所述内生细菌是革兰氏阴性的。一方面，所述内生真菌具有改进的孢子形成能力。一方面，所述特征是选自由以下组成的组：功效、生存力、货架期稳定性、对抗生素的耐受性、对减少的环境水分的耐受性。

附图说明

图1A和图1B：原生复合内生菌和其相应的经过消除的真菌宿主的显微镜方法。显微图像证明了在复合内生菌(包含组分细菌的真菌宿主)与从其组分细菌消除的那些相同的真菌宿主之间的形态差异。在内生真菌内的细菌丛集对经过消除的真菌宿主的非丛集：用含有内生细菌的真菌制剂生长的板的明场(灰度级，左侧)和单色荧光显微图像。由点状DNA(右侧，绿色)以及死细胞标记物(中间，红色)指示的推定的细菌簇显示了细菌信号的相对分离。注意集落的丝状性质(灰度级，左侧)。图1A：SYM15779，呈其分离的复合内生菌形式，和呈其经过消除的真菌宿主形式(去除了组分细菌)。对组分细菌不存在状态的验证是通过孵育所述经过消除的真菌宿主并且分析真菌菌丝中未出现细菌来进行。图1B：SYM15890，非复合内生真菌，和在抗生素处理后的其“经过消除的”真菌宿主形式(去除了表面细菌污染)。

图2：经过设计的复合内生菌和内生菌组分培养物表型特征。各经过消除的真菌宿主是在用抗生素孵育以杀死所述组分细菌并且再接种之后，分离的复合内生菌的板培养物。各分离的细菌组分的图像是在用环己酰胺孵育以杀死所述宿主真菌并且再接种之后，分离的复合内生菌的板培养物。(注意：培养物中的孔是归因于样品萃取)

图3：用于本发明的经过设计的复合内生菌的产生的非复合内生真菌和细菌。以下真菌和细菌真菌并非从任何分离的复合内生菌分离，并且分别地培养以用于经过设计的复合内生菌的合成实验。为了验证非复合内生菌状态，内生真菌SYM15890用抗生素和不用抗生素培养。未见板表型的差异。(注意：培养物中的孔是归因于样品萃取)。

图4：经过设计的复合内生菌状态的验证。如此处显示的凝胶上所证明，原生内共生真菌性内生菌SYM15779包含细菌和真菌DNA两者，但当使用实施例中所述的方法进行消除时，被确认不含细菌DNA。用细菌菌株SYM257和SYM292共培养SYM15779导致真菌和细菌菌株两者均存在。作为对照，使经过消除的SYM15779样品掺加细菌菌株，但所述细菌菌株不会在PCR期间扩增。从这些数据推断出，经过设计的复合内生菌SYM15779+EHB166、SYM15779+SYM292以及SYM15779+再引入的EHB15779实际上均包含内共生真菌性细菌，所述内共生真菌性细菌已经并入至宿主真菌中，对以非并入状态共存在(例如，存在于真菌的表面上)。作为另一对照，SYM15890也经受抗生素处理以“消除”任何内共生真菌性细菌，掺加SYM292，并且洗涤，但所述细菌菌株不会在PCR期间扩增，证明了所述方法的功效。样品在2％琼脂糖凝胶上跑胶。

图5：当细菌被封装于真菌宿主内时，细菌对抗生素的耐受性得到改进。在5ug/mL庆大霉素与75ug/mL庆大霉素之间的不同浓度的庆大霉素(还参见图6)相等有效地从复合内生菌去除表面污染细菌，同时保持组分内共生真菌性细菌。5ug/mL、20ug/mL和50ug/mL的浓度相等有效地从复合内生菌去除表面污染细菌，同时保持组分内共生真菌性细菌。样品在2％琼脂糖凝胶上跑胶。在庆大霉素洗涤之后所述内共生真菌性细菌的生活力通过经过设计的复合内生菌的培养并且分析宿主真菌菌丝的细菌出现来验证。

图6：产生经过设计的复合内生菌的过程通过向所述方法中添加庆大霉素洗涤以去除污染性表面细菌来改进。内共生真菌性细菌EHB1577916S即使在其宿主真菌SYM15779用庆大霉素洗涤液处理之后也在其宿主真菌中保持可检测。未洗涤(表面和内共生真菌性细菌均存在)和经过洗涤(仅内共生真菌性细菌存在)的SYM15779的比较处理证明了细菌16S序列的存在。掺加细菌菌株并且未用庆大霉素洗涤的非复合内生菌SYM15890显示了细菌16S序列的模糊色带，反映了表面细菌的存在。用庆大霉素洗涤的非复合内生菌SYM15890并未显示细菌16S序列的存在。两种不同浓度的庆大霉素(50ug/mL和75ug/mL)均有效。样品在2％琼脂糖凝胶上跑胶。

图7：经过设计的复合内生菌和经过消除的真菌宿主的液体培养肉汤。经过设计的复合内生菌(各自包含宿主真菌和组分细菌)的液体培养物显示了与经过消除的宿主真菌相比较独特的形态差异。SYM15779消除了液体PDB培养物连同经过设计的复合内生菌15779+292、15779+EHB15779、15779+EHB166的液体培养物中的宿主真菌。

图8A和图8B：经过设计的复合内生菌、其组分和原始真菌宿主来源。将所述细菌并入所述宿主真菌中的经过设计的复合内生菌的培养板和PCR验证。图8A：分离的复合内生菌SYM166、经过消除的真菌宿主、异源细菌SYM257和新颖的经过设计的复合内生菌SYM166+257的板培养物。(注意：培养物中的孔是归因于样品萃取)。图8B：以上样品中16S和ITS扩增的存在/不存在的PCR验证。样品在2％琼脂糖凝胶上跑胶。

图9：经过设计的复合内生菌的显微镜方法。经过消除的宿主真菌(SYM15779)和两种用所述经过消除的真菌宿主加上两种不同的异源组分细菌(292、EHB166)产生的经过设计的复合内生菌的实例。显微镜方法显示了在经过消除的(空的)真菌宿主与所述经过设计的复合内生菌之间的清楚形态差异。在经过设计的复合内生菌内的细菌丛集对经过消除的真菌宿主的非丛集：用含有内生细菌的真菌制剂生长的板的明场(灰度级，左侧)和单色荧光显微图像。由点状DNA(右侧，绿色)以及死细胞标记物(中间，红色)指示的推定的细菌簇显示了细菌信号的相对分离。注意集落的丝状性质(灰度级，左侧)。

图10：针对种子处理的干燥生物量。

图11A和图11B：细菌在植物元素上的生存力可通过将细菌封装于宿主真菌内来改进。图11A：两种不同的内生细菌在不同的复合内生菌宿主真菌中的第1天生存力，如与其相应的分离细菌相比较。图11B：细菌SYM292的第1天和第6天生存力可通过将其作为经过设计的复合内生菌的一部分封装于宿主真菌内来改进

定义

“内生菌”是生活在植物内或以其它方式与其缔合的生物，并且不会引起疾病或以其它方式伤害所述植物。内生菌可占据包括叶子、茎、花、果实、种子或根的植物组织的细胞内或细胞外间隙。内生菌可为例如细菌或真菌生物，并且可向宿主植物赋予有益的特性，如产量、生物量、抗性或适应性的增加。如本文所用，术语“微生物”有时用于描述可从内生真菌分离并且能够生活在植物内的内生菌，尤其内生真菌。

术语“复合内生菌”用于描述包含至少一种额外生物或组合物的宿主真菌，例如内共生真菌性内生细菌或内共生真菌性内生真菌。术语“经过设计的复合内生菌”用于描述包含至少一种额外异源生物或组合物的宿主真菌。在一些实施方案中，所述组合可本身与例如植物缔合。所述额外异源生物或组合物可为例如内共生真菌性内生细菌或内共生真菌性内生真菌。如本文所用，“内生菌组分”是指内共生真菌性内生细菌或内共生真菌性内生真菌(无论对于宿主真菌来说是异源或非异源)。

“内共生真菌性内生细菌”意指能够生活在真菌内部，例如菌丝内的内生细菌。术语“内共生真菌性内生细菌”用于表示最初从宿主真菌分离的内生细菌实体或能够生活在宿主真菌内的那些。同样，“内共生真菌性内生真菌”意指最初从宿主真菌分离的内生真菌或能够生活在宿主真菌内的内生真菌。在所述情况下，术语“内共生真菌性”表示起点来源(宿主真菌)或存在于宿主真菌内的能力，并且不意图暗指所述细菌或真菌(或多种细菌或多种真菌)持续地涵盖于宿主真菌内。例如，内共生真菌性内生细菌可住在宿主真菌内持续其生命周期的一部分并且住在所述宿主真菌内部持续其生命周期的其它部分。在一些情况下，术语“组分细菌”用于表示存在于宿主真菌内，或已经从宿主真菌分离的细菌。在本发明的范围内，术语“内共生菌丝性”可被视为与“内共生真菌性”同义。

在一些实施方案中，宿主真菌包含以共生形式(地衣)生活的藻类或蓝细菌，或两者，和至少一种内共生真菌性内生细菌或内共生真菌性内生真菌。

如本文所用，术语“能够”生活在真菌内部意指所述内生菌具有允许其生活在真菌内部的适当特征。例如，所述内生菌可产生必要物质来避免所述真菌的排斥，并且能够使用由所述真菌提供的营养物来生活。

如本文所用，术语“细菌(bacterium)”或“细菌(bacteria)”一般是指任何原核生物，并且可涉及来自真细菌界(细菌)、古细菌界(古菌)或两者的生物。在一些情况下，细菌属已经归因于多种原因(如但不限于全基因组测序的发展领域)被重新分配，并且应理解所述命名法重新分配是在任何所要求的属的范围内。例如，欧文氏菌属的某些种已经在文献中被描述为属于泛菌属(Zhang和Qiu，2015)。

术语16S是指细菌的16S核糖体RNA(rRNA)序列的DNA序列。16S rRNA基因测序是得到充分确认的用于研究细菌的发展史和分类的方法。

如本文所用，术语“真菌(fungus)”或“真菌(fungi)”一般是指来自真菌界的任何生物。真菌的历史分类学分类已经依照形态呈现。从19世纪中期开始，认识到一些真菌具有多形生命周期，并且不同的命名法名称用于同一真菌的不同形式。1981年，悉尼国际真菌协会大会根据其状态(如无性型、有性型或全型)布置了关于真菌的命名的规则(Taylor，2011)。随着基因组测序的发展，显而易见的是基于分子系统发生学的分类学分类并未与基于形态的命名法(Shenoy，2007)一致。结果，2011年，国际植物学大会通过一项决议，批准了国际藻类、真菌和植物命名法规(墨尔本法规)(2012)，其中所陈述的结果是指定“一种真菌＝一种名称”(Hawksworth，2012)。然而，分类学专家关于所有真菌的常见命名尚未达成一致，所有现有的数据库和信息资源(包括更新的分类学)也是如此。因而，本文所提及的多种真菌可由其无性型形式描述，但应理解基于同一的基因组测序，所述真菌的任何多形状态均可被视为同一生物。例如，链格孢霉属是有性型露薇花属的无性型形式(Kwasna 2003)，因此两者应被理解为具有同一DNA序列的同一生物。例如，应理解枝顶孢霉属也在文献中被报道为帚枝霉属以及泰拉齐力蒂姆属(genus Tilachilidium)(Summerbell，2011)。例如，枝孢菌属是有性型戴维德拉属(genus Davidiella)的无性型(Bensch，2012)，并且应理解为描述同一生物。在一些情况下，真菌属已经归因于多种原因被重新分配，并且应理解所述命名法重新分配是在任何所要求的属的范围内。例如，微色二孢属的某些种已经在文献中被描述为属于拟盾壳霉属(Crous和Groenveld，2006)。

“内部转录间隔区”(ITS)是指位于染色体中的小的亚单位核糖体RNA(rRNA)和大的亚单位(LSU)rRNA基因之间的间隔区DNA(非编码DNA)或在多顺反子rRNA前体转录物中的相应转录区。ITS基因测序是得到充分确认的用于研究真菌的发展史和分类的方法。在一些情况下，“大的亚单位”(LSU)序列用于鉴别真菌。LSU基因测序是得到充分确认的用于研究真菌的发展史和分类的方法。本发明的一些内生真菌可由ITS序列描述并且一些可由LSU序列描述。关于确定分类学，两者应被理解为同样具描述性的并且精确的。

关于细菌或真菌的术语“病原体(pathogen)”和“病原体(pathogenic)”包括任何所述生物，其能够引起或影响包含所述生物的宿主的疾病、病症或病况。

“孢子”或“孢子”的群体是指细菌或真菌，其一般是可活的，比同一细菌或真菌的其它形式更能抵抗如热量和杀细菌剂或杀真菌剂等环境影响，并且典型地能够发芽和生长。“能够形成孢子”的细菌和真菌是包含在合适的环境条件下产生孢子的基因和其它必要能力的那些细菌和真菌。

“生物量”意指在给定时间，一种植物组织、多种植物组织、整个植物或植物的群体的总质量或重量(新鲜或干燥)。生物量通常以每单位面积的重量形式给出。所述术语还可指群落中的所有植物或物种(群落生物量)。

术语“分离的”意图特定地涉及生物、细胞、组织、聚核苷酸或多肽，其从其原始来源移出并且从最初与其缔合的额外组分纯化。例如，如果经过设计的复合内生菌从所述种子来源移出并且经过纯化，使得其从最初与其缔合的任何额外组分分离，那么所述经过设计的复合内生菌可被视为从种子分离的。同样，经过设计的复合内生菌可从植物或植物元素移出并且经过纯化，使得其是分离的并且不再与其来源植物或植物元素缔合。在一些情况下，术语“分离的”用于描述经过设计的复合内生菌的细菌，其已经从其宿主真菌移出

“宿主植物”包括任何植物，特别是具有农艺重要性的植物，经过设计的复合内生菌可定殖于其中。如本文所用，当内生菌可在如一天或多天、一周或多周、一个月或多个月或一年或多年等一段时间内在植物或种子内被稳定地检测到时，那么所述内生菌据说“定殖于”所述植物或种子中，换句话说，定殖实体并非短暂地与所述植物或种子缔合。在一些实施方案中，所述宿主植物是具有农艺重要性的植物。

“非宿主标靶”意指在接触包含内生菌的宿主植物或宿主真菌之后，由于所述内生菌赋予所述宿主植物或宿主真菌的特性而以某一方式发生改变的生物或化合物。

如本文所用，如果核酸序列具有与第二核酸序列相似的序列，那么所述核酸与所述第二核酸具有“同源性”或“同源”。在核酸序列的背景下，术语“同一性”、“百分比序列同一性”或“同一”是指当关于最大对应进行比对时在两个序列中相同的残基。本领域中已知多种不同的算法，所述算法可用于测量核苷酸序列同一性。例如，聚核苷酸序列可使用程序FASTA、Gap或Bestfit(Wisconsin Package Version 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wis)进行比较。FASTA提供了在查询与搜索序列之间的比对和最佳重叠区的百分比序列同一性。(Pearson，1990，Methods Enzymol.183∶63-98，以引用的方式整体并入本文中)。当提及核酸或其片段时，术语“实质同源性”或“实质相似性”指示了当与使用另一核酸(或其互补链)的适当核苷酸插入或缺失最佳比对时，核苷酸碱基存在至少约76％、80％、85％或至少约90％或至少约95％、96％、97％、98％99％、99.5％或100％的核苷酸序列同一性，如通过任何众所周知的序列同一性算法，如上文所论述的FASTA、BLAST或Gap所测量。在一些实施方案中，序列可使用Geneious(Biomatters，Ltd.，Auckland，New Zealand)进行比较。在其它实施方案中，聚核苷酸序列可使用多序列比对算法MUSCLE(Edgar RC，2004)进行比较。

如本文所用，术语“操作分类单位”、“OTU”、“分类单元”、“层次聚类”和“聚类”可互换使用。操作分类单位(OTU)是指一种或多种生物的组，其包含聚类树中的节点。聚类的水平通过其层次顺序来确定。在一个实施方案中，OTU是出于系统发生分析的目的暂时地被假定为有效分类单元的组。在另一实施方案中，OTU是在研究中的任何尚存的分类单位。在另一实施方案中，OTU被给定名称和等级。例如，OTU可表示域、子域、界、亚界、门、亚门、纲、亚纲、目、亚目、科、亚科、属、亚属或种。在一些实施方案中，OTU可表示来自真细菌界、原生生物界或真菌界的处于层次顺序的任何水平下的一种或多种生物。在一些实施方案中，OTU表示原核或真菌顺序。

在一些实施方案中，本发明使用植物元素的异源内生菌，例如来制造合成组合或农业制剂。如果未修饰的种子或幼苗(例如，未用本文所述的内生菌群体处理的种子或幼苗)不含可检测水平的微生物，那么所述微生物被认为相对于所述种子或植物是异源的。例如，本发明预期农业植物的种子或幼苗和内生菌微生物群体(例如，分离的细菌)的合成组合，其中所述微生物群体以有效定殖于所述植物中的量“异源地安置于”所述农业种子或幼苗的外表面上或组织内。当微生物以在应用所述微生物之前未在植物上发现的数目应用或安置于所述植物上时，所述微生物被认为“异源地安置于”表面上或植物(或组织)内。例如，安置于外表面上或种子内的内生菌群体可为内生细菌，其可与成熟植物缔合，但未在种子的表面上或种子内发现。因而，当微生物被应用于植物上，而所述植物的表面上或安置有所述微生物的特定组织内并未天然地具有所述微生物，或所述植物的表面上或所述特定组织内并未天然地具有正在应用的数目的所述微生物时，所述微生物被视为异源地进行安置。在另一实施例中，通常与柏科树样品的叶子组织缔合的内生菌将被认为相对于玉米植物的叶子组织是异源的。在另一实施例中，通常与玉米植物的叶子组织缔合的内生菌将被认为相对于天然地缺乏所述内生菌的另一玉米植物的叶子组织是异源的。在另一实施例中，如果较高浓度的通常以低水平缔合于植物中的经过设计的复合内生菌被引入至所述植物中，那么所述经过设计的复合内生菌被认为相对于所述植物是异源的。

在一些实施方案中，微生物可相对于种子或植物是“内源的”，或细菌可相对于与其一起形成经过设计的复合内生菌的真菌宿主是“内源的”。如本文所用，如果内生菌或内生菌组分是源于提供所述内生菌或内生菌组分的植物样本的植物元素或以其它方式发现于所述植物元素中，那么所述微生物被认为相对于植物或种子是“内源的”。此外，如果内生菌是源于真菌宿主或以其它方式发现于真菌宿主中，那么所述内生菌被认为相对于真菌宿主是“内源的”。例如，经过设计的复合内生菌可经过分离并且经过纯化，所述经过设计的复合内生菌包含真菌宿主和内源细菌。

术语“等值线”是比较术语，并且涉及在遗传学上同一但在处理方面可能不同的生物。在一个实施例中，两种在遗传学上同一的玉米植物胚胎可分成两个不同的组，一组接受处理(如用异源聚核苷酸转化，以产生在遗传学上经过修饰的植物)并且另一对照组不接受所述处理。所述两个组之间的任何表型差异均可因此单独地被归因于所述处理并且不归因于所述植物的遗传组成的任何固有性。在另一实施例中，两种在遗传学上同一的大豆种子可用引入内生菌组合物的制剂处理。在由那些种子生长的植物之间的任何表型差异均可归因于所述处理，因此形成等值线比较。

同样，术语“参考农业植物”意指未施用/接触如本文所述的处理、制剂、组合物或内生菌制剂的相同物种、品系或栽培变种的农业植物。因此，参考农业植物与经过处理的植物同一(除了所述内生菌的存在)并且可充当用于检测被赋予所述植物的内生菌的效应的对照物。

“参考环境”是指其中进行测量的植物的环境、处理或条件。例如，与内生菌缔合的植物中的化合物产生可在干旱胁迫的参考环境下测量，并且与在相同的干旱胁迫条件下参考农业植物中的化合物水平进行比较。或者，与内生菌缔合的植物和参考农业植物中的化合物水平可在同一的无胁迫条件下测量。

“植物元素”意图一般地涉及全植物或植物组分，包括但不限于植物组织、部分和细胞类型。植物元素可为以下一者：全植物、幼苗、分生组织、基本组织、维管组织、皮组织、种子、叶子、根、芽、茎、花、果实、匍匐枝、鳞茎、块茎、球茎、花柄长叶、芽、花蕾。如本文所用，“植物元素”与植物的“部分”同义，并且是指植物的任何部分，并且可包括不同的组织和/或器官，并且可在全文中与术语“组织”互换使用。

同样，“植物生殖元素”意图一般地涉及植物中能够经由所述植物的有性生殖或无性生殖开始其它植物的任何部分，例如但不限于：种子、幼苗、根、芽、匍匐枝、鳞茎、块茎、球茎、花柄长叶或花蕾。

如本文所用，“后代种子”是指由已经接种内生菌或与内生菌缔合的宿主植物产生的种子。例如，在本发明中，种子、植物元素或全植物可异源地与内生菌缔合，并且由所述种子生长的植物或与所述内生菌异源缔合生长的植物可本身产生后代种子，所述后代种子与从并未由与内生菌缔合的植物元素生长或获自已经在其生命周期的某一点与内生菌缔合的亲本(宿主)植物的植物获得的种子相比较包含改变的营养组合物。在一般意义上，措辞“后代种子”可被解释为表示由宿主植物产生的任何植物繁殖单位，其能够变成所述同一植物物种的另一个体。

如本文所用，植物的“群体”可指经受本文所述的相同接种方法的多株植物，或作为经受所述接种方法的植物或植物的组的后代的多株植物。另外，植物的群体可为从经过涂布的种子生长的植物的组。群体内的植物将典型地具有相同物种，并且还将典型地共享常见的遗传衍生化。

如本文所用，“农业种子”是用于使农业中典型地使用的植物(“农业植物”)生长的种子。所述种子可为单子叶或双子叶植物的，并且可种植用于农业产物(例如饲料、食物、纤维、燃料等)的产生。如本文所用，农业种子是制备用于种植的种子，例如，在农场中用于生长。

术语“合成组合”意指由人类努力缔合的多种元素，其中所述缔合未在自然界中发现。在本发明中，“合成组合”用于指与植物元素缔合的处理制剂。

“处理制剂”是指促进内生菌组合物的稳定性、存储和/或应用的化学品的混合物。在一些实施方案中，农业上可相容的载体可用于配制包括纯化的内生菌制剂的农业制剂或其它组合物。如本文所用，“农业上可相容的载体”是指除水以外的任何材料，其可添加至植物元素中而不会引起或对所述植物元素(例如，减少种子发芽)或从所述植物元素生长的植物等的不利影响。

与从不具有所述种子处理制剂的种子生长的等值线植物相比较，本文中的组合物和方法可向宿主植物提供改进的“农艺性状”或“具有农艺重要性的性状”，其可包括但不限于以下：疾病抗性、干旱耐受性、热耐受性、冷耐受性、盐耐受性、金属耐受性、除草剂耐受性、改进的水使用效率、改进的氮利用、改进的固氮、害虫抗性、食草类动物抗性、病原体抗性、产量改进、健康增强、活力改进、生长改进、光合性能改进、营养增强、改变的蛋白质含量、改变的油含量、增加的生物量、增加的芽长、增加的根长、改进的根构型、代谢物的调节、蛋白质组的调节、增加的种子重量、改变的种子碳水化合物组成、改变的种子油组成、改变的种子蛋白质组成、改变的种子营养品质性状。

措辞“营养品质性状”包括种子的任何可测量的参数，其直接地或间接地影响所述种子的价值(营养或经济)，例如但不限于：蛋白质、脂肪、碳水化合物、灰分、水分、纤维和卡路里。在一些情况下，“营养品质性状”与“营养品质性状”或“种子营养品质性状”同义，并且可指所缔合的植物元素的任何组合物，最特别是向消耗或使用所述植物元素的其它生物提供益处的组合物。

如本文所用，术语“水限制条件”和“干旱条件”，或“水限制”和“干旱”，或“水胁迫”和“干旱胁迫”均可互换使用。例如，一种用于改进植物在干旱条件下生长的能力的方法或组合物意指与在水限制条件下生长的能力相同。在所述情况下，所述植物据说可进一步展示改进的干旱耐受性。

另外，“改变的代谢功能”或“改变的酶功能”可包括但不限于以下：改变的植物生长素产生、改变的固氮、改变的抗微生物化合物产生、改变的含铁细胞产生、改变的矿物磷酸盐溶解、改变的纤维素酶产生、改变的甲壳质酶产生、改变的木聚糖酶产生、改变的乙偶姻产生。

“增加的产量”可指生物量或种子或果实重量、种子大小、每株植物的种子数目、每单位面积的种子数目、每英亩的蒲式耳数、每英亩的吨数、每公顷的千克数或碳水化合物产量的任何增加。典型地，当提及增加的产量(例如增加的谷粒产量)或增加的种子大小时，指定所述特定特征。

在一些情况下，本发明预期与农业化学品“可相容的”组合物的使用，所述农业化学品例如杀真菌剂、抗络合化合物或广泛用于农业中的具有杀死另一生物或以其它方式干扰另一生物的最佳生长的效应的任何其它试剂。如本文所用，当所述生物如通过遗传修饰进行修饰，例如含有赋予对除草剂的抗性的转基因，或经过调适以在用于农业中的农业化学品的浓度下生长或以其它方式生存时，组合物与农业化学品“可相容”。例如，如果安置于种子表面上的内生菌能够在应用于种子表面上的杀真菌剂甲霜灵浓度下生存，那么所述内生菌与杀真菌剂甲霜灵可相容。

如本文所用，“集落形成单位”(“CFU”)是用作样品中的活微生物的量度。CFU是能够在固体介质上形成可见集落的个别活细胞，所述集落的个别细胞通过一种亲本细胞的细胞分化衍生化。

如本文所用，术语“功效”(和其同义词，如“有效的”)描述了微生物执行其功能的能力。在一个非限制性实施例中，如果经过设计的复合内生菌能够执行功能，如改进与其缔合的植物的产量，那么据说其是有效的。在另一非限制性实施例中，如果内生细菌能够在一种条件对对照条件下执行特定功能，据说其展示改进的功效。

如本文所用，术语“降低的”、“较少”、“较缓慢”和“增加的”、“较快”、“增强的”、“较大”是指内生菌处理过的种子或所产生的植物的特征相对于未处理的种子或所产生的植物的降低或增加。例如，特征的降低可以是比未处理的对照物低至少1％、1％与2％之间、至少2％、2％与3％之间、至少3％、3％与4％之间、至少4％、4％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间、至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与25％之间、至少25％、25％与30％之间、至少30％、30％与35％之间、至少35％、35％与40％之间、至少40％、40％与45％之间、至少45％、45％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少约60％、60％与75％之间、至少75％、75％与80％之间、至少约80％、80％与90％之间、至少约90％、90％与100％之间、至少100％、100％与200％之间、至少200％、200％与300％之间、至少约300％、300％与400％之间、至少约400％或更高，并且增加可以是比未处理的对照物高至少1％、1％与2％之间、至少2％、2％与3％之间、至少3％、3％与4％之间、至少4％、4％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间、至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与25％之间、至少25％、25％与30％之间、至少30％、30％与35％之间、至少35％、35％与40％之间、至少40％、40％与45％之间、至少45％、45％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少约60％、60％与75％之间、至少75％、75％与80％之间、至少约80％、80％与90％之间、至少约90％、90％与100％之间、至少100％、100％与200％之间、至少200％、200％与300％之间、至少约300％、300％与400％之间、至少约400％或更高。

发明详述

如本文所证明，农业植物与被称作内生菌的共生微生物缔合，所述内生菌尤其是细菌和真菌，其可有助于植物生存和性能。然而，现代农业过程可能已经扰乱这种关系，导致增加的作物损失、减弱的胁迫抗逆性、生物多样性损失和日益增加的对外部化学品、肥料和其它不可持续的农业实践的依赖性。需要用于产生具有新颖的微生物组特性的植物的新颖方法，其可持续性地增加产量、胁迫抗逆性，并且降低肥料和化学品使用。

已知细菌的不同菌株的可变性质，还非常需要改进细菌微生物的生存力和功效的新颖方法，用于农业和其它领域。已知真菌的不同菌株的可变性质，还非常需要改进真菌微生物的生存力和功效的新颖方法，用于农业和其它领域。

目前，对于植物内生菌群落的公认观点聚焦于其同源衍生化，主要从其中生长所述植物的土壤群落衍生化(Hallman等人，(1997)Canadian Journal ofMicrobiology.43(10)：895-914)。在观察拟南芥中的内生菌与土壤微生物群之间的分类重叠时，据说“我们对内生菌隔室微生物组的精确定义应促进对来源于复合土壤群落的植物-微生物相互作用的受控分析(Our rigorous definition of an endophytic compartment microbiome should facilitate controlled dissection of plant-microbe interactions derived from complex soil communities)”(Lundberg等人，(2012)Nature.488，86-90)。本领域中对表示使植物内生菌衍生化的仓库的土壤存在强烈支持(Long等人，2010，New Phytologist 185：554-567，以引用的方式整体并入本文中)。。值得注意的植物-微生物相互作用(如菌根真菌和复合根瘤菌)适合植物宿主的基于土壤的定殖的范例并且看来主要与种子无关地自身建立。由于聚焦于使内生菌从其中目前正在生长标靶农业植物的土壤衍生化，已经无法实现植物产量和其它植物特征的商业上显著改进，如增加的根生物量、增加的根长、增加的高度、增加的芽长、增加的叶子数目、增加的水使用效率、增加的总体生物量、增加的谷粒产量、增加的光合速率、增加的对干旱的耐受性、增加的热耐受性、增加的盐耐受性、增加的对昆虫和线虫胁迫的抗性、增加的对真菌病原体的抗性、增加的对复合病原体的抗性、增加的对病毒病原体的抗性、可检测的对代谢物水平的调节和可检测的蛋白质组相对于参考植物的调节。

本发明人在本文中已经设想设计并且产生新颖的经过设计的复合内生菌组合物。在一些实施方案中，这些经过设计的复合内生菌组合物可用于有益于植物健康和胁迫耐受性，以及使用所述经过设计的复合内生菌组合物的方法，和使用新颖的经过设计的复合内生菌组合物来向宿主真菌或内共生真菌性细菌赋予新颖特征的方法。一方面，本发明提供内生菌实体的经过设计的组合，特别是包含异源细菌的宿主真菌或包含第二异源真菌的宿主真菌，所述组合未在自然界中发现。在一些实施方案中，这些经过设计的复合内生菌可与如种子等植物元素以合成方式组合，以向宿主植物赋予改进的农艺潜力和/或改进的农艺性状。在本发明的一方面，经过设计的内生菌组合物与如种子等植物元素以合成方式组合，以向宿主植物赋予改进的农艺潜力和/或改进的农艺性状。在本发明的另一方面，如内共生真菌性细菌或内共生真菌性真菌等内生真菌组分从其原生来源分离并且加以纯化并且以合成方式彼此组合以形成新颖的经过设计的复合内生菌，所述经过设计的复合内生菌接着与植物元素组合，以向宿主植物赋予改进的农艺潜力和/或改进的农艺性状。所述经过设计的复合内生菌可在与所述植物元素组合之前进一步加以操纵或与额外元素组合。

如本文所述，有益生物可强劲地来源于异源、内源或经过工程改造的来源，任选地加以培养，异源地施用于植物元素，并且由于所述施用，赋予多种有益特定。已知本领域中在内生菌微生物分离中观察到的变异性和关于植物宿主的组织的无效种子病原体定殖的先前观察结果，这是令人意外的。此外，已知分离的经过设计的复合内生菌先前尚未被证明能够穿透并且定殖于宿主组织中，异源安置的经过设计的复合内生菌从外部定殖于植物生殖元素中的能力是令人意外的。

部分地，本发明描述了经过设计的复合内生菌的制备，和种子和/或幼苗与异源经过设计的复合内生菌组合物的合成组合的产生，和包含所述合成组合的制剂，以及如下认知，即所述合成组合展示存在于农业植物和所缔合的由本发明人新近产生的经过设计的复合内生菌群体中的有益特性的多样性。所述有益特性包括代谢、转录物表达、蛋白质组改变、形态和对多种环境胁迫的抗逆性，和多种所述特性的组合。本发明还描述了使用所述经过设计的复合内生菌组合物来有益于与其缔合的宿主植物的方法。另外，本发明还描述了将异源组分引入至真菌中以产生经过设计的复合内生菌的方法，以及使所述经过设计的复合内生菌与植物元素缔合以实现宿主植物中的表型改变的方法。另外，本发明还描述了通过将细菌封装于真菌宿主中来改进细菌针对多种应用的生存力和功效的方法。

经过设计的复合内生菌组合物和制备方法

本文所述的经过设计的复合内生菌提供优于天然来源的内生菌的数种优势。通常发现于一种类型的环境中的细菌和真菌可向在不同类型的环境中发现的植物赋予意外的益处。改变一个区域中的农业条件(例如，归因于气候改变)可使原生植物易受胁迫、疾病和/或那些植物尚未适应的害虫。引入异源内生菌可向包含所述内生菌的植物赋予表型优势。

在一些实施方案中，本发明涉及如细菌和真菌等内生菌组分，其从来自除天然存在的内生菌以外的来源的天然存在的复合内生菌分离，并且被人工引入至宿主真菌中以产生新颖，并且被人工引入至宿主真菌中以产生新颖的经过设计的复合内生菌。在一些实施方案中，所述内生菌组分是从非植物来源，例如真菌或地衣分离。

在一些实施方案中，本发明涉及真菌作为内生菌实体的载体的用法，和产生并且使用所述真菌的方法。在所述情况下，所述真菌可充当如细菌或另一真菌等内生菌的保护机制。例如，可需要以使得内生细菌或内生真菌得到保护免于干燥、机械创伤或化学暴露的方式将所述内生细菌或内生真菌引入至植物元素中。在另一实施例中，可适用于将无芽孢内生真菌在宿主产芽孢真菌内引入至植物元素中。因此，本发明的一方面是充当内生菌载体的真菌。

在本发明的一方面，欲用作用于引入至植物宿主中的组合物的载体的真菌或欲用作内共生真菌性组分的未来宿主以产生新颖的经过设计的复合内生菌的真菌可通过去除原生缔合的内共生真菌性内生细菌组分来获得。

还预期地衣或地衣化真菌可能用作内生菌复合物中的宿主生物。地衣缔合的细菌、蓝细菌和/或真菌可以复合物形式或个别地用作内生菌。地衣本身也可用作内生菌组分的载体：例如，地衣可用于将内生细菌转移至植物元素。

在一些实施方案中，所述内生菌组分是从植物来源分离的。在本发明的一方面，适用于本发明的内生菌组分可从经过调适用于特定环境的植物或植物元素分离，所述特定环境包括但不限于具有水缺乏、盐度、急性和/或慢性热胁迫、急性和/或慢性冷胁迫、缺乏营养物的土壤(包括但不限于缺乏微量营养物的土壤、缺乏常量营养物(例如，钾、磷酸盐、氮)的土壤)、病原体胁迫(包括真菌、线虫、昆虫、病毒、复合病原体胁迫)的环境。

在本发明的一方面，适用于本发明的内生菌组分也可从经过调适用于特定环境的植物或植物元素分离，所述特定环境包括但不限于具有水缺乏、盐度、急性和/或慢性热胁迫、急性和/或慢性冷胁迫、缺乏营养物的土壤(包括但不限于缺乏微量营养物的土壤、缺乏常量营养物(例如，钾、磷酸盐、氮)的土壤)、病原体胁迫(包括真菌、线虫、昆虫、病毒、复合病原体胁迫)的环境。

在一个实施方案中，包含内生菌组分的植物从与其中通常生长所述植物的土壤类型不同的土壤类型收集。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从其中通常未发现所述农业植物的生态系统收集。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从具有不同于所述农业植物的最佳土壤pH范围的平均pH范围的土壤收集。在一个实施方案中，包含内生菌组分的植物从具有低于所述农业植物的正常生长温度的平均空气温度的环境收集。在一个实施方案中，包含内生菌组分的植物从具有高于所述农业植物的正常生长温度的平均空气温度的环境收集。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从具有低于由所述农业植物接收的最佳平均降雨量的平均降雨量的环境收集。在一个实施方案中，包含内生菌组分的植物从具有高于所述农业植物的最佳平均降雨量的平均降雨量的环境收集。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从具有不同于使所述农业植物生长的正常土壤类型的土壤水分分类的土壤类型收集。在一个实施方案中，包含内生菌组分的植物从具有低于所述农业植物的最佳平均降雨量的平均降雨量的环境收集。在一个实施方案中，包含内生菌组分的植物从具有高于所述农业植物的最佳平均降雨量的平均降雨量的环境收集。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从具有低于由在正常农业用地上在平均栽培实践下生长的农业植物预期的平均产量的产量的农业环境收集。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从具有低于由在正常农业用地上在平均栽培实践下生长的农业植物预期的平均产量的产量的农业环境收集。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从具有高于所述农业植物的最佳平均产量的平均产量的环境收集。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从具有高于所述农业植物的最佳平均产量的平均产量的环境收集。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从如下环境收集，其中土壤含有低于推荐的最佳含量的总氮以便实现在正常农业用地上在平均栽培实践下生长的植物的平均产量。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从如下环境收集，其中土壤含有高于推荐的最佳含量的总氮以便实现在正常农业用地上在平均栽培实践下生长的植物的平均产量。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从如下环境收集，其中土壤含有低于推荐的最佳含量的总磷以便实现在正常农业用地上在平均栽培实践下生长的植物的平均产量。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从如下环境收集，其中土壤含有高于推荐的最佳含量的总磷以便实现在正常农业用地上在平均栽培实践下生长的植物的平均产量。在另一实施方案中，包含经过设计的复合内生菌组分的植物从如下环境收集，其中土壤含有低于推荐的最佳含量的总钾以便实现在正常农业用地上在平均栽培实践下生长的植物的平均产量。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从如下环境收集，其中土壤含有高于推荐的最佳含量的总钾以便实现在正常农业用地上在平均栽培实践下生长的植物的平均产量。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从如下环境收集，其中土壤含有低于推荐的最佳含量的总硫以便实现在正常农业用地上在平均栽培实践下生长的植物的平均产量。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从如下环境收集，其中土壤含有高于推荐的最佳含量的总硫以便实现在正常农业用地上在平均栽培实践下生长的植物的平均产量。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从如下环境收集，其中土壤含有低于推荐的最佳含量的总钙以便实现在正常农业用地上在平均栽培实践下生长的植物的平均产量。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从如下环境收集，其中土壤含有低于推荐的最佳含量的总镁以便实现在正常农业用地上在平均栽培实践下生长的植物的平均产量。在另一实施方案中，包含内生菌组分的植物从如下环境收集，其中土壤含有高于推荐的最佳含量的总氯化钠(盐)以便实现在正常农业用地上在平均栽培实践下生长的植物的平均产量。

在一些实施方案中，本发明涉及纯化的分离的微生物群体(内生菌组分来源于其中)，所述群体包含来自例如玉米、小麦、稻、大麦、大豆、棉花、芥花、西红柿、其它农业植物或草的简单内生菌或经过设计的复合内生菌；包括所述纯化的群体的组合物，如农业制剂或制造物件，以及使用所述群体来制造合成组合或农业产品的方法。在优选实施方案中，本发明涉及经过设计的真菌群体，其包含已经被人工引入至宿主真菌中的内共生真菌性内生细菌或内共生真菌性内生真菌。

在优选实施方案中，本发明涉及经过设计的真菌群体，其包含已经被人工引入至宿主真菌中的内共生真菌性内生细菌或内共生真菌性内生真菌。

在一些实施方案中，本发明涉及真菌作为内生菌的载体的用法，和产生并且使用所述真菌的方法。在所述情况下，所述真菌可充当如细菌或另一真菌等内生菌的保护机制，否则所述内生菌在制剂中具有低生存力。例如，革兰氏阴性细菌在用于处理植物元素时不会良好生存。可需要以使得有益的内生细菌或真菌得到保护免于干燥、机械创伤或化学暴露的方式将所述内生细菌或内生真菌在宿主真菌内引入至植物元素中。在另一实施方案中，本发明涉及真菌部署无芽孢细菌或真菌的用法。在另一实施方案中，本发明涉及真菌部署产生结晶蛋白的细菌的用法。因此，本发明的一方面是充当内生菌载体以使得能够部署有益的细菌或真菌的真菌，否则所述有益的细菌或真菌可能无法变成产品。

还预期地衣或地衣化真菌可能是内生菌复合物中的宿主生物。地衣缔合的细菌、蓝细菌和/或真菌可以复合物形式或个别地用作内生菌。

组合或个别地用于制造合成组合物的经过设计的复合内生菌的组分也可获自多种不同植物的植物元素。在一个实施方案中，所述内生菌组分可获自相同或不同作物的植物元素，并且可来自与意图与所述组合物缔合的植物元素相同或不同的栽培变种或品种。

在另一实施方案中，用于组合物中或用于制造合成组合物的经过设计的复合内生菌的组分可获自意图与所述组合物缔合的农业植物的相同栽培变种或物种，或可获自农业植物的不同栽培变种或物种。例如，来自特定玉米品种的组分可经过分离，被人工引入至不同的宿主真菌中，并且被涂布于相同品种的玉米种子的表面上。

在另一实施方案中，用于组合物中或用于制造合成组合物的经过设计的复合内生菌的组分可获自与意图与所述组合物缔合的植物元素有关的植物的植物元素。例如，从一粒小麦(单粒小麦)分离的组分可被涂布于普通小麦(T.aestivum/common wheat)种子的表面上；或者，来自大麦(Hordeum vulgare/barley)的组分可经过分离，被人工引入至宿主真菌中，并且被涂布于小麦族的成员的种子，例如黑麦植物黑麦(Secale cereale)的种子上。

在另一实施方案中，用于组合物中或用于制造具有植物元素的合成组合物的经过设计的复合内生菌的组分可获自与欲与所述内生菌缔合的植物元素的关系较远的植物的植物元素。例如，西红柿源性的经过设计的复合内生菌组分可经过分离，被人工引入至宿主真菌中，并且被涂布于稻种子上。

在一些实施方案中，使用纯化的合成组合物，其包括两种或更多种(例如，3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、10种与15种之间、15种、15种与20种之间、20种、20种与25种之间、25种或超过25种)不同的经过设计的复合内生菌或不同的在一种宿主真菌内的内生菌组分。在每一种情况下，所述内生菌组分可获自不同的科或不同的属，或获自相同的属但不同的种。所述不同的内生菌组分可获自农业植物的相同栽培变种(例如，相同的玉米、小麦、稻或大麦植物)、相同农业植物的不同栽培变种(例如，玉米的两种或更多种栽培变种、小麦的两种或更多种栽培变种、稻的两种或更多种栽培变种或大麦的两种或更多种栽培变种)或相同类型的农业植物的不同种(例如，玉米的两种或更多种不同的种、小麦的两种或更多种不同的种、稻的两种或更多种不同的种或大麦的两种或更多种不同的种)。在其中使用两种或更多种经过设计的复合内生菌或两种或更多种在一种宿主真菌内的内生菌组分的实施方案中，所述内生菌各自可具有不同的特性或活性，例如产生不同的代谢物，产生不同的酶(如不同的水解酶)，赋予不同的有益性状，或定殖于植物的不同元素(例如，叶子、茎、花、果实、种子或根)中。例如，一种内生菌可定殖于第一组织中并且第二内生菌可定殖于不同于所述第一组织的组织中。内生菌的组合在下文中详细地公开。

在一个实施方案中，所述内生菌组分是从不同于经过接种的植物的植物分离的微生物。例如，在一个实施方案中，所述微生物是从与经过接种的植物相同种的不同植物分离的内生菌。在一些情况下，所述内生菌是从与经过接种的植物有关系的种分离的。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含以下分类单元中的一者或多者的真菌：枝顶孢霉属、链格孢霉属、曲霉属、短梗霉属、碳皮菌属、葡萄座腔菌属、葡萄孢属、布勒掷孢酵母属、尾孢菌属、刺盾霉目、枝孢菌属、旋孢腔菌属、盾壳霉属、隐球菌属、未分类隐球菌属、戴维德拉属、戴奥材吉雅属、座囊菌目、座囊菌纲、附球菌属、白粉菌属、担孢酵母属、镰刀菌属、赤霉属、汉纳酵母属、荷尔蒙菌属、炭团菌属、烧瓶状霉属、钩端螺旋体属、露薇花属、单格孢属、小幽线壳属、毛霉属、丛赤壳属、脉孢菌属、拟盾壳霉属、拟壳多孢属、青霉菌属、黑团孢属、拟盘多毛孢属、暗色单梗孢属、茎点霉属、叶点霉属、毕赤酵母属、格孢腔菌目、光黑壳属、根霉属、红冬孢属、粪壳菌纲、掷孢酵母属、荚孢腔菌科、壳多孢属、阿顿尼奥酵母属(Udeniomyces)、节担菌属、炭角菌属。在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含在表2中列出的那些或包含与表2中列出的真菌的ITS或LSU核酸序列中的至少一者(SEQ ID NO：561-758)至少97％同一的真菌ITS或LSU核酸序列的那些中选择的宿主真菌。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含来自枝孢菌属的真菌。在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含与选自由SEQ ID NO：576、613、615、622、629、666、684、692、694和757组成的组的序列至少97％同一的ITS核酸序列。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含来自毛霉属的真菌。在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含与SEQ ID NO：756至少97％同一的ITS核酸序列。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含来自拟盘多毛孢属的真菌。在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含与选自由SEQ ID NO：561、575、580和758组成的组的序列至少97％同一的ITS核酸序列。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含以下分类单元中的一者或多者的内共生真菌性内生真菌：枝顶孢霉属、链格孢霉属、曲霉属、短梗霉属、碳皮菌属、葡萄座腔菌属、葡萄孢属、布勒掷孢酵母属、尾孢菌属、刺盾霉目、枝孢菌属、旋孢腔菌属、盾壳霉属、隐球菌属、未分类隐球菌属、戴维德拉属、戴奥材吉雅属、座囊菌目、座囊菌纲、附球菌属、白粉菌属、担孢酵母属、镰刀菌属、赤霉属、汉纳酵母属、荷尔蒙菌属、炭团菌属、烧瓶状霉属、钩端螺旋体属、露薇花属、单格孢属、小幽线壳属、毛霉属、丛赤壳属、脉孢菌属、拟盾壳霉属、拟壳多孢属、青霉菌属、黑团孢属、拟盘多毛孢属、暗色单梗孢属、茎点霉属、叶点霉属、毕赤酵母属、格孢腔菌目、光黑壳属、根霉属、红冬孢属、粪壳菌纲、掷孢酵母属、荚孢腔菌科、壳多孢属、阿顿尼奥酵母属、节担菌属、炭角菌属。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含在表2中列出的那些或包含与表2中列出的真菌的ITS或LSU核酸序列中的至少一者(SEQ ID NO：561-758)至少97％同一的真菌ITS或LSU核酸序列的那些中选择的内共生真菌性内生真菌。

在本发明的一些实施方案中，所述内生菌为细菌。在一些情况下，细菌属已经归因于多种原因(如但不限于全基因组测序的发展领域)被重新分配，并且应理解所述命名法重新分配是在任何所要求的属的范围内。例如，欧文氏菌属的某些种已经在文献中被描述为属于泛菌属(Zhang和Qiu，2015)。

在本发明的一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含以下分类单元中的一者或多者的细菌：无色杆菌属、不动杆菌属、马杜拉放线菌属、放线孢菌属、游动放线菌属、阿德勒克罗伊茨氏菌属(Adlercreutzia)、气微菌属、阿菲波菌属、农杆菌属、产碱杆菌属、噬冷菌属、脂环酸芽孢杆菌属、布兰汉氏菌属、致病特有菌属、胞菌属、节杆菌属、不粘柄菌属、肉杆菌属、芽孢杆菌属、蛭弧菌属、拜叶林克氏菌属、包西氏属、短状杆菌属、慢生根瘤菌属、短芽胞杆菌属、短杆菌属、短波单胞菌属、伯克氏菌属、热解纤维素菌属、好热菌属、盐复活念珠菌(Candidatus Haloredivivus)、羧酸孢菌属、肉食杆菌属、柄杆菌属、纤维菌属、纤维弧菌属、金黄杆菌属、梭菌属、丛毛单胞菌属、雏菊珊瑚株菌(Coraliomargarita)、棒状杆菌属、短小杆菌属、DA101、奇异球菌属、戴尔福特菌属、德沃斯氏菌属、独岛菌属、成对杆菌属、戴氏菌属、水栖菌属、肠杆菌属、肠球菌属、欧文氏菌属、埃希氏菌属、埃希氏菌属/志贺氏菌属、微小杆菌属、铁丸菌属、费力莫纳什属(Filimonas)、芬沟德氏菌属、黄杆菌属、地芽孢杆菌属、盐杆菌属、盐单胞菌属、盐简菌属、草螺菌属、薄层菌属、紫色杆菌属、微杆菌属(Kaistobacter)、动球菌属、动孢囊菌属、小浴氏菌属、克里贝拉属、拉西菌属(Lacibacter)、乳杆菌属、乳球菌属、伦茨氏菌属、明串珠菌属、藤黄色杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、溶杆菌属、马赛菌属、中慢生根瘤菌属、甲基养菌属、甲基杆菌属、微杆菌属、微球菌属、分枝杆菌属、枝动杆菌属、支原体、类诺卡氏菌属、新鞘氨醇杆菌属、奥卡河杆菌属、寡养菌属、丰祐菌属、稻田土壤菌属、类芽孢杆菌属、泛菌属、副球菌属、土地杆菌属、派罗莫纳什属(Pelomonas)、嗜蛋白胨菌属、吞菌弧菌属、透明乐果菌属(Perlucidibaca)、噬染料菌属、极单胞菌属、多核杆菌属、原小单孢菌属、丙酸杆菌属、假棍状杆菌属、假单胞菌属、四折叠球菌属、罗尔斯顿菌属、拉氏杆菌属、根瘤菌属、产黄杆菌属、红细菌属、红球菌属、红游动菌属、红假单胞菌属、糖芽胞杆菌属、盐地杆菌属、血杆菌属、塞巴鲁德氏菌属、沉积物杆状菌属、沙雷氏菌属、中国孢子囊属(Sinosporangium)、斯科曼氏菌属、土壤芽孢杆菌属、鞘酯单胞菌属、鞘氨醇盒菌属、葡萄球菌属、窄食单胞菌属、链球菌属、链霉菌属、憎叶菌属、硫磺球形菌属、嗜热厌氧杆菌属、贪噬菌属、魏斯氏菌属、威廉斯菌属、黄单胞菌属、朴勇河氏菌属、齐默曼氏菌属。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含在表1中列出的那些或包含与表1中列出的细菌的16S核酸序列中的至少一者(SEQ ID NO：1-549)至少97％同一的16S核酸序列的那些中选择的内共生真菌性内生细菌。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含来自链霉菌属的细菌。在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含与选自由SEQ ID NO：550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、130、324、394和532组成的组的序列至少97％同一的16S核酸序列。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含来自藤黄色杆菌属的细菌。在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含与选自由SEQ ID NO：9、31、40、45、46、48、58、59、60、61、63、64、65、66、67、68、175、176、195、196、397和549组成的组的序列至少97％同一的16S核酸序列。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含来自泛菌属的细菌。在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含与选自由SEQ ID NO：47、55、57、237、416、459和548组成的组的序列至少97％同一的16S核酸序列。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含来自类芽孢杆菌属的细菌。在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌包含与选自由SEQ ID NO：4、5、11、12、13、17、18、19、21、22、23、24、25、26、36、37、51、52、245、248、253、277、347、462、495和547组成的组的序列至少97％同一的16S核酸序列。

本发明的经过设计的复合内生菌可个别地包含单一额外组分(例如，宿主真菌可包含单一内共生真菌性内生细菌)、相同类型的多种组分(例如，宿主真菌可包含不同品系的多种内共生真菌性内生细菌)或不同类型的多种组分(例如，宿主真菌可包含不同品系的多种内共生真菌性内生细菌；在另一实施例中，宿主真菌可包含内共生真菌性内生细菌和内共生真菌性内生真菌)。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌是真菌宿主和内生细菌的特定组合，例如包含与表1的细菌序列至少97％同一的组合物和与表2的真菌序列至少97％同一的组合物的组合。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌是真菌宿主和多种不同的内生细菌的特定组合，例如包含与表2的真菌序列至少97％同一的组合物和多种细菌的组合，所述细菌中的至少一者与表1的细菌序列至少97％同一。

在其它实施方案中，所述经过设计的复合内生菌是单一细菌组合物和单一真菌组合物的特定组合，选自表3中所述的经过设计的复合内生菌之一。

在一些情况下，所述经过设计的复合内生菌组分或超过一种组分具有单克隆起点，从而提供了所述经过设计的复合内生菌群体在农业制剂中或在具有所述内生菌的合成种子或植物组合中的高遗传均一性。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌可在培养基上培养或可经过调适以在培养基上培养。

在一些实施方案中，本文中所提供的组合物是稳定的。所述内共生真菌性内生细菌、内共生真菌性内生真菌或经过设计的复合内生菌可为货架期稳定的，其中在4℃下或在室温下以干燥形式(即，30％或更低的水分含量)存储持续1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或超过10周后，所述CFU的至少10％是可活的。任选地，货架期稳定的制剂是呈干制剂、粉末制剂或冻干制剂形式。在一些实施方案中，所述制剂经过配制以对内共生真菌性内生细菌、内共生真菌性内生真菌或经过设计的复合内生菌的群体提供稳定性。在一个实施方案中，所述制剂在约0℃与约50℃之间的温度下大体上稳定持续至少约1天、2天、3天、4天、5天或6天，或1周、2周、3周或4周，或1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月，或一年或多年。在另一实施方案中，所述制剂在约4℃与约37℃之间的温度下大体上稳定持续至少约5天、10天、15天、20天、25天、30天或超过30天。

经过设计的复合内生菌和经过设计的复合内生菌组分的功能属性

在一些情况下，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分可产生一种或多种化合物和/或具有一种或多种活性，例如以下一者或多者：代谢物的产生、如植物生长素等植物激素的产生、乙偶姻的产生、抗微生物化合物的产生、含铁细胞的产生、纤维素酶的产生、果胶酶的产生、甲壳质酶的产生、木聚糖酶的产生、固氮或矿物磷酸盐溶解。例如，经过设计的复合内生菌或内生菌组分可产生选自由植物生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯、油菜素类固醇和脱落酸组成的组的植物激素。在一个特定实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分产生植物生长素(例如，吲哚-3-乙酸(IAA))。植物生长素的产生可如本文所述加以分析。多种本文所述的微生物当在培养物中生长时能够产生植物激素植物生长素吲哚-3-乙酸(IAA)。植物生长素在改变植物的生理学(包括根生长的程度)中发挥关键作用。因此，在另一实施方案中，所述经过设计的复合内生菌群体以当与参考农业植物相比较时有效可检测地增加农业植物中的植物生长素产生的量安置于种子或幼苗的表面上或组织内。在一个实施方案中，增加的植物生长素产生可在选自由根、芽、叶子和花组成的组的组织类型中检测到。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分可产生具有抗微生物特性的化合物。例如，所述化合物可具有抗细菌特性，如通过本文中所提供的生长分析来确定。在一个实施方案中，所述具有抗细菌特性的化合物显示针对大肠杆菌和/或芽孢杆菌属的细菌抑制或杀细菌活性。在另一实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分产生具有抗真菌特性，例如针对酿酒酵母和/或丝核菌的杀真菌或抑制真菌活性的化合物。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分包含能够固氮的细菌，并且因此能够从大气氮产生铵。细菌固氮的能力可通过测试所述细菌在无氮生长培养基(例如，LGI培养基)中的生长来确认，如本领域中已知的方法中所述。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分可产生增加矿物磷酸盐在所述培养基中的溶解度(即，矿物磷酸盐溶解)的化合物，例如，使用本文中所述的生长分析。在一个实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分产生允许所述细菌在含有Ca3HPO4作为唯一磷酸盐来源的生长培养基中生长的化合物。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分可产生含铁细胞。含铁细胞是由增加铁的生物可用性的微生物分泌的小型高亲和力铁螯合剂。所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分的含铁细胞产生可使用本领域中已知的方法来检测。

在一些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分可产生水解酶。例如，在一个实施方案中，经过设计的复合内生菌或内生菌组分可产生选自由纤维素酶、果胶酶、甲壳质酶和木聚糖酶组成的组的水解酶。水解酶可使用本领域中已知的方法来检测。

在一些实施方案中，所述复合内生菌对组分真菌或细菌提供改进的属性。在一些情况下，一种生物的存在有益于另一生物，并且可为任一组分的多种机制或所述两种生物的组合的协同效应的结果。在一些实施方案中，所述改进的属性是改进的内生细菌产生结晶蛋白的能力。在一些实施方案中，所述改进的属性是改进的宿主真菌形成孢子的能力。

经过设计的复合内生菌和经过设计的复合内生菌组分的组合

经过设计的复合内生菌或内生菌组分的组合可通过数种标准中的任一者或多者来选择。在一个实施方案中，选择可相容的经过设计的复合内生菌或内生菌组分。如本文所用，相容性是指经过设计的复合内生菌群体或内生菌组分的群体，其不会显著地干扰另一者的生长、繁殖和/或有益物质的产生。不相容群体可例如在所述群体或组分之一会产生或分泌对其它群体或组分的生长有毒或有害的化合物的情形中出现。由有害化合物/试剂的产生引起的不相容性可使用本领域中已知并且如本文中别处所述的方法来检测。同样，不同的群体可以使得难以共存的方式竞争有限的资源。

在另一实施方案中，基于由经过设计的复合内生菌或内生菌组分的各群体或组分产生的化合物来选择组合或组分。例如，第一群体或组分能够产生含铁细胞，并且另一群体或组分能够产生抗真菌化合物。在一个实施方案中，经过设计的复合内生菌或内生菌组分的第一群体或组分能够执行选自由植物生长素产生、固氮、抗微生物化合物的产生、含铁细胞产生、矿物磷酸盐溶解、纤维素酶产生、甲壳质酶产生、木聚糖酶产生和乙偶姻产生组成的组的功能。在另一实施方案中，经过设计的复合内生菌或内生菌组分的第二群体能够执行选自由植物生长素产生、固氮、抗微生物化合物的产生、含铁细胞产生、矿物磷酸盐溶解、纤维素酶产生、甲壳质酶产生、木聚糖酶产生和乙偶姻产生组成的组的功能。在另一实施方案中，所述第一和第二群体能够执行至少一种不同的功能。

在另一实施方案中，经过设计的复合内生菌或内生菌组分的组合在定殖之后针对其在植物中的不同定位加以选择。例如，经过设计的复合内生菌或内生菌组分的第一群体可定殖于并且在一些情况下优先地定殖于根组织中，而第二群体可基于其在农业植物的地上部分中的优先定殖加以选择。因此，在一个实施方案中，所述第一群体或组分能够定殖于选自由根、芽、叶子、花和种子组成的组的组织中的一者或多者中。在另一实施方案中，所述第二群体能够定殖于选自由根、芽、叶子、花和种子组成的组的一种或多种组织中。在另一实施方案中，所述第一和第二群体或组分能够定殖于所述农业植物内的不同组织中。

在另一实施方案中，经过设计的复合内生菌或内生菌组分的组合是针对其个别地或以与其它内生菌的协同缔合对经过接种的农业植物赋予一种或多种不同的适应性状的能力加以选择。或者，两种或更多种内生菌诱导第三内生菌的定殖。例如，经过设计的复合内生菌或内生菌组分的第一群体是基于其赋予生物量的显著增加而加以选择，而第二群体或组分会促进经过接种的农业植物的增加的干旱耐受性。因此，在一个实施方案中，所述第一群体或组分能够赋予选自由热耐受性、除草剂耐受性、干旱抗性、昆虫抗性、真菌抗性、病毒抗性、细菌抗性、雄性不育性、冷耐受性、盐耐受性、增加的产量、增强的营养物使用效率、增加的氮使用效率、增加的可发酵碳水化合物含量、减少的木质素含量、增加的抗氧化剂含量、增强的水使用效率、增加的活力、增加的发芽效率、较早或增加的开花、增加的生物量、改变的根芽生物量比率、增强的土壤持水力或其组合组成的组的至少一种性状。在另一实施方案中，所述第二群体或组分能够赋予选自由热耐受性、除草剂耐受性、干旱抗性、昆虫抗性、真菌抗性、病毒抗性、细菌抗性、雄性不育性、冷耐受性、盐耐受性、增加的产量、增强的营养物使用效率、增加的氮使用效率、增加的可发酵碳水化合物含量、减少的木质素含量、增加的抗氧化剂含量、增强的水使用效率、增加的活力、增加的发芽效率、较早或增加的开花、增加的生物量、改变的根芽生物量比率和增强的土壤持水力组成的组的性状。在另一实施方案中，所述第一和第二群体或组分中的每一者均能够赋予选自由热耐受性、除草剂耐受性、干旱抗性、昆虫抗性、真菌抗性、病毒抗性、细菌抗性、雄性不育性、冷耐受性、盐耐受性、增加的产量、增强的营养物使用效率、增加的氮使用效率、增加的可发酵碳水化合物含量、减少的木质素含量、增加的抗氧化剂含量、增强的水使用效率、增加的活力、增加的发芽效率、较早或增加的开花、增加的生物量、改变的根芽生物量比率和增强的土壤持水力组成的组的不同性状。

经过设计的复合内生菌或内生菌组分的组合也可基于以上标准的组合加以选择。例如，经过设计的复合内生菌或内生菌组分的第一群体可基于其产生的化合物加以选择(例如，其固氮的能力，因此向植物提供潜在氮源)，而所述第二群体可基于其赋予所述植物增加的对病原体(例如，真菌病原体)的抗性的能力加以选择。

在本发明的一些方面，预期经过设计的复合内生菌或组分的组合由于相加效应可向宿主植物提供如与由单一内生菌赋予的益处相比较增加的益处。例如，一种在宿主植物中诱导益处的内生菌或内生菌组分品系可在又用也在宿主植物中诱导相同益处的不同的内生菌或内生菌组分品系定殖的植物中充分相当地诱导所述益处。所述宿主植物因此展现与用多种不同的内生菌品系中的各个别内生菌定殖的个别植物的相加益处相同的来自所述多种品系的总益处。在一个实施例中，植物用两种不同的内生菌品系定殖：一种当与所述植物缔合时提供种子蛋白质含量的1X增加，并且另一种当与不同植物缔合时提供种子蛋白质含量的2X增加。当两种内生菌品系与同一植物缔合时，所述植物将经历种子蛋白质含量的3X(1X+2X单一效应的相加)增加。在另一实施例中，经过设计的复合内生菌的细菌组分向宿主植物提供1X益处，并且经过设计的真菌组分向宿主植物提供2X益处。当所述细菌被引入至所述真菌中以产生新颖的经过设计的复合内生菌时，如果所述新颖的经过设计的复合内生菌向植物提供3X益处，那么将是相加效应。相加效应是本发明的一个令人惊讶的方面，因为内生菌的不可相容性可导致两种内生菌的有益效应的取消。

在本发明的一些方面，预期经过设计的复合内生菌或组分的组合由于协同效应可向宿主植物提供如与由单一内生菌赋予的益处相比较增加的益处。例如，一种在宿主植物中诱导益处的内生菌品系可在又用也在宿主植物中诱导所述益处的不同的内生菌品系定殖的植物中诱导超过相加效应的所述益处。所述宿主植物因此展现大于将从用多种不同的内生菌品系中的各个别内生菌定殖的个别植物的相加益处所预期的来自所述多种品系的总益处。在一个实施例中，植物用两种不同的内生菌品系定殖：一种当与植物缔合时提供种子蛋白质含量的1X增加，并且另一种当与不同植物缔合时提供种子蛋白质含量的2X增加。当两种内生菌品系与同一植物缔合时，所述植物将经历种子蛋白质含量的5X(大于1X+2X单一效应的相加)增加。在另一实施例中，经过设计的复合内生菌的细菌组分向宿主植物提供1X益处，并且经过设计的真菌组分向宿主植物提供2X益处。当所述细菌被引入至所述真菌中以产生新颖的经过设计的复合内生菌时，如果所述新颖的经过设计的复合内生菌向植物提供5X益处，那么将是相加效应。协同效应是本发明的一个令人惊讶的方面。

经过设计的复合内生菌和与植物和植物元素的合成组合

预期本发明的方法和组合物可用于改进任何农业植物的任何特征。本文所述的方法还可用于包含一种或多种外源转基因的转基因植物，例如以生成由新近引入的内生菌微生物赋予的额外性状益处。因此，在一个实施方案中，使转基因玉米、小麦、稻、棉花、芥花、紫花苜蓿、高粱、大豆、大麦或其它植物的植物元素与经过设计的复合内生菌或组分接触。

在一些实施方案中，本发明预期经过设计的复合内生菌的使用，所述经过设计的复合内生菌可对与其缔合的植物元素或所产生的植物赋予有益的农艺性状。

在一些情况下，本文所述的经过设计的复合内生菌或组分能够从一种组织类型移动至另一组织类型。例如，在涂布于植物元素的外面后本发明对植物的成熟组织内的经过设计的复合内生菌的检测和分离证明了所述经过设计的复合内生菌或组分从植物元素外面移动至成熟植物的营养组织中的能力。因此，在一个实施方案中，经过设计的复合内生菌或组分的群体能够从种子外面移动至植物的营养组织中。在一个实施方案中，涂布于植物的种子上的经过设计的复合内生菌或内生菌组分在种子发芽成营养组织时能够定位于所述植物的不同组织。例如，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分能够定位于所述植物中的任一组织，包括：根、不定根、种子根、根毛、芽、叶子、花、花蕾、穗、分生组织、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实、匍匐枝、根茎、小结节、块茎、毛状体、保卫细胞、排水器、花瓣、萼片、颖苞、花轴、维管形成层、韧皮部和木质部。在一个实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分能够定位于植物的根和/或根毛。在另一实施方案中，所述经过设计的内生菌或内生菌组分能够定位于植物的光合组织，例如叶子和芽。在其它情况下，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分定位于植物的维管组织，例如木质部和韧皮部中。在另一实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分能够定位于植物的生殖组织(花、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实)。在另一实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分能够定位于植物的根、芽、叶子和生殖组织。在另一实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分定殖于植物的果实或种子组织。在另一实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分能够定殖于所述植物，以致其存在于所述植物的表面中(即，其存在可检测性地存在于植物外面，或所述植物的上半球)。在其它实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分能够定位于所述植物的大体上全部或全部组织。在某些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分并未定位于植物的根。在其它情况下，所述经过设计的内生菌或内生菌组分并未定位于植物的光合组织。

在一些情况下，所述经过设计的复合内生菌或其组分能够在宿主植物内复制并且定殖于所述植物。

在一些实施方案中，本文所述的经过设计的复合内生菌群体或组分能够定殖于宿主植物。成功定殖可通过检测真菌群体在所述植物内的存在来确认。例如，在将经过设计的复合内生菌应用于种子后，所述真菌和/或细菌的高效价可在从所述种子发芽的植物的根和芽中检测到。检测所述经过设计的复合内生菌或组分在植物内部的存在可通过在所述种子或所述植物的表面灭菌后测量所述经过设计的复合内生菌的生活力来实现：经过设计的复合内生菌或组分定殖导致所述经过设计的复合内生菌或其组分之一的内部定位，使其抵抗表面灭菌的条件。所述经过设计的复合内生菌的存在或质量也可使用本领域中已知的其它方式来实现，例如使用微生物特异性抗体的免疫荧光显微镜方法或荧光原位杂交(参见例如Amann等人(2001)Current Opinion in Biotechnology 12：231-236，以引用的方式整体并入本文中)。或者，识别来自经过设计的内生真菌或细菌的保守序列的特异性核酸探针可用于例如通过定量PCR来扩增区域，并且借助于标准曲线与集落形成单位(CFU)相关联。

在一些情况下，植物接种经过设计的复合内生菌，所述经过设计的复合内生菌的组分是从与经过接种的植物的植物元素相同物种的植物分离的。例如，通常发现于玉米(Zea mays/corn)的一个品种中的内生菌组分与玉米的另一品种的植物的植物元素缔合，所述另一品种在其自然状态下缺乏所述内生菌组分。在一个实施方案中，内生菌组分来源于与经过接种的植物的植物元素相关的植物物种的植物。例如，通常发现于二倍体多年生类玉米(Zea diploperennis/diploperennial teosinte)中的内生菌组分应用于玉米，或反之亦然。在一些情况下，植物接种经过接种的植物的植物元素的异源内生菌组分。在一个实施方案中，内生菌组分来源于另一物种的植物。例如，通常发现于双子叶植物中的内生菌组分应用于单子叶植物(例如，用大豆源性内生菌接种玉米)，或反之亦然。在其它情况下，欲接种于植物上的内生菌组分来源于正在接种的植物的相关物种。在一个实施方案中，内生菌组分来源于例如来自相关物种的相关分类单位。另一物种的植物可为农业植物。

在另一实施方案中，所述经过设计的复合内生菌以在成熟农业植物中可检测的有效量安置于例如农业植物的生殖元素的表面上。在一个实施方案中，所述内生菌以在成熟农业植物中可检测的有效量被安置，所述量为至少约100个CFU、100与200个CFU之间、至少约200个CFU、200与300个CFU之间、至少约300个CFU、300与400个CFU之间、至少约500个CFU、500与1,000个CFU之间、至少约1,000个CFU、1,000与3,000个CFU之间、至少约3,000个CFU、3,000与10,000个CFU之间、至少约10,000个CFU、10,000与30,000个CFU之间、至少约30,000个CFU、30,000与100,000个CFU之间、至少约100,000个CFU或更高。

在一些情况下，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分能够定殖于植物的特定植物元素或组织类型。在一个实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分以在选自果实、种子、叶子或根或其部分的成熟农业植物的标靶组织内可检测的有效量安置于种子或幼苗上。例如，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分可以至少约100个CFU、100与200个CFU之间、至少约200个CFU、200与300个CFU之间、至少约300个CFU、300与500个CFU之间、至少约500个CFU、500与1,000个CFU之间、至少约1,000个CFU、1,000与3,000个CFU之间、至少约3,000个CFU、3,000与10,000个CFU之间、至少约10,000个CFU、10,000个CFU与30,000个CFU之间、至少约30,000个CFU、30,000与100,000个CFU之间、至少约100,000个CFU或高于100,000个CFU的量在成熟农业植物的标靶组织中检测到。

可与农用化学品相容的内生菌

在某些实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分基于其与通常使用的农用化学品的可相容性加以选择。如早先所提及，植物、特别是农业植物可用多种农用化学品，包括杀真菌剂、生物杀灭剂(抗络合剂)、除草剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、灭鼠剂、肥料和其它试剂处理。

在一些情况下，重要的是所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分可与农用化学品、特别是具有杀真菌或抗络合特性的那些相容以便留在植物中，不过如早先所提及，有多种所述杀真菌剂或抗络合剂不会穿透所述植物，至少其浓度足以干扰所述经过设计的复合内生菌。因此，在内吸杀真菌剂或抗络合剂用于所述植物中时，欲接种所述试剂的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的可相容性将成为重要标准。

在一个实施方案中，可与农用化学品相容的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的天然分离菌可用于根据本文所述的方法接种植物。例如，可与农业上使用的杀真菌剂相容的经过设计的复合内生菌或组分可通过将所述经过设计的复合内生菌的培养物接种于含有有效浓度的所述杀真菌剂的皮氏培养皿上，并且分离可与所述杀真菌剂相容的经过设计的复合内生菌的集落来进行分离。在另一实施方案中，可与杀真菌剂相容的经过设计的复合内生菌或内生菌组分用于本文所述的方法中。

杀真菌剂和杀细菌剂相容性的经过设计的复合内生菌或组分也可通过液体培养基上的选择来进行分离。经过设计的复合内生菌的培养物可接种于皮氏培养皿上而无任何形式的诱变；或者，所述经过设计的复合内生菌可使用本领域中已知的任何方式发生诱变。例如，经过设计的复合内生菌或内生菌组分培养物可在含杀真菌剂培养基上的选择之前暴露于UV光、γ-照射或如甲烷磺酸乙酯(EMS)等化学诱变剂。最后，在已知特定杀真菌剂或杀细菌剂的作用机制的情况下，标靶基因可特异性地发生突变(通过基因缺失、基因置换、定点诱变等)以产生抗逆所述特定化学品的经过设计的复合内生菌。注意，上述方法可用于分离可与抑制真菌和杀真菌化合物以及抑制细菌和杀细菌化合物相容的经过设计的复合内生菌。

本领域技术人员还应理解，植物可例如在植物生长的不同阶段同时或接连地暴露于多种类型的杀真菌剂或抗络合化合物。在标靶植物有可能暴露于多种杀真菌剂和/或抗络合剂的情况下，可与这些农用化学品中的多种或全部相容的经过设计的复合内生菌或内生菌组分可用于接种所述植物。可与数种杀真菌剂相容的经过设计的复合内生菌或内生菌组分可例如通过连续选择来分离。可与第一杀真菌剂相容的经过设计的复合内生菌或内生菌组分可如上文所述来分离(具有或不具有先前诱变)。所产生的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的培养物可接着针对在含有第二抗真菌化合物的液体或固体培养基上生长的能力加以选择(再一次，具有或不具有先前诱变)。接着测试从第二次选择分离的集落以确认其与两种抗真菌化合物的可相容性。

同样，可与农业上使用的生物杀灭剂(包括如草甘膦等除草剂或抗络合化合物，无论细菌抑制的抑或杀细菌的)相容的经过设计的复合内生菌或组分可使用与关于分离杀真菌剂相容性的经过设计的复合内生菌或组分所述的那些相似的方法来分离。在一个实施方案中，经过设计的复合内生菌或内生菌组分群体的诱变可在用抗络合剂选择之前执行。在另一实施方案中，对不具有先前诱变的经过设计的复合内生菌或内生菌组分群体执行选择。在另一实施方案中，对经过设计的复合内生菌或内生菌组分执行连续选择：所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分首先针对与第一抗络合剂的可相容性加以选择。接着培养所分离的可相容的经过设计的复合内生菌或内生菌组分并且针对与第二抗络合剂的可相容性加以选择。因此分离的任何集落均针对与每一种或两种抗络合剂的可相容性加以选择以确认与这两种试剂的可相容性。

与抗微生物剂的可相容性可通过本领域中已知的多种方式，包括未修饰和经过修饰的内生菌的最小抑制浓度(MIC)的比较来确定。因此，在一个实施方案中，本发明公开了一种分离的经过设计的复合内生菌或内生菌组分，其中所述内生菌经过修饰以致当与未修饰的内生菌比较时其展现大至少3倍，例如大至少5倍、大5倍与10倍之间、大至少10倍、大10倍与20倍之间、大至少20倍、大20倍与30倍之间、大至少30倍或更大的对于抗微生物剂的MIC。

在一个特定实施方案中，本文中公开了具有增强的与除草剂草甘膦的可相容性的经过设计的复合内生菌和组分。在一个实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分在包含至少1mM草甘膦，例如1mM与2mM之间草甘膦、至少2mM草甘膦、2mM与5mM之间草甘膦、至少5mM草甘膦、5mM与10mM之间草甘膦、至少10mM草甘膦、10mM与15mM之间草甘膦、至少15mM草甘膦或更多的生长培养基中的倍增时间是所述内生菌在不包含草甘膦的相同生长培养基中的倍增时间的不超过250％、250％与100％之间，例如不超过200％、200％与175％之间、不超过175％、175％与150％之间、不超过150％、150％与125％之间或不超过125％。在一个特定实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分在包含5mM草甘膦的生长培养基中的倍增时间是所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分在不包含草甘膦的相同生长培养基中的倍增时间的不超过150％。

在另一实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分在包含至少10 ppm草甘膦、10与15ppm之间，例如至少15ppm草甘膦、15与10 ppm之间、至少20ppm草甘膦、20与30ppm之间、至少30ppm草甘膦、30与40ppm之间、至少40ppm草甘膦或更多的植物组织中的倍增时间是所述内生菌在不包含草甘膦的参考植物组织中的倍增时间的不超过250％、250％与200％之间，例如不超过200％、200％与175％之间、不超过175％、175％与150％之间、不超过150％、150％与125％之间或不超过125％。在一个特定实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分在包含40ppm草甘膦的植物组织中的倍增时间是所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分在不包含草甘膦的参考植物组织中的倍增时间的不超过150％。

上文所述的选择过程可重复以鉴别可与大量的抗真菌剂或抗络合剂相容的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的分离菌。

可测试候选分离菌以确保关于农用化学品可相容性的选择不会导致所需生物活性的损失。可与常用的杀真菌剂相容的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的分离菌可如上文所述加以选择。所产生的可相容的经过设计的复合内生菌或内生菌组分可与植物上的亲本经过设计的复合内生菌或内生菌组分比较其促进发芽的能力。

如上文所述产生的农用化学品可相容的经过设计的复合内生菌或内生菌组分可在样品中进行检测。例如，在引入转基因以使所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分与农用化学品可相容的情况下，所述转基因可用作用于通过PCR扩增并且检测的标靶基因。另外，在特异性基因或多种基因的一部分的点突变或缺失会引起与农用化学品的可相容性的情况下，所述独特的点突变同样可通过PCR或本领域中已知的其它方式来检测。所述方法允许所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分的检测，即使其不再是活的。因此，使用本文所述的农用化学品可相容的经过设计的复合内生菌或内生菌组分产生的商业化植物产品可容易地通过使用这些和相关的核酸检测方法来鉴别。

植物元素和经过设计的复合内生菌的合成组合的有益属性

由所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分赋予的改进的属性

本发明预期共生体在植物元素中的建立。在一个实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分缔合导致植物元素、特别是种子或全植物的可检测的改变。所述可检测的改变可为多种农艺性状的改进(例如，所述植物或植物部分(包括果实和谷粒)的改进的一般健康状况、增加的对生物或非生物胁迫的反应或增强的特性)。或者，所述可检测的改变可为可通过本领域中已知的方法测量的生理学或生物改变。所述可检测的改变在以下部分中更详细地加以描述。如本文所用，经过设计的复合内生菌或内生菌组分被认为已经赋予改进的农业性状，无论是由所述植物、所述经过设计的复合内生菌或组分引起的改进的性状，抑或在前述任一者或全部之间的协同作用。因此，例如，无论有益的激素或化学品是否是由所述植物或经过设计的复合内生菌或内生菌组分产生，出于本发明的目的，所述经过设计的复合内生菌均将被视为已经对宿主植物赋予改进的农艺性状。

在一些实施方案中，植物-内生菌(经过设计的或组分)组合在农业植物中赋予农艺益处。在一些实施方案中，所述农艺性状是选自由相对于参考植物改变的油含量、改变的蛋白质含量、改变的种子碳水化合物组成、改变的种子油组成和改变的种子蛋白质组成、化学耐受性、冷耐受性、延迟的衰老、疾病抗性、干旱耐受性、增加的穗重、生长改进、健康改进、热耐受性、除草剂耐受性、食草类动物抗性、改进的固氮、改进的氮利用、改进的营养物使用效率、改进的根构型、改进的水使用效率、增加的生物量、增加的根长、增加的种子重量、增加的芽长、增加的产量、增加的在水限制条件下的产量、去壳谷粒质量、去壳谷粒水分含量、金属耐受性、穗的数目、每个穗的去壳谷粒数目、豆荚数目、营养增强、病原体抗性、害虫抗性、光合性能改进、盐耐受性、保绿性、活力改进、增加的成熟种子的干重、增加的成熟种子的鲜重、增加的每株植物的成熟种子数目、增加的叶绿素含量、增加的种子发芽、增加的每株植物的豆荚数目、增加的每株植物的豆荚长度、减少的每株植物的枯萎叶子数目、减少的每株植物的严重枯萎叶子数目、增加的每株植物的未枯萎叶子数目、增加的植物高度、较早或增加的开花、增加的蛋白质含量、增加的可发酵碳水化合物含量、减少的木质素含量、雄性不育性、增加的抗氧化剂含量、代谢物水平的调节、转录物水平的可检测的调节和蛋白质组的可检测的调节组成的组。在其它实施方案中，农业植物中的至少两种农艺性状有所改进。

例如，当与在相同条件下生长的未接种的植物相比较时，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分可向植物提供改进的益处或耐受性，其为至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间、至少100％、100％与150％之间、至少150％、150％与200％之间、至少200％、200％与300％之间或至少300％或更高。

在一些方面，本文中提供用于产生具有可遗传改变的性状的植物的种子的方法。所述植物的性状可发生改变而无植物基因组的已知基因修饰，并且包含以下步骤。首先，提供所述植物的种子的异源的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的制剂，并且任选地进行加工以产生经过设计的复合内生菌制剂。所述经过设计的复合内生菌制剂接着与所述植物或植物元素接触。接着使所述植物成熟，并且收集种子或其它植物元素。

改进的一般健康状况

本文中还描述了与有益的经过设计的复合内生菌或组分缔合的植物和植物的领域，以致所述植物或其一部分的总体适应性、生产力或健康在一段时间内得以维持、增加和/或改进。总体植物健康的改进可使用多种生理学参数来分析，包括但不限于高度、总体生物量、根和/或芽生物量、种子发芽、幼苗生存、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数目或质量、植物谷粒或果实产量、叶子叶绿素含量、光合速率、根长或其任何组合。改进的植物健康或改进的领域健康也可通过改进的对给定胁迫(生物或非生物胁迫，或如本文所提供的一种或多种非生物胁迫的组合)的抗性或反应来证明。

其它非生物胁迫

本文中公开了具有增加的对非生物胁迫的抗性的经过设计的复合内生菌缔合的植物。示例性非生物胁迫包括但不限于：

干旱和热耐受性。当土壤水耗尽时或如果水在干旱期间不可得，那么作物产量受到限制。如果叶子的蒸腾超过根对水的供应，那么植物水缺乏出现。可得的水供应与土壤中保持的水的量和所述植物用其根系达到所述水的能力有关。叶子的水蒸腾与通过气孔的光合作用对二氧化碳的固定有关系。所述两个过程是正相关的，使得通过光合作用的高二氧化碳流入与通过蒸腾产生的水损失密切相关。由于水从叶子蒸腾，叶子水势减少并且气孔倾向于在限制光合作用的量的水力过程中闭合。由于作物产量取决于光合作用中的二氧化碳固定，水吸收和蒸腾是作物产量的起作用的因素。能够使用较少的水来固定等量的二氧化碳或能够在较低的水势下正常地起作用的植物具有进行更多光合作用并且由此在多种农业系统中产生更多生物量和经济产量的潜力。

在一些情况下，如与不含在相同条件下生长的内生菌的相应的对照、遗传学同一的植物相比较，由用所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分处理的种子或其它植物组分产生的植物可在暴露于热冲击或干旱条件后展现生理学改变，如对胁迫诱导的光合活性减少(表述为例如ΔFv/Fm)的补偿。在一些情况下，如与处于相似的发育阶段但不含所述经过设计的复合内生菌的相应的对照植物相比较，如本文所公开的经过设计的复合内生菌或内生菌组分缔合的植物可在热冲击或干旱胁迫处理后，例如在热冲击或干旱胁迫处理后1、2、3、4、5、6、7天或更久，或直至光合作用停止展现增加的光合活性改变ΔFv(ΔFv/Fm)。例如，具有能够赋予热和/或干旱耐受性的经过设计的复合内生菌的植物可在暴露于热冲击或干旱胁迫后展现约0.1至约0.8的ΔFv/Fm或在热冲击或干旱胁迫处理后不足一天或1、2、3、4、5、6、7天或超过7天，或直至光合作用停止展现约0.03至约0.8的ΔFv/Fm范围。在一些实施方案中，如与热冲击条件后在相应的参考农业植物中的光合活性降低相比较，胁迫诱导的光合活性减少可被补偿至少约0.25％(例如，至少约0.5％、0.5％与1％之间、至少约1％、1％与2％之间、至少约2％、2％与3％之间、至少约3％、3％与5％之间、至少约5％、5％与10％之间、至少约8％、至少约10％、10％与15％之间、至少约15％、15％与20％之间、至少约20％、20$与25％之间、至少约25％、25％与30％之间、至少约30％、30％与40％之间、至少约40％、40％与50％之间、至少约50％、50％与60％之间、至少约60％、60％与75％之间、至少约75％、75％与80％之间、至少约80％、80％与85％之间、至少约85％、85％与90％之间、至少约90％、90％与95％之间、至少约95％、95％与99％之间、至少约99％、99％与100％之间或至少100％)。内生菌缔合的农业植物与参考农业植物之间的差异显著性可在基于如下假设或已知的事实，即内生菌缔合的植物和参考农业植物具有同一或接近同一的基因组(等值线比较)，用适当的参数或非参数统计学，例如卡方检验、Student氏t检验、Mann-Whitney检验或F检验证明统计学显著性(例如，在p＜0.05下)时建立。

在针对改进作物来选择性状时，在不存在生长改变下水使用的降低将在其中水输入成本较高的灌溉农业系统中具有特定优点。在不存在水使用的相应上涨下生长的增加将适用于所有农业系统。在其中水供应不受限制的多种农业系统中，生长的增加(即使其以水使用的增加为代价而实现)还会增加产量。水使用效率(WUE)是通常与干旱耐受性有关的参数，并且是每滴由植物蒸腾的水的CO2同化速率。所述植物的增加的水使用效率在一些情况下涉及增加的果实/去壳谷粒大小或数目。因此，在一些实施方案中，当与在相同条件下生长的参考农业植物相比较时，本文所述的植物展现增加的水使用效率。例如，由包含所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分的植物元素生长的植物可具有比在相同条件下生长的参考农业植物高至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间或至少100％的WUE。所述WUE增加可在不存在水缺乏的条件下，或在水缺乏的条件下发生，例如，当土壤水含量以重量计小于或等于水饱和土壤的60％，例如小于或等于水饱和土壤的50％、小于或等于水饱和土壤的40％、小于或等于水饱和土壤的30％、小于或等于水饱和土壤的20％、小于或等于水饱和土壤的10％时。在一个相关实施方案中，包含所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分的植物可具有比在相同条件下生长的参考农业植物高至少10％的相对水含量(RWC)，例如高至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间或至少100％的RWC。

在一些实施方案中，所述植物包含足量的能够增加热和/或干旱耐受性的经过设计的复合内生菌，以致观察到在热或干旱胁迫下增加的生长或改进的枯萎恢复。例如，本文所述的经过设计的复合内生菌群体可足量存在于植物中，导致当在干旱条件或热冲击条件下生长时或在所述条件后，如与不含所述内共生真菌性内生细菌的植物相比较增加的生长。如与在相似条件下生长的参考农业植物相比较，增加的热和/或干旱耐受性可用生理学参数来分析，包括但不限于增加的高度、总体生物量、根和/或芽生物量、种子发芽、幼苗生存、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数目或质量、植物谷粒或果实产量、叶子叶绿素含量、光合速率、根长、枯萎恢复、膨压或其任何组合。例如，当与在相同条件下生长的未接种的植物相比较时，所述经过设计的复合内生菌可向植物提供改进的益处或耐受性，其为至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间、至少100％、100％与150％之间、至少150％、150％与200％之间、至少200％、200％与300％之间、至少300％或更高。

盐胁迫。在其它实施方案中，能够赋予增加的对盐度胁迫的耐受性的经过设计的复合内生菌或内生菌组分可被引入至植物中。所产生的包含经过设计的复合内生菌的植物可展现增加的对盐胁迫的抗性，无论是关于在生理盐水条件下的生存抑或在盐胁迫期间或之后的总体生长所测量。上文所陈述的植物健康的生理学参数，包括高度、总体生物量、根和/或芽生物量、种子发芽、幼苗生存、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数目或质量、植物谷粒或果实产量、叶子叶绿素含量、光合速率、根长或其任何组合可用于测量生长，并且与在同一条件下生长的参考农业植物(例如，不具有所述内生菌的同基因植物)的生长速率相比较。例如，当与在相同条件下生长的未接种的植物相比较时，所述经过设计的复合内生菌可向植物提供改进的益处或耐受性，其为至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间、至少100％、100％与150％之间、至少150％、150％与200％之间、至少200％、200％与300％之间、至少300％或更高。在其它情况下，当与在相同条件下生长的未接种的植物相比较时，内生菌缔合的植物和参考农业植物可在包含不同浓度的钠以建立10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间、至少100％、100％与150％之间、至少150％、150％与200％之间、至少200％、200％与300％之间、至少300％或更高的抑制浓度的土壤或生长培养基中生长。在其它情况下，经过设计的复合内生菌缔合的植物和参考农业植物可在包含不同浓度的钠以建立钠的抑制浓度(例如，表述为其中当与在无钠胁迫下生长的植物相比较时植物的生长被抑制50％时所处的浓度)的土壤或生长培养基中生长。因此，在另一实施方案中，当与所述参考农业植物相比较时，由包含能够赋予本文所述的盐耐受性的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的植物元素产生的植物展现至少10mM、10mM与15mM之间，例如至少15mM、15mM与20mM之间、至少20mM、20mM与30mM之间、至少30mM、30mM与40mM之间、至少40mM、40mM与50mM之间、至少50mM、50mM与60mM之间、至少60mM、60mM与70mM之间、至少70mM、70mM与80mM之间、至少80mM、80mM与90mM之间、至少90mM、90mM与100mM之间、至少100mM或更高的抑制钠浓度的增加。

高金属含量。植物是固着生物并且因此必须与其中放置所述植物的环境竞争。植物已经调适了多种机制来对付可对其健康有害的化学品和物质。重金属尤其表示与植物生长和农业高度相关的一类毒素，因为其中一些与用于改善土壤的肥料和污水污泥缔合并且可积聚至农业领域中的毒性水平。因此，对于农业目的来说，重要的是具有能够耐受包含升高含量的毒性重金属的土壤的植物。植物通过排泄和内部封存与土壤中的毒性水平的重金属(例如，镍、镉、铅、汞、砷或铝)竞争。能够赋予增加的重金属耐受性的内生菌可通过增强远离种子或果实的某些隔室中的金属封存和/或通过补充修复所述胁迫所必需的其它营养物而实现此举。在植物中使用所述内生菌(例如，经过设计的复合内生菌或其内生菌组分)将允许用于环境修复(还称作植物修复)目的的新颖植物-内生菌组合的开发。因此，在一个实施方案中，如与在土壤中在相同重金属浓度下生长的参考农业植物相比较，所述包含经过设计的复合内生菌的植物显示增加的金属耐受性。

或者，可针对经过设计的复合内生菌或组分缔合的植物确定重金属的抑制浓度并且在相同条件下与参考农业植物相比较。因此，在一个实施方案中，当与所述参考农业植物相比较时，由包含能够赋予本文所述的重金属耐受性的经过设计的复合内生菌的植物元素产生的植物展现至少0.1mM、0.1mM与0.3mM之间，例如至少0.3mM、0.3mM与0.5mM之间、至少0.5mM、0.5mM与1mM之间、至少1mM、1mM与2mM之间、至少2mM、2mM与5mM之间、至少5mM、5mM与10mM之间、至少10mM、10mM与15mM之间、至少15mM、15mM与20mM之间、至少20mM、20mM与30mM之间、至少30mM、30mM与50mM之间、至少50mM或更高的抑制金属浓度的增加。

最后，当与在相同条件下生长的未接种的植物相比较时，接种能够赋予增加的金属耐受性的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的植物展现至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间、至少100％、100％与150％之间、至少150％、150％与200％之间、至少200％、200％与300％之间、至少300％或更高的总体金属排泄的增加。

低营养物胁迫。本文所述的经过设计的复合内生菌或组分也可例如通过溶解或以其它方式向植物提供经过络合、不可溶或在其它方面呈不可得形式的常量营养物或微量营养物而向植物赋予增加的在营养物限制条件下生长的能力。在一个实施方案中，使植物接种内生菌，所述内生菌赋予增加的释放选自由磷酸盐、氮、钾、铁、锰、钙、钼、维生素或其它微量营养物组成的组的营养物和/或以其它方式向所述植物提供所述营养物的能力。当与参考农业植物相比较时，所述植物可在包含限制量的所述营养物的土壤中展现增加的生长。经过设计的复合内生菌缔合的植物与参考农业植物之间的差异可通过比较在限制条件下生长的两种植物类型的生物量，或通过测量上述物理参数来测量。因此，在一个实施方案中，当与在相同条件下生长的未接种的植物相比较时，所述包含经过设计的复合内生菌的植物显示如与在土壤中在相同营养物限制浓度下生长的参考农业植物相比较增加的对营养物限制条件的耐受性，如例如通过至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间、至少100％、100％与150％之间、至少150％、150％与200％之间、至少200％、200％与300％之间、至少300％或更高的生物量或种子产量的增加所测量。

在其它实施方案中，所述包含经过设计的复合内生菌或内生菌组分的植物能够在营养物胁迫条件下生长，同时与无营养物胁迫下生长的植物相比较不展现生理学参数的差异。在一些实施方案中，当与在平均生长季节期间在正常条件下生长的作物植物相比较时，所述植物当用比正常农业用地上的平均栽培实践低2-5％的氮，例如低至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％或75％与100％之间的氮生长时将不展现生理学参数的差异。在一些实施方案中，能够向植物提供氮胁迫耐受性的微生物是固氮的。在其它实施方案中，能够向植物提供氮胁迫耐受性的微生物是非固氮的。

冷胁迫。在一些情况下，经过设计的复合内生菌可向植物赋予耐受冷胁迫的能力。关于植物对冷胁迫的耐受性的测量，存在多种已知的方法。如本文所用，冷胁迫是指通过冷却(0℃-15℃)和冷冻(＜0℃)两者诱导的胁迫。农业植物的一些栽培变种可尤其对冷胁迫敏感，但冷耐受性状可为多基因的，使得育种过程很难。能够赋予冷耐受性的内生菌可减少每年由农民遭受的损害。改进的对冷胁迫的反应可通过植物的生存、如花青素等保护剂物质的产生、植物的部分的坏死量或作物产量损失的改变以及用于其它实施例中的生理学参数来测量。因此，在一个实施方案中，如与在相同冷胁迫条件下生长的参考农业植物相比较，所述包含经过设计的复合内生菌或内生菌组分的植物显示增加的冷耐受性展现。例如，当与在相同条件下生长的未接种的植物相比较时，所述内生菌可向植物提供改进的益处或耐受性，其为至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间、至少100％、100％与150％之间、至少150％、150％与200％之间、至少200％、200％与300％之间、至少300％或更高。

生物胁迫。在其它实施方案中，所述经过设计的复合内生菌保护所述植物免于生物胁迫，例如昆虫侵染、线虫侵染、复合感染、真菌感染、细菌感染、卵菌感染、原生动物感染、病毒感染和食草类动物放牧或其组合。例如，当与在相同条件下生长的未接种的植物相比较时，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分可向植物提供改进的益处或耐受性，其为至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间、至少100％、100％与150％之间、至少150％、150％与200％之间、至少200％、200％与300％之间、至少300％或更高。

昆虫取食。有大量的昆虫害虫种类可感染或侵染多种植物。害虫侵染可导致显著损害。侵染植物物种的昆虫害虫在农业中是尤其有问题的，因为其可引起对作物的严重损害并且显著地减少植物产量。多种不同类型的植物易受害虫侵染，包括商业作物，如棉花、大豆、小麦、大麦和玉米。

在一些情况下，本文所述的经过设计的复合内生菌或组分可对宿主植物赋予驱避昆虫取食的能力。在其它情况下，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分可产生杀昆虫或驱避昆虫的化合物，或诱导植物中所述化合物的产生。所述昆虫可为侵袭植物、特别是农业植物的常见病原性昆虫中的任一者。

所述经过设计的复合内生菌缔合的植物可通过测量例如昆虫负荷、总体植物生物量、果实或谷粒的生物量、完整叶子的百分率或本文所述的其它生理学参数并且与参考农业植物相比较来测试其抵抗、杀死或以其它方式驱避病原性昆虫的能力。在一个实施方案中，如与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，并行地或邻近于内生菌缔合的植物生长)相比较，所述经过设计的复合内生菌缔合的植物展现增加的生物量。在其它实施方案中，如与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，并行地或邻近于内生菌缔合的植物生长)相比较，所述经过设计的复合内生菌缔合的植物展现增加的果实或谷粒产量。

在以上任一者中，当与在相同条件下生长的未接种的植物相比较时，所述内生菌可向植物提供改进的益处或耐受性，其为至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间或至少100％。

线虫。线虫是以超过2,000种行栽作物、蔬菜、水果和装饰性植物的根、流体、叶子和茎喂养的显微镜下的蛔虫，在全世界引起据估计$1000亿作物损失并且占归因于疾病的全球作物损失的13％。多种寄生线虫物种感染作物植物，包括根结线虫(RKN)、胞囊形成线虫和病变形成线虫。根结线虫的特征在于在喂养位点处引起根虫瘿形成，其具有相对广泛的宿主范围并且因此寄生在多种作物物种上。胞囊形成线虫和病变形成线虫具有较为有限的宿主范围，但是仍在易感作物中引起相当大的损失。

线虫损害的病征包括在炎热时期叶子的矮化和黄化，以及植物枯萎。然而，线虫侵染可在没有任何明显的地上疾病症状的情况下引起显著的产量损失。产量减少的主要原因是归因于地下根损害。受到SCN感染的根会矮小或矮化。线虫侵染也可降低根上的固氮小结节的数目，并且可使根更易于受到其它土传植物线虫的攻击。

在一个实施方案中，当与参考农业植物相比较时，所述经过设计的复合内生菌或组分缔合的植物具有增加的对线虫的抗性。如以前关于昆虫取食所述，所述植物或所述植物的一部分的生物量或别处所提及的任何其它生理学参数可与在相同条件下生长的参考农业植物相比较。适用的测量的实例包括总体植物生物量、果实或谷粒的生物量和/或大小和根生物量。在一个实施方案中，如与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，在线虫挑战的条件下并行地或邻近于经过设计的复合内生菌缔合的植物生长)相比较，所述经过设计的复合内生菌缔合的植物展现增加的生物量。在另一实施方案中，如与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，在线虫挑战的条件下并行地或邻近于经过设计的复合内生菌缔合的植物生长)相比较，所述经过设计的复合内生菌缔合的植物展现增加的根生物量。在另一实施方案中，如与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，在线虫挑战的条件下并行地或邻近于内生菌缔合的植物生长)相比较，所述经过设计的复合内生菌缔合的植物展现增加的果实或谷粒产量。

真菌病原体。真菌疾病在美国造成每年超过$100亿的农业作物损失，表示归因于疾病的全球作物损失的42％，并且由多种多样的生物多样性病原体引起。不同的策略在传统上已经用于控制所述疾病。抗性性状已经被培育至农业上重要的品种中，因此提供多种水平的针对狭窄范围的病原体分离菌或种类或针对较广泛范围的抗性。然而，这涉及通过基因杂交将所需的性状引入至商业新品种中的长期并且劳动密集型过程并且归因于正在进化以克服天然植物抗性的害虫的风险，需要持续致力于将新的抗性性状培育至商业新品种中。或者，真菌疾病已经通过应用化学杀真菌剂来控制。这一策略通常导致有效的控制，但也引起抗性病原体的可能发育并且可引起对环境的负面影响。此外，在如大麦和小麦等某些作物中，由化学杀真菌剂来控制真菌病原体是困难的或不切实际的。

本发明预期能够向宿主植物赋予对真菌病原体的抗性的经过设计的复合内生菌或组分的使用。增加的对真菌接种的抗性可例如使用上文所提供的生理学参数中的任一者，通过与参考农业植物相比较来测量。在一个实施方案中，如与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，并行地或邻近于经过设计的复合内生菌缔合的植物生长，感染所述真菌病原体)相比较，所述经过设计的复合内生菌缔合的植物展现增加的生物量和/或不太显著的疾病症状。在另一实施方案中，如与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，并行地或邻近于经过设计的复合内生菌缔合的植物生长，感染所述真菌病原体)相比较，所述经过设计的复合内生菌缔合的植物展现增加的果实或谷粒产量。在另一实施方案中，如与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，并行地或邻近于经过设计的复合内生菌缔合的植物生长，感染所述真菌病原体)相比较，所述经过设计的复合内生菌缔合的植物展现降低的菌丝生长。例如，当与在相同条件下生长的未接种的植物相比较时，所述经过设计的复合内生菌可向植物提供改进的益处，其为至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间、至少100％、100％与150％之间、至少150％、150％与200％之间、至少200％、200％与300％之间、至少300％或更高。

病毒病原体。据估计植物病毒占归因于疾病的全球作物损失的18％。影响农业生产力的病毒病原体有众多实例。在一个实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分提供针对病毒病原体的保护，以致如与在相同条件下生长的参考农业植物相比较，所述植物具有增加的生物量。在另一实施方案中，如与在相同条件下生长的参考农业植物相比较，所述经过设计的复合内生菌缔合的植物展现相同或较大的果实或谷粒产量。在另一实施方案中，如与在相同条件下生长的参考农业植物相比较，当用病毒挑战时，所述经过设计的复合内生菌缔合的植物展现较低的病毒效价。

复合病原体。同样，细菌病原体是负面影响农业生产力并且占归因于植物疾病的全球作物损失的27％的显著问题。在一个实施方案中，本文所述的经过设计的复合内生菌或内生菌组分提供针对细菌病原体的保护，以致如与在相同条件下生长的参考农业植物相比较，所述植物具有较大的生物量。在另一实施方案中，如与在相同条件下生长的参考农业植物相比较，当用复合病原体挑战时，所述经过设计的复合内生菌缔合的植物展现较大的果实或谷粒产量。在另一实施方案中，如与在相同条件下生长的参考农业植物相比较，当用细菌挑战时，所述经过设计的复合内生菌缔合的植物展现较低的复合物计数。

产量和生物量改进。在其它实施方案中，经过改进的性状可为所述植物或所述植物的一部分(包括其果实或种子)的总体生物量的增加。在一些实施方案中，经过设计的复合内生菌或内生菌组分以有效增加从所述植物元素生长的植物或所述植物的一部分或组织的生物量的量安置于所述植物元素的表面上或组织内。增加的生物量适用于来源于所述植物的商业化产品的产生。所述商业化产品包括动物饲料、鱼饲料、谷物产品、经过加工的人类食品、糖或酒精。所述产品可为发酵产品或可发酵产品，一种所述示例性产品是生物燃料。生物量的增加可发生于所述植物的一部分(例如，根组织、芽、叶子等)中，或可为总体生物量的增加。增加的生物量产生，当与在相同条件下生长的未接种的植物相比较时，所述增加意指至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间或至少100％。所述总体生物量的增加可在相对无胁迫条件下。在其它情况下，生物量的增加可在在多种非生物或生物胁迫，包括干旱胁迫、盐胁迫、热胁迫、冷胁迫、低营养物胁迫、线虫胁迫、昆虫取食胁迫、真菌病原体胁迫、细菌病原体胁迫和病毒病原体胁迫下生长的植物中。在一些实施方案中，经过设计的复合内生菌或内生菌组分以有效增加根生物量，当与在相同条件下生长的未接种的植物相比较时，当与参考农业植物相比较时，达至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间或至少100％的量被安置。

在其它情况下，经过设计的复合内生菌或内生菌组分以有效增加所产生的植物的果实或穗轴的平均生物量，当与在相同条件下生长的未接种的植物相比较时，达至少3％、3％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与15％之间，例如至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与75％之间、至少75％、75％与100％之间或至少100％的量安置于所述植物元素上。

植物生长激素的增加。多种本文所述的微生物当在培养物中生长时能够产生植物激素植物生长素吲哚-3-乙酸(IAA)。植物生长素可在改变植物的生理学(包括根生长的程度)中发挥关键作用。因此，在其它实施方案中，经过设计的复合内生菌或内生菌组分以有效在所述农业植物中可检测地诱导植物生长素的产生的量安置于所述植物元素的表面上或组织内。例如，当与参考农业植物相比较时，植物生长素产生的增加可为至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％、至少100％或更高。在一些实施方案中，增加的植物生长素产生可在选自由根、芽、叶子和花组成的组的组织类型中检测到。

其它性状的改进

在其它实施方案中，所接种的经过设计的复合内生菌或内生菌组分可向植物赋予其它有益的性状。改进的性状可包括用于人类消耗的植物或植物部分的改进的营养含量。在一个实施方案中，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分缔合的植物能够产生至少一种营养物的含量的可检测改变。所述营养物的实例包括氨基酸、蛋白质、油(包括油酸、亚油酸、α-亚油酸、饱和脂肪酸、棕榈酸、硬脂酸和反式脂肪中的任一者)、碳水化合物(包括如蔗糖、葡萄糖和果糖等糖、淀粉或膳食纤维)、维生素A、硫胺(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、烟酸(维生素B3)、泛酸(B5)、维生素B6、叶酸(维生素B9)、胆碱、维生素C、维生素E、维生素K、钙、铁、镁、锰、磷、钾、钠、锌。在一个实施方案中，当与参考农业植物相比较时，所述内生菌缔合的植物或其部分含有至少一种增加的营养物。

在其它情况下，当与参考农业植物相比较时，改进的性状可包括减少的有害或非所需物质的含量。所述化合物包括当大量摄取时有害或尝起来带苦味的那些(例如，草酸、苦杏苷、某些生物碱(如茄碱、咖啡因、烟碱、奎宁和吗啡)、丹宁酸、氰化物)。因而，在一个实施方案中，当与参考农业植物相比较时，所述经过设计的复合内生菌缔合的植物或其部分含有较少的非所需物质。在一个相关实施方案中，改进的性状可包括所述植物或所述植物的一部分(包括果实或种子)的改进的味道。在一个相关实施方案中，改进的性状可包括植物中由其它内生菌产生的非所需化合物的减少，如所述植物的一部分(包括果实或种子)中镰刀霉产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(还称作呕吐毒素和在玉米和小麦赤霉病中所牵涉的独立因子)的降解。

当与参考农业植物相比较时，所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分缔合的植物也可具有改变的激素状态或改变的激素产生水平。激素状态的改变可影响多种生理学参数，包括开花时间、水效率、顶端优势和/或侧向芽分枝、根毛增加和果实熟化的改变。

所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分与所述植物之间的缔合也可使用本领域中已知的其它方法来检测。例如，经过设计的复合内生菌缔合的植物的生物化学、代谢组学、蛋白质组、基因组、表观基因组和/或转录组学概况可在相同条件下与参考农业植物相比较。也可执行经过设计的复合内生菌缔合的农业植物和参考农业植物的转录组学分析以检测在内生菌缔合时至少一种转录物或基因的集合或网络的表达的改变。同样，可使用甲基化DNA免疫沉淀、随后高通量测序来检测表观遗传学改变。

所述植物之间的代谢组学差异可使用本领域中已知的方法来检测。代谢物、蛋白质或其它化合物可使用任何合适的方法来检测，包括但不限于凝胶电泳、液相和气相色谱法(单独或耦合至质谱法)、NMR、免疫分析(酶联免疫吸附剂分析(ELISA)、化学分析、光谱法、光学成像技术(如磁共振光谱法(MRS)、磁共振成像(MRI)、CAT扫描、超声、基于MS的组织成像或X射线检测方法(例如，能量色散x射线荧光检测))等。在一些实施方案中，使用用于色谱法和NMR分析的商业系统。所述代谢组学方法可用于检测激素、营养物、次级代谢物、根分泌物的水平、韧皮部汁液含量、木质部汁液含量、重金属含量等的差异。所述方法还适用于检测经过设计的复合内生菌或内生菌组分含量和状态的改变；例如，复合/真菌信号传导分子(例如，自体诱导物和信息素)的存在和水平，其可基于例如群体密度指示内生菌的基于组的行为的状态。

所述方法还适用于检测经过设计的复合内生菌含量和状态的改变；例如，复合/真菌信号传导分子(例如，自体诱导物和信息素)的存在和水平，其可基于例如群体密度指示内生菌的基于组的行为的状态。也可执行内共生真菌性内生细菌缔合的农业植物和参考农业植物的转录组学分析以检测在内共生真菌性内生细菌缔合时至少一种转录物或基因的集合或网络的表达的改变。同样，可使用甲基化DNA免疫沉淀、随后高通量测序来检测表观遗传学改变。本领域中已知的任何方法均可用于所述分析。在一些实施方案中，来自经过设计的复合内生菌缔合的农业植物和参考农业植物的生物样品(全组织、分泌物、韧皮部汁液、木质部汁液、根分泌物等)可基本上如本领域中已知加以分析。

在一个特定实施方案中，所述代谢物可充当信号传导或调节分子。信号传导途径可与对胁迫，例如选自由干旱胁迫、盐胁迫、热胁迫、冷胁迫、低营养物胁迫、线虫胁迫、昆虫取食胁迫、真菌病原体胁迫、复合病原体胁迫和病毒病原体胁迫组成的组的胁迫条件之一的反应相关。

当经过接种的农业植物在一定条件下生长，以致所述植物中的一种或多种代谢物的水平受到调节时，其中所述调节可指示增加的对选自由干旱胁迫、盐胁迫、热胁迫、冷胁迫、低营养物胁迫、线虫胁迫、昆虫取食胁迫、真菌病原体胁迫、复合病原体胁迫和病毒病原体胁迫组成的组的胁迫的抗性。所述增加的抗性可在应用所述胁迫之后约10分钟、10分钟与20分钟之间，例如在应用所述胁迫之后约20分钟、20与30分钟之间、30分钟、30与45分钟之间、约45分钟、45分钟与1小时之间、约1小时、1与2小时之间、约2小时、2与4小时之间、约4小时、4与8小时之间、约8小时、8与12小时之间、约12小时、12与16小时之间、约16小时、16与20小时之间、约20小时、20与24小时之间、约24小时、24与36小时之间、约36小时、36与48小时之间、约48小时、48与72小时之间、约72小时、72与96小时之间、约96小时、96与120小时之间、约120小时、120小时与一周之间或约一周时测量。

在一些实施方案中，植物中的代谢物可通过制造植物与经过设计的复合内生菌或内生菌组分的合成组合来调节。例如，经过设计的复合内生菌或内生菌组分可在对植物的定殖时引起多种代谢物的水平的可检测调节(例如，增加或降低)，例如吲哚-3-甲酸、反式玉米素、脱落酸、红花菜豆酸、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-丙烯酸、茉莉酸、茉莉酸甲酯、二氢红花菜豆酸、赤霉素A3、水杨酸。

在一些实施方案中，经过设计的复合内生菌或内生菌组分直接地调节代谢物的水平(例如，所述微生物产生所述代谢物，导致在植物中发现的代谢物的水平的总体增加)。在其它情况下，所述农业植物由于与所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分的缔合而展现经过调节的代谢物水平(例如，所述植物由于微生物接种而减少负责产生所述代谢物的生物合成酶的表达)。在其它情况下，代谢物水平的调节是微生物和植物的行动的后果(例如，当与参考农业植物相比较时，所述植物产生增加的量的所述代谢物，并且所述内生菌也产生所述代谢物)。因此，如本文所用，代谢物水平的调节可为通过微生物和/或经过接种的植物的行为引起的代谢物水平的改变。

代谢物的水平可在农业植物中进行测量，并且与参考农业植物中的代谢物的水平相比较，并且所述参考农业植物在与经过接种的植物相同的条件下生长。用作参考农业植物的未接种的植物是尚未应用具有所述经过设计的复合内生菌或内生菌组分的制剂(例如，包含经过设计的复合内生菌或内生菌组分的制剂)的植物。用作参考农业植物的未接种的植物一般是与经过接种的植物相同的物种和栽培变种，并且对于经过接种的植物来说是同基因的。

所述经过设计的复合内生菌缔合的植物中的水平经过调节(例如，增加或降低)的代谢物可充当主要营养物(即，其对消耗所述植物、植物组织或来源于其的商业化植物产品的人类和/或动物提供营养，包括但不限于糖、淀粉、碳水化合物、蛋白质、油、脂肪酸或微生物)。所述代谢物可为对于植物生长、发育或内稳定至关重要的化合物(例如植物激素，如植物生长素、细胞分裂素、赤霉素、油菜素类固醇、乙烯或脱落酸、信号传导分子或抗氧化剂)。在其它实施方案中，所述代谢物可具有其它功能。例如，在一些实施方案中，代谢物可具有细菌抑制、杀细菌、真菌抑制、杀真菌或抗病毒特性。在其它实施方案中，所述代谢物可具有昆虫驱避、杀昆虫、线虫驱避或杀线虫特性。在其它实施方案中，所述代谢物可在保护所述植物免于胁迫方面发挥作用，可帮助改进植物活力或所述植物的一般健康状况。在另一实施方案中，所述代谢物可为用于工业生产的适用化合物。例如，所述代谢物本身可为经过萃取用于工业用途的适用化合物，或充当工业中使用的其它化合物的合成中间物。在一个特定实施方案中，所述农业植物或其一部分内的代谢物的水平增加，以致其以至少0.1ug/g所述植物或其部分的干重，例如至少0.3ug/g干重、0.3ug/g与1.0ug/g干重之间、至少1.0ug/g干重、1.0ug/g与3.0ug/g干重之间、至少3.0ug/g干重、3.0ug/g与10ug/g干重之间、至少10ug/g干重、10ug/g与30ug/g干重之间、至少30ug/g干重、30ug/g与100ug/g干重之间、至少100ug/g干重、100ug/g与300ug/g干重之间、至少300ug/g干重、300ug/g与1mg/g干重之间或超过1mg/g干重的浓度存在。

同样，所述调节可为代谢物的水平的降低。所述减少可为影响植物或来源于所述植物的商业化植物产品的味道的代谢物(例如，带苦味的化合物)，或使植物或所产生的商业化植物产品在其它方面不太有价值的代谢物(例如，某些植物中的草酸盐含量的减少，或对人类和/或动物健康有害的化合物)。欲减少水平的代谢物可为影响商业化植物产品的品质的化合物(例如，木质素含量的减少)。

经过设计的复合内生菌或内生菌组分的非农业用途

在本发明的一个实施方案中，经过设计的复合内生菌或内生菌组分可用于改进其中典型地使用单一微生物类型的应用的功效或效用。例如，通常使用特定真菌的过程可受益于所述过程中的经过设计的复合内生菌的取代，其中所述经过设计的复合内生菌包含所述特定真菌作为宿主，所述宿主本身进一步包含组分细菌。在另一实施例中，通常使用特定细菌的过程可受益于所述过程中的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的取代，其包含真菌宿主，所述真菌宿主本身进一步包含所述特定细菌。

预期过程或应用改进的机制可由一种或多种机制产生，如但不限于：额外生物(宿主真菌或组分细菌)的并入、所述两种生物(宿主真菌和组分细菌)之间的协同、所述生物中由另一生物使用的一种生物所产生的化合物的杠杆作用、所述两种生物(宿主真菌和组分细菌)之间的相加效应、一种生物对另一生物的保护效应、一种或两种生物中的特定生物化学或代谢途径的诱导、上调或下调、由于另一生物的存在而使用不同能源、一种或两种生物由于其以宿主：组分关系缔合而改进的生存力或效应的组合。

在一个实施例中，烘焙面包、酿造啤酒或使果实或谷粒发酵用于酒精产生的过程通过在传统真菌菌株内部包含组分细菌的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的取代或添加而改进。

在一个实施例中，腌制或熏制食物的过程通过包含进一步包含传统细菌菌株的宿主真菌的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的取代或添加而改进。

在一个实施例中，制造或递送杀昆虫细菌的过程可通过包含进一步包含传统细菌菌株的宿主真菌的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的取代或添加而改进。

在一个实施例中，废水处理的过程可通过包含进一步包含传统细菌菌株的宿主真菌的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的取代或添加而改进。

在一个实施例中，油、塑料或其它化学品的生物修复过程可通过包含进一步包含传统细菌菌株的宿主真菌的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的取代或添加而改进。

在一个实施例中，与水品质改进有关的过程可通过包含进一步包含传统细菌菌株的宿主真菌的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的取代或添加而改进。

在一个实施例中，生物可降解的塑料的合成过程可通过包含进一步包含传统细菌菌株的宿主真菌的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的取代或添加而改进。

在一个实施例中，对生物可降解的物质进行堆肥的过程可通过包含进一步包含传统细菌菌株的宿主真菌的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的取代或添加而改进。

在一个实施例中，制造或递送用于人类或动物用法的药物化合物的过程可通过在传统真菌菌株内部包含组分细菌的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的取代或添加而改进。

在一个实施例中，制造工业化合物(如但不限于：酶、脂肪酶、淀粉酶、果胶酶、氨基酸、维生素、抗生素、酸、乳酸、谷氨酸、柠檬酸醇、酯、调味剂、防腐剂、氮、病毒、糖、生物气、生物塑料)的过程可通过包含进一步包含用于传统细菌或传统真菌的细菌菌株的宿主真菌的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的取代或添加而改进。

在一个实施例中，产生雪或冰的过程可通过包含进一步包含传统细菌菌株的宿主真菌的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的取代或添加而改进。

在一个实施例中，制造药物化合物(如但不限于：酶、氨基酸、维生素、抗生素、激素、胰岛素、人类生长激素、疫苗、防腐剂、病毒)的过程可通过包含进一步包含用于传统细菌或传统真菌的细菌菌株的宿主真菌的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的取代或添加而改进。

用于农业用途的制剂

本文所述的纯化的经过设计的复合内生菌群体和其组分意图适用于农业植物的改进，并且因而可用其它作为农业上可相容的载体的一部分的组合物配制。包含所述经过设计的复合内生菌群体的载体组合物可准备以液体、固体或气体制剂形式用于农业应用。

一方面，所述载体组合物预期作为用于农业植物元素与纯化的经过设计的复合内生菌群体之间的缔合的方法的媒剂。预期农业植物元素与纯化的经过设计的复合内生菌群体之间的缔合的所述方法可包括但不限于：种子处理、根洗涤、幼苗浸泡、叶面应用、土壤接种、犁沟中应用、侧施肥应用、土壤预处理、伤口接种、滴灌带灌溉、经由传粉者的载体介导、注射、渗透引发、水栽法、鱼菜共生法、气栽法。

预期多种应用，包括但不限于单一载体组合物、单一缔合方法和载体组合物与缔合方法的组合。在一个非限制性实施例中，将所述经过设计的复合内生菌群体应用于所述植物可例如以用于表面沉积于植物叶子上的粉末形式、以到达全植物或所选择的植物元素上的喷雾剂形式、作为到达土壤或根的滴剂的一部分或在种植之前以植物元素上的涂层形式实现。在另一非限制性实施例中，植物元素可由于用包含纯化的经过设计的复合内生菌群体的固体(干燥)制剂进行的种子处理而首先与纯化的经过设计的复合内生菌群体缔合，并且在发芽和叶子萌出时，所述植物接着经受包含纯化的经过设计的复合内生菌群体的液体制剂的叶面喷雾。在另一非限制性实施例中，植物可由于用包含纯化的经过设计的复合内生菌群体的液态或固体制剂接种生长培养基(土壤或水栽性)而首先与纯化的经过设计的复合内生菌群体缔合，并且经受包含纯化的经过设计的复合内生菌群体的液体或固体制剂的重复(两次、三次、四次或甚至五次后续)接种。多种单一载体组合物和单一缔合方法以及载体组合物与缔合方法的组合意图在本发明的范围内，并且因而，所给出的实施例意图为说明性的并且不限于本发明的范围。

适用于这些实施方案的制剂一般地并且典型地包括选自由以下组成的组的至少一个成员：缓冲液、增粘剂、微生物稳定剂、杀真菌剂、抗络合剂、除草剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、杀细菌剂、杀病毒剂、植物生长调节剂、灭鼠剂、干燥剂和营养物。

所述载体可为固体载体或液体载体，并且呈多种形式，包括微球、粉末、乳液等。所述载体可为赋予多种特性(如增加的稳定性、可湿性或分散性)的多种载体中的任一者或多者。可为非离子或离子表面活性剂的湿润剂(如天然或合成表面活性剂)或其组合可包括与本发明组合物中。油包水型乳液也可用于配制包括所述纯化的群体的组合物(参见例如美国专利号7，485，451，其以引用的方式整体并入本文中)。可制备的合适制剂包括可湿性粉末、颗粒、凝胶、琼脂条或小球、增稠剂、生物聚合物等、微封装的粒子等、液体(如水性可流动剂、水性悬浮液、油包水型乳液等)。所述制剂可包括谷粒或豆类产品，例如谷粉或蚕豆、来源于谷粒或蚕豆的汤或面粉、淀粉、糖或油。

在一些实施方案中，所述农业载体可为土壤或植物生长培养基。可使用的其它农业载体包括水、肥料、基于植物的油、保湿剂或其组合。或者，所述农业载体可为固体，如硅藻土、肥土、硅石、海藻酸盐、粘土、膨润土、蛭石、果皮、其它植物和动物产品或组合，包括颗粒、小球或悬浮液。前述成分中的任一者的混合物也预期为载体，如但不限于pesta(面粉和高岭土)、在肥土、沙或粘土中的基于琼脂或面粉的小球等。制剂可包括用于所培养的生物的食物来源，如大麦、稻或其它生物材料，如种子、植物元素、蔗渣、来自谷粒加工的壳或秆、经过研磨的植物材料或来自建筑工地废物的木材、来自纸、织物或木材的再循环的锯屑或小纤维。其它合适的制剂将为本领域技术人员已知的。

在一个实施方案中，所述制剂可包括增粘剂、胶粘物或粘附剂。所述试剂适用于组合本发明的复合群体与可含有其它化合物(例如，非生物的控制剂)的载体，以生成涂料组合物。所述组合物帮助在所述植物或植物元素周围产生涂层以维持所述内生菌和其它试剂与所述植物或植物元素之间的接触。在一个实施方案中，粘附剂(胶粘物或增粘剂)是选自由以下组成的组：海藻酸盐、树胶、淀粉、卵磷脂、芒柄花素、聚乙烯醇、碱性芒柄花素盐、橙皮素、聚乙酸乙烯酯、脑磷脂、阿拉伯树胶、黄原胶、角叉菜胶、PGA、其它生物聚合物、矿物油、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、阿拉伯半乳聚糖、甲基纤维素、PEG 400、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚丙烯腈、甘油、三乙二醇、乙酸乙烯酯、结兰胶、聚苯乙烯、聚乙烯化合物、羧基甲基纤维素、茄替胶和聚氧乙烯-聚氧丁烯嵌段共聚物。可用于合成制剂中的粘附剂组合物的其它实例包括EP 0818135、CA 1229497、WO 2013090628、EP 0192342、WO 2008103422和CA 1041788中所述的那些，其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。

还预期所述制剂可进一步包含抗结块剂。

所述制剂还可含有表面活性剂、湿润剂、乳化剂、稳定剂或消泡剂。表面活性剂的非限制性实例包括氮-表面活性剂混合物，如Prefer 28(Cenex)、Surf-N(US)、Inhance(Brandt)、P-28(Wilfarm)和Patrol(Helena)；酯化种子油包括Sun-It II(AmCy)、MSO(UAP)、Scoil(Agsco)、Hasten(Wilfarm)和Mes-100(Drexel)；并且有机-硅酮表面活性剂包括Silwet L77(UAP)、Silikin(Terra)、Dyne-Amic(Helena)、Kinetic(Helena)、Sylgard 309(Wilbur-Ellis)和Century(Precision)、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Tween 20、Tween 80、Scattics、Alktest TW20、Canarcel、Peogabsorb 80、Triton X-100、Conco NI、Dowfax 9N、Igebapl CO、Makon、Neutronyx 600、Nonipol NO、Plytergent B、Renex600、Solar NO、Sterox、Serfonic N、T-DET-N、Tergitol NP、Triton N、IGEPAL CA-630、Nonident P-40、Pluronic。在一个实施方案中，所述表面活性剂以0.01％v/v至10％v/v之间的浓度存在。在另一实施方案中，所述表面活性剂以0.1％v/v至1％v/v之间的浓度存在。消泡剂的实例将为Antifoam-C。

在某些情况下，所述制剂包括微生物稳定剂。所述试剂可包括干燥剂。如本文所用，“干燥剂”可包括可归类为干燥剂的任何化合物或化合物的混合物，无论所述一种或多种化合物是否以使得其实际上对液体接种物具有干燥效应的浓度使用。所述干燥剂理想地可与所用的群体相容，并且应促进所述内生菌群体经受得住应用于种子上并且经受得住干燥的能力。合适的干燥剂的实例包括海藻糖、蔗糖、甘油和亚甲基二醇中的一者或多者。其它合适的干燥剂包括但不限于非还原性糖和糖醇(例如，甘露醇或山梨醇)。引入至所述制剂中的干燥剂的量可介于以重量/体积计约5％至约50％范围内，例如，约10％至约40％之间、约15％与约35％之间或约20％与约30％之间。

在一些情况下，有利的是所述制剂含有如杀真菌剂、抗络合剂、除草剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物生长调节剂、灭鼠剂、杀细菌剂、杀病毒剂或营养物等试剂。所述试剂理想地可与上面应用所述制剂的农业植物元素或幼苗相容(例如，其不应对所述植物的生长或健康有害)。此外，所述试剂理想地为不会引起针对人类、动物或工业用途的安全性考虑的试剂(例如，无安全性问题，或所述化合物充分地不安定，使得来源于所述植物的商业化植物产品含有可忽略的量的所述化合物)。

所述制剂的营养添加剂可包括肥料组合物，如但不限于氮、磷或钾。

在例如溶液或悬浮液等液体形式中，本发明的内生菌群体可混合或悬浮于水中或水溶液中。合适的液体稀释剂或载体包括水、水溶液、石油馏出物或其它液体载体。

固体组合物可通过将本发明的内生菌群体分散于适当分割的固体载体(如泥炭、小麦、麸、蛭石、粘土、滑石、膨润土、硅藻土、漂白土、消毒土壤等)中和上面来制备。当所述制剂作为可湿性粉末使用时，可使用生物可相容的分散剂，如非离子、阴离子、两性或阳离子分散剂和乳化剂。

用于制剂上的固体载体包括例如矿物载体，如高岭土、叶蜡石、膨润土、蒙脱石、硅藻土、酸性白土、蛭石和珍珠岩；和无机盐，如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素、氯化铵和碳酸钙。又，可使用有机精细粉末，如小麦面粉、麦麸和米糠。所述液体载体包括植物油(如大豆油和棉籽油)、甘油、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、聚丙二醇等。

在一个实施方案中，所述制剂理想地适于将经过设计的复合内生菌群体涂布于植物元素上。本发明中所述的经过设计的复合内生菌群体能够向宿主植物赋予多种适应性益处。通过将所述群体涂布于植物元素的表面上来赋予所述益处的能力具有多种潜在优势，尤其当以商业(农业)规模使用时。

本文中的经过设计的复合内生菌群体可与上述试剂中的一者或多者组合以生成适用于与农业植物元素、幼苗或其它植物元素组合的制剂。经过设计的复合内生菌群体可获自培养物中的生长，例如使用合成生长培养基。另外，经过设计的复合内生菌或其组分可在固体培养基上(例如，在皮氏培养皿上)培养，刮掉并且悬浮于制剂中。可使用在不同生长期的内生菌。例如，可使用在停滞期、早期对数期、中期对数期、晚期对数期、稳定期、早期死亡期或死亡期的微生物。内生菌孢子可用于本发明，例如但不限于：节孢子、孢囊孢子、分生孢子、厚垣孢子、器孢子、内生孢子、游动孢子。

包含经过设计的复合内生菌的制剂以重量计，例如以湿重计约1％与90％之间、约3％与75％之间、约5％与60％之间、约10％与50％之间的本发明的经过设计的复合内生菌群体。

在一个实施方案中，预期所述制剂包含至少约10^2个CFU或孢子经过设计的复合内生菌群体/mL液体制剂、10^2与10^3之间个CFU或孢子/mL、约10^3个CFU或孢子/mL、10^3与10^4之间个CFU或孢子/mL、约10^4个CFU或孢子/mL、10^4与10^5之间个CFU或孢子/mL、约10^5个CFU或孢子/mL、10^5与10^6与10^7之间个CFU或孢子/mL、约10^7个CFU或孢子/mL、10^7与10^8之间个CFU或孢子/mL、约10^8个CFU或孢子/mL、10^8与10^9之间个CFU或孢子/mL或甚至超过10^9个CFU或孢子经过设计的复合内生菌群体/mL液体制剂。

在一个实施方案中，预期所述制剂包含至少约10^2个CFU或孢子经过设计的复合内生菌群体/克非液体制剂、10^2与10^3之间个CFU或孢子/克、约10^3个CFU或孢子/克、10^3与10^4之间个CFU或孢子/克、约10^4个CFU或孢子/克、10^4与10^5之间个CFU或孢子/克、约10^5个CFU或孢子/克、10^5与10^6之间个CFU或孢子/克、约10^6个CFU或孢子/克、10^6与10^7之间个CFU或孢子/克、10^7个CFU或孢子/克、约10^7个CFU或孢子/克、10^7与10^8之间个CFU或孢子/克、约10^8个CFU或孢子/克、10^8与10^9之间个CFU或孢子/克或甚至超过10^9个CFU或孢子经过设计的复合内生菌群体/克非液体制剂。

在一个实施方案中，预期所述制剂以约10^2个CFU或孢子/种子、10^2与10^3之间个CFU或孢子、至少约10^3个CFU或孢子、10^3与10^4之间个CFU或孢子、至少约10^4个CFU或孢子、10^4与10^5之间个CFU或孢子、至少约10^5个CFU或孢子、10^5与10^6之间个CFU或孢子、至少约10^6个CFU或孢子、10^6与10^7之间个CFU或孢子、至少约10^7个CFU或孢子、10^7与10^8之间个CFU或孢子或甚至超过10^8个CFU或孢子/种子。

作为制剂组分的经过设计的复合内生菌真菌宿主

本发明的一方面预期所述经过设计的复合内生菌系统中的真菌宿主作为用于组分细菌的制剂载体部分的效用。

细菌可展现变化的生理学特征，所述特征可取决于品系或属或种，或如集落的生长期或群体密度等其它因素。一些细菌或多或少对环境条件比其它细菌敏感。例如，某些细菌是热敏感的，并且不能耐受不同范围的环境温度或环境温度的改变。在另一实施例中，某些细菌不能耐受不同范围的环境水分含量或环境水分含量的改变。在另一实施例中，某些细菌不能耐受不同范围的环境酸度或碱度或环境酸度或碱度的改变。在另一实施例中，某些细菌不能耐受不同范围的营养物组成或营养物组成的改变。

将细菌封装于宿主真菌内以产生经过设计的复合内生菌可向所述组分细菌、向所述宿主真菌或向两种生物传达数种新颖的优势。一方面，所述宿主真菌和所述组分细菌具有共生关系、互利关系、共栖关系，或一种生物可寄生于另一者。

在本发明的一方面，如与未封装于宿主真菌中的异源细菌相比较，经过设计的复合内生菌的组分细菌展示较大的生存力。另一方面，所述组分细菌能够使用不同于未封装于宿主真菌内的等值线细菌的营养物来源。另一方面，如与未封装于宿主真菌中的等值线细菌相比较，所述组分细菌产生转录物、代谢物、蛋白质、激素或其它化合物的不同集合。所述宿主真菌可对所述组分细菌提供保护以免于环境变量，如温度或水分的变化、化学品、如其它细菌或病毒等敌对生物或其它因素。一方面，所述宿主真菌产生使得所述组分细菌能够展示改进的生存力或其它生理学或表型改进的化合物。

一方面，所述宿主真菌对所述组分细菌提供保护以免于杀细菌组合物，如可在农业制剂中发现的那些。一方面，所述宿主真菌提供所述细菌可利用的营养物环境。一方面，所述宿主真菌提供用于所述细菌的最佳环境以形成孢子或结晶蛋白。一方面，所述宿主真菌保护所述细菌免于干燥。一方面，所述宿主真菌提供用于所述组分细菌的最佳pH环境。

另一方面，如与未包含所述细菌的等值线真菌相比较，所述组分细菌向所述宿主真菌赋予益处。

一方面，关于对环境有害的某些东西，所述组分细菌向所述宿主真菌提供改善。例如，所述组分细菌可由于产生改善化合物而保护所述宿主真菌免于杀真菌剂(如来自农业制剂)。一方面，所述组分细菌向所述宿主细菌提供营养物环境。一方面，所述组分细菌产生使得所述宿主真菌能够展示改进的生存力或其它生理学或表型改进的化合物。

植物元素的群体

在另一实施方案中，本发明提供大体上均一的植物元素(PE)群体，所述群体包含两种或更多种包含如上文所述的经过设计的复合内生菌群体的PE。大体上均一可以多种方式确定。在一些情况下，所述群体中的至少10％、10％与20％之间，例如至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与70％之间、至少70％、70％与75％之间、至少75％、75％与80％之间、至少80％、80％与90％之间、至少90％、90％与95％之间、至少95％或更多个PE含有有效定殖于被安置于所述PE的表面上的植物的量的所述经过设计的复合内生菌群体。在其它情况下，所述群体中的至少10％、10％与20％之间，例如至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与70％之间、至少70％、70％与75％之间、至少75％、75％与80％之间、至少80％、80％与90％之间、至少90％、90％与95％之间、至少95％或更多个植物元素含有在植物元素表面上或每克植物元素至少1个、1与10之间个、10个、10与100之间个或100个CFU，例如100与200之间个CFU、至少200个CFU、200与300之间个CFU、至少300个CFU、300与1,000之间个CFU、至少1,000个CFU、1,000与3,000之间个CFU、至少3,000个CFU、3,000与10,000之间个CFU、至少10,000个CFU、10,000与30,000之间个CFU、至少30,000个CFU、30,000与100,000之间个CFU、至少100,000个CFU、100,000与300,000之间个CFU、至少300,000个CFU、300,000与1,000,000之间个CFU或至少1,000,000个CFU/个植物元素或更多。

在一个特定实施方案中，所述植物元素的群体被包装于适用于商业销售的袋子或容器中。所述袋子含有单位重量或量的包含如本文所述的经过设计的复合内生菌群体的植物元素，并且进一步包含标签。在一个实施方案中，所述袋子或容器含有至少100个植物元素、100与1,000之间个植物元素、1,000个植物元素、1,000与5,000之间个植物元素，例如至少5,000个植物元素、5,000与10,000之间个植物元素、至少10,000个植物元素、10,000与20,000之间个植物元素、至少20,000个植物元素、20,000与30,000之间个植物元素、至少30,000个植物元素、30,000与50,000之间个植物元素、至少50,000个植物元素、50,000与70,000之间个植物元素、至少70,000个植物元素、70,000与80,000之间个植物元素、至少80,000个植物元素、80,000与90,000之间个、至少90,000个植物元素或更多。在另一实施方案中，所述袋子或容器可包含个别重量的植物元素，例如至少1lb、1与2lb之间、至少2lb、2与5lb之间、至少5lb、5与10lb之间、至少10lb、10与30lb之间、至少30lb、30与50lb之间、至少50lb、50与70lb之间、至少70lb或更多。所述袋子或容器包含描述所述植物元素和/或所述内生菌群体的标签。所述标签可含有额外信息，例如选自由以下组成的组的信息：净重、批号、所述植物元素的地理起源、测试日期、发芽率、惰性物质含量和有害杂草(如果有的话)的量。合适的容器或包装包括传统地用于植物种子商业化的那些。本发明还预期具有更复合存储能力(例如，具有微生物学紧密包裹或具有不透气或不透水外壳)的其它容器。

在一些情况下，基于增加的均一性，例如基于微生物群体的均一性进一步选择包含所述经过设计的复合内生菌群体的植物元素的亚群体。例如，从个别穗轴、个别植物、个别试验田(表示在同一天接种的植物)或个别田地收集的池的个别植物元素可针对微生物密度的均一性进行测试，并且仅那些满足规格的池(例如，所测试的植物元素中的至少80％具有最小密度，如通过别处所述的定量方法所确定)进行组合以提供农业植物元素亚群体。

本文所述的方法也可包含验证步骤。所述验证步骤可例如使得从经过接种的植物收集的一些植物元素生长成成熟农业植物，并且针对均一性测试那些个别植物。所述验证步骤可对从穗轴、个别植物、个别试验田(表示在同一天接种的植物)或个别田地收集的个别植物元素种子执行，并且如上文所述进行测试以鉴别满足所需规格的池。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括种植本文所述的合成组合。合适的种植器包括用于农业操作的空中播种机和/或排肥器以在种植操作期间将包括以下一者或多者的微粒材料应用于土壤中：种子、肥料和/或接种物。播种机/施肥器可包括其上具有地面接合开启器的刀杆，其后被牵引着带轮子的车，所述带轮子的车包括一个或多个密封罐或箱和缔合的计量构件以分别地容纳并且从其计量微粒材料。参见例如美国专利号7,555,990。

在某些实施方案中，本文所述的组合物可呈液体、浆液、固体或粉末(可湿性粉末或干粉末)的形式。在另一实施方案中，组合物可呈种子涂料的形式。呈液体、浆液或粉末(例如，可湿性粉末)形式的组合物可适用于涂布种子。当用于涂布种子时，可将所述组合物应用于种子并且使其干燥。在其中所述组合物为粉末(例如，可湿性粉末)的实施方案中，在应用于种子之前可需要将液体(如水)添加至所述粉末中。

在另一实施方案中，所述方法可包括将本文所述的内生菌群体中的一者或多者的接种物引入至土壤中。所述方法可包括将本文所述的组合物中的一者或多者引入至土壤中。所述接种物或组合物可根据本领域技术人员已知的方法引入至土壤中。非限制性实例包括犁沟中引入、喷雾、涂布种子、叶面引入等。在一个特定实施方案中，所述引入步骤包含本文所述的接种物或组合物的犁沟中引入。

在一个实施方案中，植物元素可以多种方式，例如经由喷雾或滴落用本文所述的组合物处理。喷雾和滴落处理可通过配制本文所述的组合物并且经由连续处理系统(所述系统经过校准以在与种子的连续流动成比例的预定速率下应用处理)，如滚筒式处理器将所述组合物喷雾或滴落至种子上来进行。也可使用分批系统，其中预定批量的如本文所述的种子和组合物被递送至混合器中。

在另一实施方案中，所述处理使得涂布植物元素。一种所述过程涉及用本文所述的组合物涂布圆形容器的内壁，添加植物元素，接着使所述容器旋转以使所述植物元素与所述壁和所述组合物接触，所述过程在本领域中被称作“容器涂布”。植物元素可通过涂布方法的组合进行涂布。浸泡典型地使得使用所述组合物的液体形式。例如，植物元素可被浸泡约1分钟至约24小时(例如，至少1min、1与5min之间、5min、5与10min之间、10min、10与20min之间、20min、20与40min之间、40min、40与80min之间、80min、80min与3h之间、3h、3h与6h之间、6h、6h与12h之间、12h、12h与24h之间、24h)。

植物/农业领域的群体

作物改进尝试的主要焦点是选择具有除了最高利润还给出最大均质性和均一性的性状的品种。虽然近亲繁殖可生成具有实质基因同一性的植物，但关于植物高度、开花时间和播种时间的异质性仍然是获得植物的均质领域的障碍物。不可避免的植物间变异性是由多种因素引起的，包括不均匀的环境条件和管理实践。另一种可能的变异性来源可在一些情况下归因于寄居于所述植物的经过设计的复合内生菌或内生菌组分群体的异质性。通过将经过设计的复合内生菌或内生菌组分群体提供于植物生殖元素上，使得通过使所述植物生殖元素发芽所产生的所得植物具有更一致的经过设计的复合内生菌组成，并且因此预期生成更均一的植物群体。

因此，在另一实施方案中，本发明提供大体上均一的植物群体。所述群体可包括至少10株植物、10与100株之间的植物，例如至少100株植物、100与300株之间的植物、至少300株植物、300与1,000株之间的植物、至少1,000株植物、1,000与3,000株之间的植物、至少3,000株植物、3,000与10,000株之间的植物、至少10,000株植物、10,000与30,000株之间的植物、至少30,000株植物、30,000与100,000株之间的植物、至少100,000株植物或更多。所述植物来源于包含如本文所述的内生菌群体的植物生殖元素。所述植物以大体上均一的组进行栽培，例如呈行、丛、块、圆形或其它种植布局。所述植物从包含如本文所述的经过设计的复合内生菌群体的植物生殖元素生长。所述植物的均一性可以多种不同的方式进行测量。

所述植物的均一性可以多种不同的方式进行测量。在一个实施方案中，关于所述植物群体内的内生菌存在增加的均一性。例如，在一个实施方案中，所述植物群体的大部分含有阈值数目的内生菌群体，例如群体中的植物元素或植物的至少10％、10％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与70％之间、至少70％、70％与75％之间、至少75％、75％与80％之间、至少80％、80％与90％之间、至少90％、90％与95％之间、至少95％或更多。所述阈值数目可为所述植物或所述植物的一部分中的至少10个CFU、10与100个CFU之间、至少100个CFU、100与300个CFU之间，例如至少300个CFU、300与1，000个CFU之间、至少1,000个CFU、1,000与3,000个CFU之间、至少3,000个CFU、3,000与10,000个CFU之间、至少10,000个CFU、10,000与30,000个CFU之间、至少30,000个CFU、30,000与100,000个CFU之间、至少100,000个CFU或更多。或者，在所述植物群体的大部分中，例如，在所述植物群体的至少1％、1％与10％之间、至少10％、10％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与70％之间、至少70％、70％与75％之间、至少75％、75％与80％之间、至少80％、80％与90％之间、至少90％、90％与95％之间、至少95％或更多中，被提供给种子或幼苗的内生菌群体表示所述植物/种子中的总的内生菌群体的至少0.1％、0.1％与1％之间、至少1％、1％与5％之间、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％、60％与70％之间、至少70％、70％与80％之间、至少80％、80％与90％之间、至少90％、90％与95％之间、至少95％、95％与99％之间、至少99％、99％与100％之间或100％。

在一个实施方案中，相对于未接种的对照物，在所述经过设计的复合内生真菌或组分的分类单位、属或种内的大部分或全部的可检测的经过设计的复合内生菌或内生菌组分的基因均一性增加。这一增加的均一性可以是所述经过设计的复合内生菌具有单克隆起点或以其它方式来源于如下群体的结果，所述群体包含比主要经由多样性土壤共生体的同化产生其内生菌群落的植物的经过设计的复合内生菌群体中将存在的情况更均一的基因组序列和质粒谱系。

在另一实施方案中，关于所述群体内的植物的生理学参数存在增加的均一性。在一些情况下，当与在相同条件下生长的参考农业植物的群体相比较时，所述植物的高度的均一性可增加。例如，当与在相同条件下生长的参考农业植物的群体相比较时，所述群体中的植物的高度的标准偏差可减少至少5％、5％与10％之间，例如至少10％、10％与15％之间、至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％或更多。在其它情况下，当与在相同条件下生长的参考农业植物的群体相比较时，所述群体中的植物的开花时间的标准偏差可减少至少5％、5％与10％之间，例如至少10％、10％与15％之间、至少15％、15％与20％之间、至少20％、20％与30％之间、至少30％、30％与40％之间、至少40％、40％与50％之间、至少50％、50％与60％之间、至少60％或更多。

商业化植物产品

本发明提供一种商业化植物产品，以及用于制造来源于本发明植物的商业化植物产品的方法。如本文所用，“商业化植物产品”是指包含来源于本发明的植物、种子、植物细胞或植物部分的材料的任何组合物或产品。商业化植物产品可被销售给消费者并且可为活的或非活性的。非活性的商业化产品包括但不限于非活性种子和谷粒；经过加工的种子、种子部分和植物部分；脱水植物组织、冷冻植物组织和经过加工的植物组织；加工用于针对陆地和/或水生动物消耗的动物饲料、从全谷粒粉碎的油、粗粉、面粉、薄片、麸、纤维、纸、茶、咖啡、青贮饲料和针对人类或动物消耗的任何其它食物的种子和植物部分；和生物量和燃料产品；和工业中的原材料。来源于本文所述的农业产品的油的工业用途包括用于油漆、塑料、纤维、清洁剂、化妆品、润滑剂和生物柴油燃料的成分。大豆油可为经过分裂的、互酯化的、硫化的、环氧化的、聚合的、乙氧基化的或经过裂解的。设计和产生具有改进的功能性和改进的油脂化学的大豆油衍生物是正在快速发展的领域。三酸甘油酯的典型混合物通常被分裂并且分离成纯脂肪酸，所述脂肪酸接着与石油源性醇或酸、氮、磺酸酯、氯或与来源于脂肪和油的脂肪醇组合以产生所需类型的油或脂肪。商业化植物产品还包括工业化合物，如用于粘合剂、膜、塑料、油漆、涂料和泡沫的配制的多种树脂。

尽管本发明已经参考以下实施例详细地加以描述，应理解可进行多种修改而不偏离本发明的精神。例如，虽然以下特定实施例可使用特定植物说明本文所述的方法和实施方案，但这些实施例中的原理可应用于任何农业作物。因此，应理解本发明的范围是由本文和本说明书中所陈述的本发明的实施方案而非以下示例的特定实施例涵盖。本申请中所提及的所有引用的专利和公布均以引用的方式整体并入本文中。

实施例

以下为用于进行本发明的特定实施方案的实施例。所述实施例仅出于说明性目的提供，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。已经尝试确保关于所用的数字(例如，量、温度等)的精度，但当然应考虑一些实验误差和偏差。

实施例1：分离内生菌组分和经过设计的复合内生菌

分离遵循Hoffman和Arnold(2010，Appl.Environ.Microbiol.76：4063-4075)中所述的方法。简单地说，从各焦点物种的至少三个健康、成熟个体收集新鲜、无症状的组织。材料在收集的6至12h内被转移至实验室以进行加工。组织样品在流动的自来水中洗涤并且接着被切割成2-mm区段。区段通过在95％乙醇中冲洗30s、在10％Clorox(0.6％次氯酸钠)中冲洗2min并且在70％乙醇中冲洗2min来进行表面灭菌，使其在无菌条件下进行表面干燥，并且接种于2％麦芽浸出液琼脂(MEA)上，所述麦芽浸出液琼脂促进多种内生菌的生长。

分离内共生真菌性真菌的两个品系(SYM16670和SYM15779)和非内共生真菌性真菌的一个品系(SYM15890)。内共生真菌性真菌如下消除其组分细菌。首先通过对细菌16S rRNA基因进行PCR扩增来分析SYM 16670、SYM 15779和SYM 15890中内共生菌丝性细菌的存在。将幼菌丝体组织的个别插塞放置于用羧苄青霉素(0.1mg/mL)、卡那霉素(0.05mg/mL)、四环素(0.01mg/mL)和环丙沙星(0.04mg/mL)改善的2％麦芽糖浸出液琼脂(MEA)的中心处并且在25℃下孵育7天。所有样品均一式五份进行接种。

在2％MEA上的纯培养物上生长一周后，使用光学显微镜用明场成像(400X；数值孔径[NA]＝0.75)来检查真菌分离菌。在经过消除的内共生真菌相对于原生形式之间观察到清楚的形态差异(图1)。从原生、经过消除和经过接种的纯样品的表面分离真菌培养物样品。从培养板表面刮掉样品并且放置于载片上，并且根据本领域中已知的方法进行染色，冲洗，并且用50％甘油/50％水混合物封片。在具有FITC和罗丹明滤光片和汞/氙荧光灯源的Nikon倒置显微镜上获取图像。在Nikon D80color DLSR上使用Nikon捕捉软件捕捉图像。针对原生培养物鉴别各通道的暴露时间并且用于所有后续成像。用FITC滤光片在适当位置捕捉明场图像。依序获取个别图像。将明场图像修改为灰度级并且出于清晰起见在Adobe Photoshop中修改图像水平。

在孵育期结束时，从所有真菌样品分离基因组DNA并且测试用于细菌16S rRNA基因的PCR扩增。从成功地经过消除的内共生真菌性样品获得的基因组DNA不会生成16S rRNA基因PCR产物并且作为宿主真菌用于后续工作。使用SYM 15890基因组DNA由PCR发现不存在16S rRNA基因扩增子是一致的。

内共生真菌性细菌如下从其宿主真菌分离。将SYM 16670、SYM15779和SYM 15890的幼菌丝体组织的个别插塞放置于2.4％PDA板的中心处并且在36℃下孵育72小时。在这种方法的改进中，一些复合内生菌还在23.5℃下孵育3-5天以证明所述方法改进的功效。

从孵育2天时开始，明显地从SYM 16670和SYM 15779的菌丝出现内共生菌丝性细菌。SYM 15890看来不具有任何内共生菌丝性细菌。所有样品均一式五份进行接种。分离的内共生菌丝性细菌在LB琼脂上划线培养以作为纯的细菌分离菌用于繁殖和维持。

实施例2：鉴别经过设计的复合内生菌组分真菌和细菌

使用Qiagen DNeasy Plant Mini试剂盒，从如上文所述获得的个别真菌分离菌提取总的基因组DNA。使用引物ITS1F和ITS4或LR3，使用PCR来扩增核核糖体内部转录间隔区(ITS)和5.8S基因(ITS核糖体DNA[rDNA])和当可能时，呈单一片段(大约1,000至1,200bp长)的大的亚单位(LSU rDNA)的最初600bp。各25微升反应混合物包括22.5微升的Invitrogen Platinum Taq supermix、0.5微升的各引物(10uM)和1.5微升的DNA模板(约2-4ng)。用MJ Research PTC热循环仪进行循环反应并且其由94℃持续5min、35个94℃持续30s、54℃持续30s和72℃持续1min的循环和72℃持续10min组成。使用ABI 3730xl DNA分析仪执行Sanger测序以用于毛细管电泳和荧光染料终止剂检测。使用BLAST将序列与GenBank中可得的序列相比较并且在100％覆盖率下的97％相似性用作用于物种分配的截止阈值。

最初使用光学显微术确定细菌在周围基质内的存在或不存在。在2％MEA上的纯培养物上生长一周后，使用光学显微镜用明场成像(400X；数值孔径[NA]＝0.75)来检查真菌分离菌。一旦肉眼检查将非内共生真菌性细菌(即，在培养基中的污染物或在真菌表面上的微生物)排除在外，即使用对细菌16S rRNA基因具特异性的PCR引物27F和1429R(1，402bp)来检查从新鲜菌丝体提取的总的基因组DNA。PCR混合物、循环参数和测序是如上文所述，除了退火温度为55℃。

通过用无菌牙签轻触集落的表面并且使用其来搅拌2微升无核酸酶的水，接着将所述无核酸酶的水用作25微升PCR的模板，对来自菌丝体离心(参见上文)的上清液的细菌分离菌执行集落PCR。如上文所述使用16S细菌引物来执行PCR、循环参数和测序。使用BLAST将序列与从真菌的总的基因组DNA获得的序列相比较并且与寄存于GenBank的那些相比较。

如上文获得来自非内共生真菌性来源的细菌培养物并且进行测序。

预期能够充当经过设计的复合内生菌中的组分细菌的本发明的内生细菌在表1中由其特征16S序列SEQ ID NO：1至549描述。

预期能够充当经过设计的复合内生菌中的宿主真菌的本发明的内生真菌在表2中由其特征ITS或LSU序列SEQ ID NO：550至747描述。

图2示出分离的复合内生菌消除的真菌和分离的细菌中每一者的培养物的图片，如与其亲本复合内生菌培养物相比较。

图3示出从其它来源分离并且并非任何复合内生菌的一部分的真菌和细菌中每一者的培养板的图片。

实施例3：合成经过设计的复合内生菌

培养经过消除的真菌菌株以用于共培养的方法

选择三种真菌菌株作为用于经过设计的复合内生菌实验的潜在候选真菌宿主。这些真菌菌株包括SYM15779(已知的天然存在的复合内生菌，其包含EHB15779)、SYM166(已知的天然存在的复合内生菌，其包含EHB166)和SYM15890(已知未进一步包含组分细菌的真菌)。

将经过消除的真菌菌株的幼菌丝体组织的单一插塞放置于100mL 2.4％PDB中，并且使用Waring混合机在低设置下混合5秒。所混合的经过消除的真菌插塞在27℃下在100RPM恒定搅拌下生长持续10天，为欲作为与细菌共培养的宿主的菌株做准备。

培养细菌以用于共培养的方法

选择四种细菌作为用于经过设计的复合内生菌实验的引入经过消除的真菌宿主中的潜在候选者。这些细菌包括内共生菌丝性细菌16660(还称作EHB166，从SYM 16670分离的细菌)、EHB15779(从SYM 15779分离的细菌)、SYM 257和SYM 292。用于各菌株的细菌的单一集落首先在LB琼脂上划线培养以确保分离菌的纯度。同样，使用来自LB琼脂的单一集落以在36℃下在恒定搅拌(200RPM)下接种5mL LB持续3天。

用细菌共培养真菌并且接种真菌的方法

在孵育结束时，使所述真菌宿主菌株通过真空过滤至#2Whatman滤纸上以获得真菌生物量。经过过滤的真菌菌丝体使用10mM MgCl2洗涤两次。在洗涤后，使菌丝体生物量再悬浮于2.4％PDB中并且使用Waring混合机在低设置下混合5秒。使用分光光度计在600nm下对再悬浮的真菌生物量定量以用于吸光度测量。

通过在4256RCF下离心持续20分钟，随后去除上清液并且用4mL 10mM MgCl2进行两次冲洗来收集LB中的细菌。使所述细菌再悬浮于4mL 0.024％PDB中并且使用分光光度计在600nm下测量吸光度。

根据吸光度测量以5∶1真菌：细菌比率制得真菌和细菌的共培养物，并且在50mL Falcon管中使用2.4％PDB达到5mL的最终体积。一式五份进行各共培养物处理。使共培养物在27℃下在100RPM恒定搅拌下生长持续7天。在生长期后，将0.2mL共培养物材料接种于2％水琼脂板的中心处并且在27℃下孵育持续2周。一式三份进行各处理。在所述2周结束时，从真菌集落的生长边缘取走插塞并且放置于2.4％PDA中并且在25℃下孵育持续一周以筛选所引入的内共生真菌性细菌的出现。

表3描述本发明的经过设计的复合内生菌，其包含进一步包含组分细菌的宿主真菌。

用于产生的经过设计的内共生真菌性内生菌培养方法

经过设计的内共生真菌性内生菌、经过消除的真菌宿主和用于共培养的细菌分别地在25℃下在含有150mL 2.4％马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)的Erlenmeyer烧瓶中在恒定搅拌(130RPM)下生长持续13天和4天。

图4证明了细菌成功并入至宿主真菌中。

关于本发明人所开发的这种方法存在数种改进，其导致所述经过设计的复合内生菌的改进的合成和品质。为了最小化所述真菌上的任何表面细菌的污染效应，重要的是在萃取核酸以验证细胞内细菌(内共生真菌性细菌)的存在之前并且在产生新颖的经过设计的复合内生菌之前去除在真菌菌丝细胞的细胞外表面上的任何细菌。

在第一种改进中，用庆大霉素培养欲用作经过设计的内生菌真菌宿主的原生内共生真菌性内生菌或内生真菌。庆大霉素是不会穿透真核细胞膜但会穿透原核细胞膜的抗生素。因此，存在于真菌的表面上但未被封装于真菌内的任何细菌均将由庆大霉素杀死并且通过这些方法的洗涤步骤去除。重要的是减少内生真菌上的表面细菌污染的量，以允许所述真菌在培养物中充分地生长而无污染细菌增殖并且冲击培养基。

用于开发这种方案的样品包括：

·已知的非复合内生真菌(SYM15890)

·已知的复合内生菌(包含非再引入的、原生EHB15779的真菌SYM15779)

作为比较样品，运行以下：

·SYM15890，使其经受真菌消除步骤以验证非内共生真菌性细菌存在，掺加0.1或0.2mL分离的细菌SYM292并且用液体培养物中的0.05mg/mL庆大霉素处理

·SYM15890，掺加0.1或0.2mL分离的细菌SYM292并且用液体培养物中的0.075mg/mL庆大霉素处理

·SYM15890，掺加0.1或0.2mL分离的细菌SYM292，而无任何洗涤处理

·SYM15779，分离的复合内生菌和消除组分细菌的真菌宿主两者，用不同浓度的庆大霉素处理

根据由本发明人开发的以下新颖方法处理并且制备样品：

在微量离心管中两次使用1mL 10mM MgCl2洗涤真菌菌丝体。样品在16，110RPM下在室温下离心持续3分钟并且对所述溶液进行倾析。用移液管吸移出残留溶液。样品在用50mM磷酸盐生理盐水缓冲液(pH 7.0)制备的0.05mg/mL或0.075mg/mL庆大霉素中孵育持续1小时。0.2mL溶液经过确定为充足的。

每次处理通过添加5μLDNA酶I和5μL10X DNA酶缓冲液(DNA酶I混合液)来制备DNA酶I混合液。当五个样品正在进行处理时，准备25μL(5×5μL)各溶液的微量离心管。溶液存储于冰箱(4℃)中直至使用。

在抗生素溶液中孵育之后，对所述溶液进行倾析。添加每个管最少0.1mL MgCl2以充分地浸没样品，并且对各样品来说立即添加10μLDNA酶I混合液。使样品孵育持续15分钟。

制备含蛋白酶K(10mg/mL的最终浓度)的10mM MgCl2(蛋白酶K混合液)，其体积足以添加0.2mL/样品。

在孵育时间之后，经由倾析或用移液管吸移从所述管中去除DNA酶I溶液。

通过添加至少0.2mL蛋白酶K混合液/样品进行蛋白酶K洗涤并且使样品孵育持续15分钟。

接着用移液管吸移出所述蛋白酶K溶液。

通过在所述程序期间用移液管上下吸移所述溶液，并且确保所述菌丝体的所有外部部分均被充分地洗涤，而用10mM MgCl2充分地洗涤样品。洗涤的次数作为以下每一者进行测试：1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次和10次。最佳洗涤经过确定为超过3次，并且最终用于这一实施例中的样品制备的次数为8-10次。

溶液存储于冰箱(4℃)中直至执行真菌的基因组DNA萃取，随后相对于对照样品对细菌基因进行PCR扩增。

经过洗涤的真菌样品中细菌的存在或不存在是通过使用16S rRNA基因扩增的PCR，连同实验性对照样品来验证，所述实验性对照样品由以下组成：(1)已知的原生内生真菌的对照样品，其以相同方式洗涤以确保所述洗涤不会去掉内部细菌，(2)已知的原生内生真菌的对照样品，其未经过处理，和(3)已知的非复合内生菌真菌(已知未包含组分细菌SYM15890的真菌)的对照样品，其具有在表面上添加的约0.1mL处于对数期的纯细菌培养物并且以相同方式洗涤。PCR结果也与对照分离细菌的结果相比较。

图5示出本发明的方法改进方面的结果，证明了不同浓度的庆大霉素去除表面污染细菌并且不影响内共生真菌性细菌的功效。图6示出了归因于表面污染细菌的去除，使得产生经过设计的复合内生菌的功效得到改进，并且因此所发生的唯一的16S DNA扩增是归因于内共生真菌性细菌存在于真菌宿主内。

在第二种改进中，孵育温度的范围最佳地减小。较高的温度会促进细菌生长，而较低的温度会减少细菌生长以允许真菌培养物建立并且生长。在一种替代方案中，所述板在18.0℃与26.9℃之间、20.0℃与26.9℃之间、20.0℃与26.0℃之间、20.0℃与25.5℃之间、22.0℃与25.0℃之间和23.0℃与24.0℃之间的温度下孵育。在一种替代方案中，所述板在22.0与25.0℃之间孵育。在一种替代方案中，所述板在23.0℃与24.0℃之间孵育。在一种替代方案中，所述板在23.5℃下孵育。

在第三种改进中，PDB的浓度被减小至全强度的10％。如果环境具有充分营养物，那么将促进内共生真菌性细菌离开其真菌宿主，并且如果环境具有减少的营养物，那么将促进内共生真菌性细菌保持作为内共生真菌性细菌。在一种替代方案中，所述复合内生菌和经过设计的复合内生菌在0.24％PDB中生长，而非原始方案的全强度2.4％，具有和不具有上文所述的庆大霉素处理和洗涤。

实施例4：经过设计的复合内生菌的表征

经过设计的复合内生菌具有独特的特性，或可产生可有益于植物或在所述经过设计的复合内生菌中的任一组分的独特的物质。即使先前已经表征了内共生真菌性内生细菌，将其引入至宿主真菌中也可改变其行为，尤其是通过向共生偶合添加新颖功能。经过设计的复合内生菌的体外活性可使用以下比色或基于生长的分析来测试。宿主真菌、内共生真菌性内生细菌和内共生真菌性内生真菌也可使用这些分析来测试。

表型

将经过设计的复合内生菌、真菌宿主和个别组分细菌的集落接种于琼脂上并且在28℃下生长3天。对板照相并且注意表型特征。那些相同内生菌(经过设计的复合内生菌、真菌宿主、组分细菌)的液体培养物也在PDB液体培养物中生长。

图7示出了用于本发明的经过设计的复合内生菌的液体培养基，如与经过消除的/空的真菌宿主相比较。

图8示出了用于本发明的经过设计的复合内生菌的培养板，如与经过消除的/空的真菌宿主相比较。

图9示出了空的真菌宿主和新近产生的本发明的经过设计的复合内生菌的显微图像。

实施例5：经过设计的复合内生菌的产生和植物元素缔合

使用氯烟对未处理的大豆和小麦种子进行表面灭菌。简单地说，将含有种子的锥形烧瓶和具有100mL新鲜漂白溶液的瓶子放置于位于通风橱中的干燥罐中。在闭合所述干燥罐的盖子之前即刻，将3mL盐酸小心地用移液管吸移至漂白剂中。对大豆进行灭菌持续17小时并且对小麦进行灭菌持续16小时。在完成时，取出具有种子的烧瓶，用无菌箔密封，并且在无菌生物安全柜或层流罩中打开用于后续工作。

如下用内生菌涂布种子。制备2％海藻酸钠(SA)并且进行高压灭菌。用适量的去离子水填充锥形烧瓶并且在使用搅拌棒进行搅拌的加热板上加温至约50度。缓慢地倒入SA粉末直至其均溶解。所述溶液在121℃下在15PSI下进行高压灭菌持续30分钟。

滑石粉末在干循环中进行高压灭菌(121℃在15PSI下持续30分钟)并且在保鲜袋或50ml falcon管中等分试样。

以下文指示的量制备内生菌接种物。关于对照物，分别地，内生菌粉末用滑石取代，或液体内生菌用液体培养基(酵母提取蛋白胨肉汤)取代。

关于粉末种子处理，将种子放置于大的塑料容器中。每千克欲处理的种子应用50mL的2％SA。所述容器用铰链盖覆盖并且以轨道运动缓慢地振荡持续约20秒以分散所述SA。每kg欲处理的种子，使12.5g真菌粉末与137.5g滑石粉末预混合。使所述内生菌接种物和滑石的混合物均匀地分散于种子上面，覆盖所述容器，并且使所述种子以轨道运动缓慢地振荡持续约20秒。筛掉过量粉末并且在种植之前将所述种子包装于纸袋中进行存储。

关于液体种子处理，将种子放置于大的塑料容器中。将每kg种子25ml的2％SA和等量的内生菌培养物(每kg种子25ml)倒在所述种子上。所述容器用铰链盖覆盖并且以轨道运动缓慢地振荡持续约20秒以分散所述SA。添加每kg种子137.5g滑石粉末并且使其均匀地分散，覆盖所述容器，并且使所述种子以轨道运动缓慢地振荡持续约20秒。筛掉过量制剂并且在种植之前将所述种子包装于纸袋中进行存储。

预期所描述的方法可用于使经过设计的复合内生菌或其宿主内生真菌或其内生细菌组分与任何植物元素缔合。本发明范围内所包括的所述方法的非限制性实例是使具有进一步包含经过设计的复合内生菌、内生细菌或内生真菌的液体或粉末制剂的所述内生菌与种子、根、块茎、花柄长叶、花蕾、茎、叶子、花、花蕾、植物上的伤口、匍匐枝、雌蕊、雄蕊、根小结节、芽、幼苗、果实或全植物或其部分缔合的方法。

种子处理

复合内生菌、内生真菌或内生细菌以使用包括以下组分的一系列制剂的液体或粉末形式接种于种子上；海藻酸钠和/或甲基纤维素(作为胶粘物)、滑石和流动性聚合物。种子在处理后进行风干并且根据针对每一种作物类型的常用实践进行种植。

渗透引发和水引发

复合内生菌、内生真菌或内生细菌在渗透引发(浸泡于聚乙二醇溶液中以产生渗透势的范围)和/或水引发(浸泡于脱氯水中)过程期间接种至种子上。经过渗透引发的种子浸泡于含有内生细菌和/或内生真菌的聚乙二醇溶液中持续一天至八天并且接着风干持续一天至两天。经过水引发的种子浸泡于含有内生细菌和/或内生真菌的水中持续一天至八天并且维持于恒定通风下以维持所述悬浮液的合适溶解氧含量直至取出并且风干持续一天至两天。在干燥过程期间添加滑石和或流动性聚合物。

叶面应用

复合内生菌、内生真菌或内生细菌以含有佐剂、粘展剂和UV保护剂的脱氯水中的液体悬浮液形式接种于地上植物组织(叶子和茎)上。所述悬浮液用喷杆或其它适当喷雾器喷雾至作物上。

土壤接种

复合内生菌、内生真菌或内生细菌以液体悬浮液形式；在种植前以土壤浇灌液形式，在种植期间以犁沟中应用形式，或在作物生长期间以侧施肥料形式接种至土壤上。内生真菌或内生细菌经由滴灌带、中心枢纽或其它适当的灌溉系统直接地混合至灌溉施肥系统中。

水栽性和气栽性接种

复合内生菌、内生真菌或内生细菌以直接应用于石棉衬底或应用于循环或喷雾营养溶液的粉末或液体悬浮液形式接种至水栽性或气栽性系统中。

载体介导的接种

复合内生菌、内生真菌或内生细菌以粉末形式在含有滑石或其它膨胀剂的混合物中被引入至蜂窝的入口(在蜜蜂介导的情况下)或另一传粉者的巢附近(在其它昆虫或鸟的情况下。所述传粉者当离开蜂房时捡取所述粉末并且在传粉过程期间将接种物直接地堆积至作物的花。

根洗涤

所述方法包括使植物的根的外表面与含有纯化的细菌群体、纯化的真菌群体、纯化的经过设计的复合内生菌群体或前述任一者的混合物的液体接种物制剂接触。植物的根短暂地被传递通过固定的液体微生物制剂或液体制剂不受限制地被喷雾到根上，导致从植物的根物理去除土壤和微生物碎片，以及用所述制剂中的微生物进行接种。

幼苗浸泡

所述方法包括使幼苗的外表面与含有纯化的细菌群体、纯化的真菌群体或前述任一者的混合物的液体接种物制剂接触。完整幼苗被浸没于固定的液体微生物制剂中持续至少30秒，导致从植物的根物理去除土壤和微生物碎片，以及用所述制剂中的微生物接种所有植物表面。或者，所述幼苗可从浸泡有所关注的微生物的培养基中的种子发芽或被移植至所述培养基中并且接着使其在所述培养基中生长，导致小植物浸泡于微生物制剂中持续长得多的时间，总计多达数天或数周。内生菌微生物有可能需要时间来定殖于所述植物并且进入所述植物，因为其探测植物表面的裂缝或伤口来进入，因此浸泡越久，所述微生物将越有可能成功地安装于所述植物中。

伤口接种

所述方法包括使植物的受伤表面与含有纯化的细菌群体、纯化的真菌群体或前述任一者的混合物的液体或固体接种物制剂接触。植物表面是设计成阻断微生物进入内球，因为病原体试图以这种方式感染植物。为了将有益的内生菌微生物引入至植物内球，需要一种接近植物的内部的方式，我们可通过利用受伤打开通道来接近植物的内部。这个伤口可采用多种形式，包括经过修剪的根、经过修剪的分枝、茎中破坏树皮和皮层的刺穿伤口、主根中的刺穿伤口、叶子中的刺穿伤口和种子中允许进入并经过种皮的刺穿伤口。伤口可使用针、锤子和钉子、刀子、钻头等产生。接着可在伤口中接触呈液体形式、呈粉末形式、在明胶胶囊内部、在加压胶囊注射系统中、在加压贮器和管注射系统中的微生物接种物，从而允许微生物进入并且定殖于内球中。或者，整个受伤的植物可在所述微生物接种物中浸泡或洗涤持续至少30秒，从而使更多微生物有机会进入伤口，以及用所述制剂中的微生物接种其它植物表面——例如，修剪幼苗的根并且在移植之前将其浸泡于接种物中是将内生菌引入至植物中的非常有效的方式。

注射

所述方法包括将微生物注射至植物中以便成功地将其安装于内球中。植物表面是设计成阻断微生物进入内球，因为病原体试图以这种方式感染植物。为了将有益的内生菌微生物引入至内球，需要一种接近植物的内部的方式，我们可通过用针刺穿植物表面并且将微生物注射至植物的内部来接近植物的内部。植物的不同部分可以这种方式进行接种，包括主茎或树干、分枝、主根、种子根、板根和甚至叶子。注射可以皮下注射针、钻孔注射器或专用注射系统来进行，并且通过刺穿伤口可接着接触呈液体形式、呈粉末形式、在明胶胶囊内部、在加压胶囊注射系统中、在加压贮器和管注射系统中的微生物接种物，从而允许微生物进入并且定殖于内球中。

实施例6：证明归因于所述经过设计的复合内生菌的存在的宿主植物表型改变：植物活力幼苗分析

使用氯烟对未处理的大豆和冬小麦种子进行表面灭菌。简单地说，将含有种子的锥形烧瓶和具有100mL新鲜漂白溶液的瓶子放置于位于通风橱中的干燥罐中。在闭合所述干燥罐的盖子之前即刻，将3mL盐酸小心地用移液管吸移至漂白剂中。对大豆进行灭菌持续17小时并且对小麦进行灭菌持续16小时。在完成时，取出具有种子的烧瓶，用无菌箔密封，并且在无菌生物安全柜或层流罩中打开用于后续工作。

经过设计的内共生真菌性内生菌、经过消除的真菌宿主和用于共培养的细菌分别地在25℃下在含有150mL马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)的Erlenmeyer烧瓶中在恒定搅拌(130RPM)下生长持续13天和4天。呈菌丝体生物量的球形式在培养物中生长的样品短暂地进行声波处理以获得培养物的均质悬浮液。表面灭菌的大豆和小麦种子首先用2％海藻酸钠涂布以使得能实现微生物粘合，并且接着用50mL Falcon管中的相等体积的微生物培养物处理。使种子混合以进行均质涂布。种子处理计算是基于针对每一克种子0.01mL各微生物培养物和2％海藻酸钠溶液。

十二粒大豆和小麦的经过处理的种子彼此等距离放置于用30mL无菌蒸馏水达到饱和的重磅发芽纸上。另一张用20mL水达到饱和的发芽纸放置于所述种子上面。种子样品放置于测量22.4×22.4em宽的正方形皮氏平皿内部。密封所述正方形皮氏平皿的盖子并且将平皿放置于用于各作物的两个盒子内部。所有步骤均在无菌条件下执行。

所有样品均在24℃下在65％相对湿度下在暗处孵育持续3天以使得能实现种子发芽。在第3天，去除覆盖所述幼苗的顶部发芽纸张并且略微打开所述盖子以允许逐步水胁迫。将腔室设定改变为24℃、60％相对湿度、250-300μE光持续12小时，随后18℃、50％相对湿度、暗处持续12小时，就小麦来说持续4天并且就大豆来说持续5天。用于两种作物的第二幼苗集合的顶部发芽纸张和盖子保持完整以维持在非水胁迫条件下的植物生长。各盒子内的平皿的放置周期性地随机化以减少在植物生长期间中的任何位置影响。在实验结束时，对各幼苗照相并且测量总的根表面积和质量。分析的所有轮均包括未处理的种子样品以确保种子生活力。通过计算每个重复实验所有发芽的幼苗的平均值、标准偏差和标准误差来获得各处理的原始数据数量平均值。无法发芽或展示表型异常的幼苗从分析中排除。相对于相应的细菌处理的样品，对各经过设计的复合内生菌处理的样品执行分析。

小麦幼苗正常条件的结果在表4中示出。小麦幼苗干旱(水胁迫)条件的结果在表5中示出。大豆幼苗正常条件的结果在表6中示出。

表7示出了植物活力分析的集合结果，突出显示了所述经过设计的复合内生菌对其组分真菌和细菌的益处。如其它实施例中所证明，与小麦和大豆幼苗分析中观察到的益处相比，各复合内生菌可向植物赋予额外益处，或展示对真菌组分或细菌组分或两者的益处。

在几乎每一种情况下，如与单独所述组分(细菌或真菌)中的至少一者并且有时候两者相比较，所述经过设计的复合内生菌就至少一种参数来说向所述幼苗提供益处。在一些情况下，所述细菌帮助所述宿主真菌成为更好的内生菌。在一些情况下，所述宿主真菌帮助所述组分细菌成为更好的内生菌。这些改进中的每一者均在单子叶作物(小麦)、双子叶作物(大豆)两者中得到证明；并且进一步在典型地由植物经历的两种条件(正常浇水条件和水限制条件)下得到证明。

实施例7：证明植物元素上改进的经过设计的复合内生菌生存力

这一实施例描述了如下方法和结果，其用于证明所述被涵盖于宿主真菌内的细菌在经过处理的种子上展示大于在种子上的经过分离并且经过处理的同一细菌菌株的生存力。

如下文所述，制备所述经过设计的复合内生菌和内生菌组分中的每一者的生物量用于种子处理。SYM15779(经过消除)是凝胶状培养物并且因此制备为用于种子处理的液体制剂。经过设计的复合内生菌SYM15779+292和SYM15779+EHB 15779经过干燥以制备为用于种子处理的真菌粉末制剂。SYM15890(经过消除)和其相应的经过设计的复合内生菌SYM15890+EHB166和SYM15890+292经过干燥以制备为用于种子处理的真菌粉末制剂。所述生物量制剂的照片在图10中示出。

表面灭菌的玉米种子涂布如先前所述的液体制剂，或使用通过培养物过滤、随后在生物安全柜中过夜干燥并且随后在研磨机中研磨所收集的真菌粉末进行涂布。种子首先用2％海藻酸钠涂布以使得能实现微生物粘合，并且接着用50mL管中的与滑石混合的真菌粉末处理。使种子混合以进行均质涂布。种子处理计算是基于就每一千克种子来说，10克添加至45mL 2％海藻酸钠溶液中的真菌粉末和滑石中的每一者。所有步骤均在无菌条件下执行。

通过将个别种子放置于微量离心管中的1mL蒸馏无菌水中、随后随后涡旋持续30秒并且收集上清液，来估计针对涂布有经过设计的内共生真菌性内生菌、经过消除的真菌宿主和用于共培养的细菌的种子的集落形成单位(CFU)计数。所述上清液随后用于制备连续稀释液(10^-0、10^-1、10^-2和10^-3)并且将0.005mL各稀释液接种于补充有放线菌酮的LB琼脂上。所有步骤均在无菌条件下执行。

所有结果均概述于图11中。如图11A中所证明，细菌的第1天生存力通过将所述细菌封装于宿主真菌内得到改进。EHB15779第1天生存力通过封装于宿主真菌SYM15779内而改进1-2log(执行2种不同的重复次数)。SYM292第1天生存力通过封装于SYM15779(而非SYM15890)内而改进至少2.5log。如图11B中所证明，内共生真菌性宿主改进细菌的第1天和第6天生存力。细菌SYM292的生存力在第1天和第6天通过将其封装于宿主真菌SYM1579内而得到改进。在宿主真菌SYM25890中SYM292的第6天生存力在第6天比在第1天大。

虽然本发明已经尤其参考优选的实施方案和多种替代的实施方案加以显示和描述，但相关领域技术人员应理解，可在其中进行形式和细节的多种改变而不偏离本发明的精神和范围。

在本说明书的主体内引用的所有参考文献、授权专利和专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文中。

表3：用于本发明的分离的复合内生菌、经过设计的复合内生菌、细菌组分和真菌宿主

用于证明本发明的内生菌和内生菌组分包括：

·分离的复合内生菌：F(B)

·经过确认并非复合内生菌、不包含细菌的内生真菌：F()

·经过消除的分离的复合内生菌和其它内生真菌，均根据实施例部分用抗生素处理并且经过确认不含组分细菌：F(B-)

·分离的并且纯化的细菌：B

·经过设计的复合内生菌，各自包含真菌宿主和组分细菌，由本发明中所述的方法合成：F(B*)

表4：植物活力分析：小麦正常浇水条件

表5：植物活力分析：小麦干旱(水限制/水胁迫)条件

表6：植物活力分析：大豆正常浇水条件

参考文献

Amann et al.(2001)Current Opinion in Biotechnology 12：231-236

Bensch et al，“The genus Cladosporium”in：Studies in Mycology 72：1-401.2012

doi：10.3114/sim0003

Couper and Eley，J.Polymer Sci.，3：345-349(1948)

Craine et al.，Nature Climate Change 3：63-67(2013)

Crous and Groenveld，2006

Desirò et al.(2014 ISME J.8：257-270

Edgar RC，2004

Gao，Zhan，et al.Journal of clinical microbiology 48.00(2010)：3575-3581

Hallman et al.，(1997)Canadian Journal of Microbiology.43(10)：895-914)

Hardegree and Emmerich(Plant Physiol.，92，462-466(1990)

Hawksworth.2012

Hodgson Am.Potato.J.38：259-264(1961)

Hoffman and Arnold，2010Appl.Environ.Microbiol.76：4063-4075

Hoffman et al.，2013PLOS One 8：e73132

International Code ofNomenclaturefor Algae，Fungi，and Plants(Melbourne Code)

Intemational Botanical Congress(2012)

Johnston-Monje D，Raizada MN(2011)PLoS ONE 6(6)：e20396

Jung and Arnold，2012The Effects or Endohyphal Bacteria on Anti-Cancer and Anti-Malaria

Metabolites of Endophytic Fungi，Honors Thesis，University of Arizona

Kwasna 2003

Long et al.，2010，New Phytologist 185：554-567

Lundberg et al，(2012)Nature.488，86-90

Marquez et al.，2007Science 315：513-515

Michel and Kaufmann(Plant Physiol.，51：914-916(1973)

Pearson，1990，Methods Enzymol.183：63-98，incorporated herein by reference in its entirety

Perez-Fernandez et al[J.Environ.Biol.27：669-685(2006)

Sambrook，Joseph，Edward F.Fritsch，and Thomas Maniatis.Molecular cloning.Vol.2New

York：Cold spring harbor laboratory press，1989

Shenoy，2007

Summerbell.2011

Taylor，2011

Zhang and Qiu，2015

美国专利号7,485,451

EP 0818135

CA 1229497

WO 2013090628

EP 0192342

WO 2008103422

CA 1041788

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该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
技术研发人员：K·V·安布罗斯;B·A·博格希吉安;S·迪乔诺维克;P·A·格雷;G·V·托莱多;L·M·马尔克斯;J·N·佩洛斯;G·冯马尔特扎恩
技术所有人：靛蓝农业公司
我是此专利的发明人

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