一种冬樱离体快繁方法与流程

本发明属植物组织培养技术领域，更具体地说，本发明涉及一种冬樱离体快繁方法。

背景技术：

冬樱(cerasus×parvifolia‘fuyu-zakura’)为豆樱与大岛樱的杂交品种，成叶小，又称小叶樱；小乔木，宽卵状树形。每年开花两次，冬花期为11月上旬至次年1月，因此而得名；春花期为3月下旬，花叶同放，花量比冬花大。伞房花序，1～4朵一束；花径约3cm；春花的先端缺刻深，冬花的先端缺刻浅，逆突形，花梗无毛，萼筒钟状，紫绿色，无毛，萼片长椭圆形，全缘，无毛；花瓣5枚，白色至淡红色。雌蕊无毛，柱头花柱与花柱同等高度的位置。果实直径1厘米，果黑熟有甜味。“三波川的冬樱”被指定为“天然纪念物”。我国武汉东湖等公园有少量引种栽培，生长表现良好。一年冬春两次，跟其他品种搭配，极大地延长了樱花园的观花期，开发前景广阔。

目前，由于冬樱的母株材料少，嫁接繁殖数量有限，远远满足不了市场推广需求，迫切需要通过组培快繁技术进行扩繁，以冬樱成年优株为母株进行组培快繁技术研究，通过离体快繁促进冬樱产业化开发，意义现实而重大。

经过文献检索，尚未见关于冬樱组培快繁的报道。试验表明，现发表的樱属植物相关种组织培养所用的配方并不适合冬樱的离体繁殖，容易出现初代培养的褐化、继代中玻璃苗大量产生、芽伸长生长慢、有效芽少、顶芽枯死等问题，导致增殖系数小，成苗质量差，繁殖速度慢，生产成本高。

技术实现要素：

本发明的目的在于：克服现有技术中关于冬樱离体快繁方法匮乏、相关培养基对冬樱离体快繁效果差的问题，提供一种冬樱的离体快繁方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种冬樱离体快繁方法，其包括如下步骤：

(1)外植体预处理及采集：剪取外植体前，每隔3～4天用多菌灵或百菌清溶液800倍交替喷洒冬樱树体2～3次，剪取冬樱的上半木质化枝条作为外植体(天气晴朗的上午为宜)，保湿带回实验室后，氯气熏蒸20min，除叶，用洗洁精溶液浸泡5min后，用软毛笔蘸洗洁精溶液仔细地轻轻刷洗枝条各部(切勿刷掉托叶)，然后用纯净水洗净，低温保湿备用；

(2)外植体消毒和腋芽诱导：枝条用无菌水清洗两遍后，使用次氯酸钠和升汞对外植体进行消毒，然后接种到诱导培养基上培养得到腋芽，诱导培养基以1/2yd为基本培养基，每升添加6-ba(6-苄氨基腺嘌呤)0.5～1.0mg、kt(激动素)0.1～0.5mg、iba(吲哚丁酸)0～0.1mg、naa(萘乙酸)0.05～0.1mg、蔗糖20～40g、琼脂6g，ph为5.8～6.0；

(3)增殖培养：将腋芽切下接种到增殖培养基上培养得到增殖苗，增殖培养基以yd为基本培养基，每升添加6-ba0.4～0.8mg、kt0.1～0.5mg、iba0～0.1mg、naa0～0.1mg、ga3(赤霉素)1～5mg、蔗糖20～40g、琼脂5.6g，ph为5.8～6.0；

(4)生根培养：将增殖苗的嫩芽切取并接种到生根培养基中培养得到生根苗，生根培养基以1/2yd培养基为基本培养基，每升添加naa0.1～0.5mg、iba0.1～0.5mg、蔗糖15～20g，琼脂5.6g，ph为5.8～6.0；

(5)炼苗与移栽：将生根苗移到温室进行炼苗移栽，得到冬樱种苗。

作为本发明冬樱离体快繁方法的一种改进，步骤(1)中，所述氯气熏蒸是将外植体盛入玻璃器皿中，放入直径400mm的干燥皿内，用1g/片药片的1/4(0.25g二氧化氯片作用量)与水反应释放的氯气密闭熏蒸干燥皿内的外植体20min。

作为本发明冬樱离体快繁方法的一种改进，步骤(2)和(3)中，所述培养条件为24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/天。

作为本发明冬樱离体快繁方法的一种改进，步骤(4)中，所述培养条件为25±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/天。

作为本发明冬樱离体快繁方法的一种改进，所述yd培养基含有以下成分：1100mg/lnh4no3、1350mg/lkno3、330mg/lcacl2·2h2o、100mg/lca(no3)2·4h2o、370mg/lmgso4·7h2o、170mg/lkh2po4、100mg/lk2so4、22.3mg/lmnso4·4h2o、8.6mg/lznso4·7h2o、6.2mg/lh3bo3、0.83mg/lki、0.25mg/lna2moo4·2h2o、0.25mg/lcuso4·5h2o、0.025mg/lcocl2、33.4mg/lfeso4·7h2o、44.8mg/lna2·edta·h2o、100mg/l肌醇、2.0mg/l甘氨酸、0.1mg/l盐酸硫胺素、0.5mg/l烟酸、0.5mg/l盐酸吡哆醇，ph5.8，溶剂为水；所述1/2yd培养基为将yd培养基中nh4no3、kno3、ca(no3)2·4h2o、cacl2·2h2o、mgso4·7h2o、kh2po4、k2so4的用量减半，其余成分不变。

作为本发明冬樱离体快繁方法的一种改进，步骤(2)中所述消毒是使用10～20wt％的次氯酸钠溶液浸泡2～5min后，倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗4～5次，再加入0.1wt％升汞溶液中浸泡1～3min，期间不断摇动，然后倒掉升汞溶液，用无菌水冲洗5～6次。

作为本发明冬樱离体快繁方法的一种改进，步骤(2)中所述接种到诱导培养基上是将外植体用无菌刀片切除托叶、叶柄、茎段两端的受伤部位后，再接种到诱导培养基上，一瓶接种一个外植体。

作为本发明冬樱离体快繁方法的一种改进，步骤(3)中，将腋芽切下接种到增殖培养基后，腋芽分化形成新芽丛，将新芽丛中的芽高大于等于3cm的切割成1.0～1.5cm的茎段，再转入新的增殖培养基中培养，得到增殖苗。

作为本发明冬樱离体快繁方法的一种改进，步骤(5)中，将生根苗移到温室中适应环境5～7天，光照强度为5000～10000lx，移栽前1～2天将组培瓶盖从半开到全开炼苗，然后将组培苗取出洗净培养基，移栽到体积比为泥炭：珍珠岩：砻糠灰＝3:1:1的混合基质上，移栽后前4～5天采用盖膜保湿，然后解开盖膜按照常规幼苗管理。

本发明通过基本培养基(yd培养基，专门针对冬樱生理状态设定的基本培养基)设置、不同激素成份及浓度水平配比优化，以成年优株半木质化枝条为外植体，经腋芽诱导、腋芽增殖和生根培养，形成完整植株，移栽到基质后，得到生长整齐、表型一致的健壮苗木。本发明具有外植体的腋芽诱导速度快，诱导率高达100％、繁殖系数高达9.5、增殖芽伸长生长快，培养20d芽高达3～5cm；生根培养10d，生根率达100％，根数达5条/株以上；组培生根苗健壮、移栽成活率高达95％以上；在实际生产应用中可进行周年规模化快速育苗，生产出健壮、整齐一致的冬樱组培苗。

相对于现有技术，本发明具有如下优点：

本发明方法具有诱导速度快、诱导率高，增殖系数大、丛芽粗壮、伸长生长快、芽长，生根率高、根系发达，生根苗粗壮、移栽成活率高，苗木生长健壮整齐，生产成本低的优点。此外，通过适当降低冬樱增殖培养基中激素水平，可确保增殖芽的质量和增殖系数>5(继代周期20d)，同时，继代周期延长至3个月。本发明为冬樱种苗的规模化苗木生产提供了有效途径，通过规模化育苗，可以大规模的获得冬樱种苗，将为冬樱的无性化推广提供技术支持，为我国园林绿化及生态文明建设提供新优樱花品种及优质种苗，意义重大，应用前景广阔。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明冬樱离体快繁方法以及有益效果进行详细说明。

图1为本发明腋芽诱导图。

图2为本发明增殖培养基中的增殖瓶苗。

图3为本发明生根培养基中的生根苗根系。

图4为本发明组培生根苗。

图5为本发明组培生根苗移栽后的生长情况。

图6为本发明可出圃的组培容器苗。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

以下实施例中的yd培养基，其含有以下成分：1100mg/lnh4no3、1350mg/lkno3、330mg/lcacl2·2h2o、100mg/lca(no3)2·4h2o、370mg/lmgso4·7h2o、170mg/lkh2po4、100mg/lk2so4、22.3mg/lmnso4·4h2o、8.6mg/lznso4·7h2o、6.2mg/lh3bo3、0.83mg/lki、0.25mg/lna2moo4·2h2o、0.25mg/lcuso4·5h2o、0.025mg/lcocl2、33.4mg/lfeso4·7h2o、44.8mg/lna2·edta·h2o、100mg/l肌醇、2.0mg/l甘氨酸、0.1mg/l盐酸硫胺素、0.5mg/l烟酸、0.5mg/l盐酸吡哆醇，溶剂为水。按照上述配方的成分和含量，将上述成分混合均匀，调ph5.8、121℃灭菌18～20min，得到yd培养基，备用。所述的1/2yd培养基为将yd培养中所含大量元素(nh4no3、kno3、ca(no3)2·4h2o、cacl2·2h2o、mgso4·7h2o、kh2po4、k2so4)的用量减半，其余成分不变。

实施例1

一种冬樱离体快速繁殖方法，包括如下步骤：

(1)外植体采集：4～5月份天气晴朗的上午10时左右，从冬樱母株上剪取生长健壮、无病虫害的半木质化枝条，保湿处理后带回实验室，将采集后嫩枝氯气熏蒸20min(400mm干燥皿内0.25g二氧化氯片作用量)。除叶，用纯净水清洗干净后作为外植体置4℃冰箱保存备用。采集外植体前，每隔3～4d用800倍多菌灵、百菌清交替喷洒萌枝2～3次。

(2)外植体表面消毒：将枝条(外植体)剪成4cm左右长的带叶腋茎段，在超净工作台上先用无菌水擦洗干净，再用质量分数10％～20％次氯酸钠溶液，浸泡时间2～5min，倒掉次氯酸钠溶液后，用无菌水冲洗4～5次，然后加入质量分数0.1％升汞溶液，根据外植体幼嫩程度浸泡1～3min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液后，再用无菌水冲洗5～6次。无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，用无菌刀片切除托叶、叶柄、茎段两端受伤部位后，再将茎段切成1.5～2cm带叶腋茎段备用，得到消毒好的带叶腋切断。

(3)腋芽诱导：将消毒好的带叶腋茎段(外植体)接种到诱导培养基上培养，培养条件为：24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d，每瓶接种一个外植体，腋芽第2～3d开始萌动，腋芽伸长快，第20d可长至2.5cm左右(图1)，诱导率为100％，所述的诱导培养基以1/2yd为基本培养基，每升添加6-ba0.8mg、kt0.2mg、naa0.05mg、蔗糖30g、琼脂6g(激素购自sigma-aldrich公司)，ph为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调ph值，灭菌备用)，由此得到腋芽。

(4)增殖培养：将诱导出的腋芽截成1.0～1.5cm的茎段转接入增殖培养基上培养，培养条件为：24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d，所述的增殖培养基以yd为基本培养基，每升添加6-ba0.5mg、kt0.2、iba0.1mg、naa0.05mg、ga35mg、蔗糖30g、琼脂5.6g，ph为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调ph值，灭菌备用)，腋芽接入增殖培养基后，芽伸长生长快，单芽形成芽丛，20d增殖系数最高达9.5，苗高达5cm(图2)，由此得到增殖苗。

(5)生根培养：从增殖苗选取健壮的有效芽(芽高>1.5cm)切取转接到生根培养基中培养，培养条件为：25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d，所述的生根培养基以1/2yd为基本培养基，每升添加naa0.2mg、iba0.2mg、蔗糖15g、琼脂5.6g，ph为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调ph值，灭菌备用)，10d生根率达100％，每株平均生根数达5条以上(图3、图4)。

(6)炼苗与移栽：将生根瓶苗移到温室中适应外界环境5～7d，光照强度为5000～10000lx，出瓶移植前1～2d将组培瓶盖从半开到全开炼苗，使瓶苗逐步适应适度小的自然环境，炼苗后将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在苗上的培养基，移植到填满泥炭:珍珠岩:砻糠灰＝3:1:1(体积比)混合基质的育苗杯中，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，压紧基质，使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定根水。

(7)幼苗培育：移植后，对幼苗进行水分、肥及防病菌的管理：

①水分管理：瓶苗在移植后基质保持湿润，空气相对湿度在80％～90％为宜，前4～5d可通过盖膜保湿，之后通过喷雾补水，控制培养温度25±2℃，荫棚用70％的遮阳网遮光；

②肥及防病菌的管理：在移植后第三天用质量分数0.1％百菌清或多菌灵溶液喷雾消毒灭菌，之后每隔10d喷雾一次，百菌清和多菌灵交替使用；当有新芽萌发、新根长出时，喷施0.2％复合肥+0.04％尿素混合液，每隔15d喷施一次；

③待生长稳定，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光照常规管理，移栽后一个月成活率达97％(图5)，待幼苗长至10～15cm高时(图6)，可移至大田培育大苗。

实施例2

一种冬樱离体快速繁殖方法，包括如下步骤：

(1)外植体采集：4～5月份天气晴朗的上午10时左右，从冬樱母株上剪取生长健壮、无病虫害的半木质化枝条，保湿处理后带回实验室，将采集后嫩枝氯气熏蒸20min(400mm干燥皿内0.25g二氧化氯片作用量)。除叶，用纯净水清洗干净后作为外植体置4℃冰箱保存备用。采集外植体前，每隔3～4d用800倍多菌灵、百菌清交替喷洒萌枝2～3次。

(2)外植体表面消毒：将枝条(外植体)剪成4cm左右长的带叶腋茎段，在超净工作台上先用无菌水摖洗干净，再用质量分数10％～20％次氯酸钠溶液，浸泡时间2～5min，倒掉次氯酸钠溶液后，用无菌水冲洗4～5次，然后加入质量分数0.1％升汞溶液，根据外植体幼嫩程度浸泡1～3min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液后，再用无菌水冲洗5～6次。无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，用无菌刀片切除托叶、叶柄、茎段两端受伤部位后，再将茎段切成1.5～2cm带叶腋茎段备用，得到消毒好的带叶腋切断。

(3)腋芽诱导：将消毒好的带叶腋茎段(外植体)接种到诱导培养基上培养，培养条件为：24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d，每瓶接种一个外植体，腋芽第6～7d开始萌动，诱导率为76.7％，所述的诱导培养基以1/2yd为基本培养基，每升添加6-ba0.5mg、kt0.5mg、naa0.1mg、蔗糖30g、琼脂6g(激素购自sigma-aldrich公司)，ph为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调ph值，灭菌备用)，由此得到腋芽。

(4)增殖培养：将诱导出的腋芽截成1.0～1.5cm的茎段转接入增殖培养基上培养，培养条件为：24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d，所述的增殖培养基以yd为基本培养基，每升添加6-ba0.8mg、kt0.1、iba0.05mg、naa0.1mg、ga33mg、蔗糖40g、琼脂5.6g，ph为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调ph值，灭菌备用)，腋芽接入增殖培养基后，芽伸长生长快，单芽形成芽丛，20d增殖系数最达5.4，苗高达2.5cm左右，由此得到增殖苗。

(5)生根培养：从增殖苗选取健壮的有效芽(芽高>1.5cm)切取转接到生根培养基中培养，培养条件为：25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d，所述的生根培养基以1/2yd为基本培养基，每升添加naa0.2mg、iba0.5mg、蔗糖15g、琼脂5.6g，ph为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调ph值，灭菌备用)，10d生根率达78％。

(6)炼苗与移栽：将生根瓶苗移到温室中适应外界环境5～7d，光照强度为5000～10000lx，出瓶移植前1～2d将组培瓶盖从半开到全开炼苗，使瓶苗逐步适应适度小的自然环境，炼苗后将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在苗上的培养基，移植到填满泥炭:珍珠岩:砻糠灰＝3:1:1(体积比)混合基质的育苗杯中，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，压紧基质，使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定根水。

(7)幼苗培育：移植后，对幼苗进行水分、肥及防病菌的管理：

①水分管理：瓶苗在移植后基质保持湿润，空气相对湿度在80％～90％为宜，前4～5d可通过盖膜保湿，之后通过喷雾补水，控制培养温度25±2℃，荫棚用70％的遮阳网遮光；

②肥及防病菌的管理：在移植后第三天用质量分数0.1％百菌清或多菌灵溶液喷雾消毒灭菌，之后每隔10d喷雾一次，百菌清和多菌灵交替使用；当有新芽萌发、新根长出时，喷施0.2％复合肥+0.04％尿素混合液，每隔15d喷施一次；

③待生长稳定，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光照常规管理，移栽后一个月成活率达95％，待幼苗长至10～15cm高时，可移至大田培育大苗。

实施例3

一种冬樱离体快速繁殖方法，包括如下步骤：

(1)外植体采集：4～5月份天气晴朗的上午10时左右，从冬樱母株上剪取生长健壮、无病虫害的半木质化枝条，保湿处理后带回实验室，将采集后嫩枝氯气熏蒸20min(400mm干燥皿内0.25g二氧化氯片作用量)。除叶，用纯净水清洗干净后作为外植体置4℃冰箱保存备用。采集外植体前，每隔3～4d用800倍多菌灵、百菌清交替喷洒萌枝2～3次。

(2)外植体表面消毒：将枝条(外植体)剪成4cm左右长的带叶腋茎段，在超净工作台上先用无菌水摖洗干净，再用质量分数10％～20％次氯酸钠溶液，浸泡时间2～5min，倒掉次氯酸钠溶液后，用无菌水冲洗4～5次，然后加入质量分数0.1％升汞溶液，根据外植体幼嫩程度浸泡1～3min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液后，再用无菌水冲洗5～6次。无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，用无菌刀片切除托叶、叶柄、茎段两端受伤部位后，再将茎段切成1.5～2cm带叶腋茎段备用，得到消毒好的带叶腋切断。

(3)腋芽诱导：将消毒好的带叶腋茎段(外植体)接种到诱导培养基上培养，培养条件为：24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d，每瓶接种一个外植体，腋芽第5～6d开始萌动，诱导率为82％，所述的诱导培养基以1/2yd为基本培养基，每升添加6-ba1.0mg、kt0.1mg、iba0.05mg、naa0.08mg、蔗糖30g、琼脂6g(激素购自sigma-aldrich公司)，ph为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调ph值，灭菌备用)，由此得到腋芽。

(4)增殖培养：将诱导出的腋芽截成1.0～1.5cm的茎段转接入增殖培养基上培养，培养条件为：24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d，所述的增殖培养基以yd为基本培养基，每升添加6-ba0.6mg、kt0.5mg、iba0.1mg、ga31.0mg、蔗糖30g、琼脂5.6g，ph为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调ph值，灭菌备用)，腋芽接入增殖培养基后，芽伸长生长快，单芽形成芽丛，20d增殖系数最达3.2，苗高达2cm左右，由此得到增殖苗。

(5)生根培养：从增殖苗选取健壮的有效芽(芽高>1.5cm)切取转接到生根培养基中培养，培养条件为：25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d，所述的生根培养基以1/2yd为基本培养基，每升添加naa0.5mg、iba0.2mg、蔗糖15g、琼脂5.6g，ph为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调ph值，灭菌备用)，10d生根率达80％。

(6)炼苗与移栽：将生根瓶苗移到温室中适应外界环境5～7d，光照强度为5000～10000lx，出瓶移植前1～2d将组培瓶盖从半开到全开炼苗，使瓶苗逐步适应适度小的自然环境，炼苗后将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在苗上的培养基，移植到填满泥炭:珍珠岩:砻糠灰＝3:1:1(体积比)混合基质的育苗杯中，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，压紧基质，使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定根水。

(7)幼苗培育：移植后，对幼苗进行水分、肥及防病菌的管理：

①水分管理：瓶苗在移植后基质保持湿润，空气相对湿度在80％～90％为宜，前4～5d可通过盖膜保湿，之后通过喷雾补水，控制培养温度25±2℃，荫棚用70％的遮阳网遮光；

②肥及防病菌的管理：在移植后第三天用质量分数0.1％百菌清或多菌灵溶液喷雾消毒灭菌，之后每隔10d喷雾一次，百菌清和多菌灵交替使用；当有新芽萌发、新根长出时，喷施0.2％复合肥+0.04％尿素混合液，每隔15d喷施一次；

③待生长稳定，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光照常规管理，移栽后一个月成活率达95％，待幼苗长至10～15cm高时，可移至大田培育大苗。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。