本发明涉及脏器或组织的保存剂、包含该保存剂的脏器或组织的保存液和脏器或组织的保存方法。
背景技术：
：细胞因夹持细胞膜而在细胞内外离子的组成不同，该具有电荷的离子分布之差导致电位差。通常，细胞内相对于细胞外处于负电位(膜电位)，无论是动植物，该膜电位均作为生物所共通的基本原理而存在。膜电位的调节机制是生命维持和发挥细胞功能所必须的，其缺陷直接导致生命或细胞的死。因此，细胞内外的膜上存在各种各样的离子泵和离子通道，稳定地进行着离子平衡的调节。作为其最重要的调节机制，可列举出：动物细胞中为钠泵(na+-k+atpase)、植物细胞中为质子泵(h+-atpase)。这些离子泵是利用atp能量而主动输送特定的离子的膜蛋白。若由于某种原因而使atp枯竭或环境温度自最佳范围内脱离，则离子泵的功能会降低或停止。动物细胞中，在生理条件下主要通过钠泵的作用而每次使细胞内的3个钠离子泵出至细胞外，相反使2个钾离子从细胞外泵入至细胞内。因此，通常细胞内较高地维持钾浓度(钠浓度低)、而细胞外较高地维持钠浓度(钾浓度低)。在达到一定温度以下的低温时，细胞钠泵的功能会降低，变得无法将钠泵入至细胞外，从而细胞内的钠浓度上升。伴随钠浓度的上升，细胞内渗透压上升，由于水分子的流入而使细胞溶胀，最终导致细胞破裂(细胞伤害)。可认为，在医疗现场进行脏器移植或组织移植时，上述机理是低温保存脏器或组织时造成细胞伤害的主要原因之一，开发出电解质的基本组成为细胞内型的低钠、高钾的脏器或组织保存液。该代表例为euro-collins(ec)液和威斯康星大学(uw：universityofwisconsin)液。与以一直以来的林格溶液为主的细胞外型(高钠、低钾)的保存液相比，它们能够大幅延长移植用脏器或组织的保存期间，在国内外作为临床主要的移植用脏器或组织的保存液加以应用。然而，这些细胞内型保存液在保存温度上升时反而具有引起细胞伤害性的危险性。另外，它们并不能适用于所有的移植用脏器或组织，而期待包括进一步延长保存期间在内的更进一步的性能提高。例如在下述专利文献1～8中公开了保存脏器或组织的技术。专利文献1中公开了：通过将包含一个以上的多元酚的保存溶液添加至生物学材料中进行冷却的生物学材料的保存方法。其实施例中作为多元酚仅公开了儿茶素类。另外，作为冷冻保护物质，虽然公开了蔗糖、葡萄糖、海藻糖等糖类，但该专利文献的实施例中仅使用了海藻糖。专利文献2中公开了：通过向细胞培养液中添加脑啡肽衍生物的、在水不结晶化的温度例如4℃左右的温度下冷藏保存细胞的方法。然而，该专利文献中没有关于糖类的记载。专利文献3中公开了：用于作为含有多元酚和0.0001～0.05重量％的抗坏血酸或抗坏血酸金属盐的细胞保存剂、组织保存剂等使用的医用多元酚溶液。利用该医用多元酚溶液可抑制多元酚的分解，可抑制过氧化氢的产生。然而，该专利文献的实施例中作为多元酚仅使用了表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)。另外，作为可适宜添加的成分，公开了单糖类、二糖类和多糖类的化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)等，但该专利文献的实施例中没有记载糖类。专利文献4中公开了：作为有效成分含有90质量％以上的表没食子儿茶素没食子酸酯的保存剂用组合物，记载了通过将表没食子儿茶素没食子酸酯纯化成高纯度来使用，从而能够更恒定地发挥细胞的保存效果。该专利文献的实施例中，在37℃下保存胰岛时也使用了葡萄糖，但完全没有记载作为本发明的糖类的果糖和蔗糖。专利文献5和专利文献6中公开了：类黄酮糖苷和类黄酮非糖苷化合物组分别具有低温伤害保护效果。进而，专利文献7中公开了：通过类黄酮糖苷和类黄酮非糖苷的组合使用而可进一步提高低温伤害保护效果。专利文献8中公开了：将多元酚作为有效成分、可以包含海藻糖的细胞·组织保存液对于细胞、脏器或组织显示出保护作用。该专利文献的实施例中仅公开了作为多元酚的儿茶素和海藻糖的组合使用。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2007-519712号公报专利文献2：日本特开2002-335954号公报专利文献3：日本特开2006-188436号公报专利文献4：日本特开2003-267801号公报专利文献5：国际公开第2013/047665号专利文献6：国际公开第2013/047666号专利文献7：国际公开第2014/162910号专利文献8：国际公开第02/001952号技术实现要素：发明要解决的问题专利文献1～8中实质上未公开保存脏器或组织的溶液中组合使用槲皮素和本发明的特定的糖类来使用的方案。在低温下简便地保存细胞、组织、器官或脏器等的情形是通常实施的方法。然而，还已知，即使在对象物不冻结的情况下也会发生起因于该低温条件的伤害。一直以来的保存技术并不能适用于保存所有的细胞、组织、器官或脏器，而期待包括进一步延长保存期间在内更进一步的性能提高。为了解决这些低温伤害等的问题，本发明的目的在于提供脏器或组织的保存剂、包含该保存剂的脏器或组织的保存液、以及脏器或组织的保存方法。用于解决问题的方案本发明人等得到如下见解：通过组合使用槲皮素和特定的糖类，在自不伴随冻结的低温至通常的冷藏温度为止的温度下保存细胞，从而可以得到低温伤害保护效果。本发明是基于上述见解而完成的，提供以下的保存剂、保存液和保存方法。(i)保存剂(i-1)一种脏器或组织的保存剂，其包含：(a)槲皮素、以及(b)选自由果糖和蔗糖组成的组中的至少1种糖类。(i-2)根据(i-1)所述的保存剂，其中，前述脏器或组织为心脏、肝脏、肾脏、胰腺或胰岛。(i-3)根据(i-1)或(i-2)所述的保存剂，其为低温保存用。(i-4)一种脏器或组织的低温伤害保护剂，其包含：(a)槲皮素、以及(b)选自由果糖和蔗糖组成的组中的至少1种糖类。(ii)保存液(ii-1)一种脏器或组织的保存液，其包含(i-1)～(i-3)中任一项所述的保存剂。(ii-2)根据(ii-1)所述的保存液，其为低温保存用。(iii)保存方法(iii-1)一种脏器或组织的保存方法，其包括如下工序：在包含(a)槲皮素、以及(b)选自由果糖和蔗糖组成的组中的至少1种糖类的液体混合物中浸渍脏器或组织。(iii-2)根据(iii-1)所述的方法，其中，前述脏器或组织为心脏、肝脏、肾脏、胰腺或胰岛。(iii-3)根据(iii-1)或(iii-2)所述的方法，其中，将前述工序中前述液体混合物保持在低温下。发明的效果利用本发明的保存剂和方法可以得到对于脏器或组织的低温伤害保护效果。因此，在能够适于保存脏器或组织、且抑制低温伤害的条件下能够长期保存脏器或组织。因此，本发明可以期待在脏器移植、组织移植等领域中的应用。具体实施方式以下详细说明本发明。本发明的脏器或组织的保存剂的特征在于，其包含：(a)槲皮素、以及(b)选自由果糖和蔗糖组成的组中的至少1种糖类。另外，本发明的脏器或组织的保存方法的特征在于，其包括如下工序：在包含(a)槲皮素(quercetin)、以及(b)选自由果糖和蔗糖组成的组中的至少1种的糖类的液体混合物中浸渍脏器或组织。本发明中使用的槲皮素和糖类可以利用公知的方法来化学合成，或因包含于植物等生物中，因而也可通过利用公知的方法从它们中提取来获得。另外，槲皮素和糖类还可以利用市售品来获得。本说明书中使用的低温伤害是指由低温导致的细胞伤害，低温伤害保护效果是指保护细胞免受该低温伤害的效果。因此，考虑到其含义，本发明的保存剂还可以称为低温伤害保护剂。本发明中，脏器或组织可以源自任意的动物。其中期望源自哺乳类(人、猴子、牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、小鼠、大鼠等)的脏器或组织。脏器或组织优选适用于脏器移植或组织移植。作为脏器，例如可列举出：心脏、肺脏、肝脏、肾脏、胰腺、小肠等，优选为心脏、肝脏、肾脏和胰腺、特别优选为心脏和肝脏。作为组织，例如可列举出：角膜、皮肤、骨、血管、心脏瓣膜、羊膜、胰岛等，优选为胰岛。本发明的保存剂除了槲皮素以及选自由果糖和蔗糖组成的组中的至少1种的糖类以外，还可以适宜配混公知的添加剂。本发明的脏器或组织的保存液的特征在于，包含上述保存剂。本发明中在保存脏器或组织时，槲皮素以及选自由果糖和蔗糖组成的组中的至少1种的糖类以液体混合物(即，液态的混合物，期望为溶液)(对应于本说明书中的保存液)的形式使用，该液体混合物中除了槲皮素以及选自由果糖和蔗糖组成的组中的至少1种的糖类之外通常含有溶剂。作为该溶剂，没有特别限定，例如可列举出：生理盐水、输液类(电解质输液、营养输液、糖质输液、氨基酸输液、葡萄糖液、林格溶液、乙酸林格溶液、乳酸林格溶液等)、缓冲液(pbs、tris缓冲液、hepes缓冲液、mops缓冲液、pipes缓冲液等)、细胞培养液(rpmi1640、dmem等)、脏器或组织保存液(ec液、uw液、et-kyoto液等)、modena液等。作为本发明的保存液中的槲皮素的浓度，通常为0.001～1000μg/ml、优选为0.01～100μg/ml。作为本发明的保存液中的糖类的浓度，通常为0.01～0.8m、优选为0.025～0.4m(包含果糖和蔗糖这两者时表示总计的浓度)。需要说明的是，本发明的保存液中还可以包含现有的其它成分，例如抗生物质、抗菌剂、抗氧化剂、血清、糖质、脂质、维生素、蛋白质、肽、氨基酸、ph指示剂、螯合剂、渗透压调节剂等。本发明优选在脏器或组织不冻结的温度(低温)下实施。对于脏器或组织不冻结的温度，根据保存剂或保存液中所含的成分和组成、保存期间、保存对象的脏器或组织等的不同而发生变化，所以不能一概而论。从发挥本发明的低温伤害保护效果的观点出发，例如可列举出-15℃～20℃、优选为0℃～20℃、更优选为0℃～10℃的温度。在冷却脏器或组织时，只要脏器或组织不冻结，就可以在将脏器或组织浸渍于上述液体混合物之前预先冷却该混合液，另外也可以对浸渍脏器或组织后的液体混合物进行冷却。另外，包含脏器或组织的液体混合物一旦被冷却后，只要脏器或组织不冻结，该液体混合物就被保持在相同温度下，但无需一直维持在恒定的温度下，如果时间很短的话，也可以是不在前述范围内的温度。通过使用本发明的包含槲皮素以及选自由果糖和蔗糖组成的组中的至少1种的糖类的液体混合物，从而可以得到低温伤害保护效果。本发明能够在适于保存脏器或组织的条件下抑制起因于其的低温伤害，因此能够在适宜的状态下保存脏器或组织。实施例以下为了更详细地说明本发明而列举实施例。然而，本发明不受这些实施例等的任何限定。试验例1(脏器保存试验中的槲皮素和糖类的组合使用效果)假定脏器移植或组织移植时使用的脏器或组织的保存液的保护作用，以肝脏的伤害度作为指标对组合使用了uw液、槲皮素和糖类的保存液的配方进行了评价。作为脏器灌流液，使用了：仅williams液(gibco、no.12551-032)、含有槲皮素(sigma-aldrich337951-25g)(10μg/ml)的williams液、含有槲皮素(10μg/ml)和果糖(0.05m～0.4m)(关东化学株式会社codeno.16065-00)(0.05m～0.4m)的williams液或含有槲皮素(10μg/ml)和蔗糖(0.025m～0.2m)(nacalaitesque,inc.codeno.30404-45)(0.025m～0.2m)的williams液。接着，作为脏器保存液，使用了：仅uw液(astellaspharmainc.、vsp1000viaspan1000ml)、含有槲皮素(10μg/ml)的uw液、含有槲皮素(10μg/ml)和果糖(0.05m～0.4m)的uw液或含有槲皮素(10μg/ml)和蔗糖(0.025m～0.2m)的uw液。在麻醉下将sd大鼠(雄、体重255.4g～339.0g)从门静脉注入肝素后，用室温的生理盐水(8cmh2o、约100ml)进行灌流，接着用室温的各脏器灌流液(8cmh2o、约100ml)进行灌流后，摘取肝脏并浸渍在各脏器保存液20ml中，在4℃下保存。从保存开始至1天后、3天后、5天后和7天后采取一部分各脏器保存液，测定alt(丙氨酸转氨酶：alanineaminotransferase)(iu/l)作为肝脏在低温保存时的伤害度的指标，示于表1和表2(n＝3的平均值±标准偏差)。[表1]表1槲皮素和糖类的组合使用效果(肝脏的保存效果)[表2]表2槲皮素和糖类的组合使用效果(肝脏的保存效果)与保存在含有槲皮素和果糖或槲皮素和蔗糖的uw液中的情况相比，保存在含有槲皮素和海藻糖的uw液中时，alt值增大。试验例2(脏器保存试验中的槲皮素和糖类的组合使用效果)将肝脏变更为心脏，与试验例1同样地以心脏的伤害度作为指标对组合使用了uw液、以及槲皮素和糖类的保存液的配方进行了评价。作为脏器灌流液，使用了：仅williams液，含有槲皮素(10μg/ml)和果糖(0.2m)的williams液或含有槲皮素(10μg/ml)和蔗糖(0.1m)的williams液。接着，作为脏器保存液，使用了：仅uw液，含有槲皮素(10μg/ml)和果糖(0.2m)的uw液或含有槲皮素(10μg/ml)和蔗糖(0.1m)的uw液。在麻醉下将sd大鼠(雄、体重：257.4g～280.3g)从肝上部下大静脉注入肝素后，用室温的生理盐水(8cmh2o、约100ml)进行灌流，接着用室温的各脏器灌流液(8cmh2o、约100ml)进行灌流后，摘取心脏并浸渍于各脏器保存液20ml中，在4℃下保存。从保存开始至1天后、2天后、3天后和4天后，采取一部分各脏器保存液，测定ldh(乳酸脱氢酶)(iu/l)，作为心脏在低温保存时的伤害度的指标，示于表3(n＝3的平均值±标准偏差)。[表3]表3槲皮素和糖的组合使用效果(心脏的保存效果)试验例3(脏器或组织保存试验中的槲皮素和糖类的组合使用效果、病理组织学的变化)以肝脏的病理组织学的变化作为指标对组合使用了uw液、以及槲皮素和糖类的保存液的配方进行了评价。作为脏器灌流液，使用了：仅williams液，仅含有槲皮素(10μg/ml)的williams液、仅含有果糖(0.2m)的williams液、仅含有蔗糖(0.1m)的williams液、含有槲皮素(10μg/ml)和果糖(0.2m)的williams液或含有槲皮素(10μg/ml)和蔗糖(0.1m)的williams液。接着，作为脏器保存液，使用了：仅uw液，仅含有槲皮素(10μg/ml)的uw液、仅含有果糖(0.2m)的uw液、仅含有蔗糖(0.1m)的uw液、含有槲皮素(10μg/ml)和果糖(0.2m)的uw液或含有槲皮素(10μg/ml)和蔗糖(0.1m)的uw液。在麻醉下将sd大鼠(雄、体重：264.1g～317.2g)从门静脉注入肝素后，用室温的生理盐水(8cmh2o、约100ml)进行灌流，接着用室温的各脏器灌流液(8cmh2o、约100ml)进行灌流后，摘取肝脏并浸渍于各脏器保存液20ml中，在4℃下保存。从保存开始至1天后和2天后，用10％磷酸缓冲福尔马林水溶液固定所有的肝脏，然后根据常规方法包埋于石蜡中。制成约6μm薄片，制作苏木精-伊红双重染色标本，进行显微镜检查。如下所示对观察到的病理组织学变化的程度进行评分值化并以累积值的形式进行统计，示于表4和表5。评分0：未观察到变化；评分0.5：轻微的变化；评分1.0：轻度的变化；评分2.0：中等程度的变化；评分3.0：高度的变化。[表4]表4槲皮素和糖类的组合使用效果(4℃保存1天后)[表5]表5槲皮素和糖类的组合使用效果(4℃保存2天后)试验例4(脏器或组织保存试验中的槲皮素和糖类的组合使用效果、大鼠原位肝脏移植)通过大鼠原位肝脏移植对组合使用了uw液、以及槲皮素和糖类的保存液的配方效果进行了评价。作为脏器灌流液，使用了：仅williams液、含有槲皮素(10μg/ml)和蔗糖(0.1m)的williams液。接着，作为脏器保存液，使用了：仅uw液，含有槲皮素(10μg/ml)和蔗糖(0.1m)的uw液。在麻醉下将供体的sd大鼠(雄、体重273.8g～335.7g)从门静脉注入肝素后，用室温的生理盐水(8cmh2o、约100ml)进行灌流，接着用室温的各脏器灌流液(8cmh2o、约100ml)进行灌流后，摘取肝脏并浸渍于各脏器保存液20ml中，在4℃下保存。从保存开始至1天后向接受者大鼠中原位移植，移植2小时后测定血中alt，作为肝脏在低温保存时的伤害度的指标，示于表6(n＝3的平均±标准偏差)。另外，同时用10％磷酸缓冲福尔马林水溶液固定所有的肝脏，然后根据常规方法包埋于石蜡中。制成约6μm薄片，制作苏木精-伊红双重染色标本，进行显微镜检查。如下所示对观察到的病理组织学变化的程度进行评分值化并以累积值的形式进行统计，示于表7。评分0：未观察到变化；评分0.5：轻微的变化；评分1.0：轻度的变化；评分2.0：中等程度的变化；评分3.0：高度的变化。[表6]表6槲皮素和糖类的组合使用效果(大鼠原位肝脏移植血中的alt值(iu/l))保存剂血中的alt值(iu/l)(1)uw119±13(2)uw+槲皮素10μg/ml+蔗糖0.1m78±8[表7]表7肝脏的病理组织学变化(n＝3的累积评分)当前第1页12