本发明属于植物种子保存及萌发技术领域，具体地，涉及一种促进低温(-18℃至-20℃)保存后尼泊尔野桐种子萌发的方法。
背景技术：
尼泊尔野桐(mallotusnepalensismüll.arg.)是大戟科(euphorbiaceae)野桐属(mallotuslour.)落叶灌木或小乔木树种。分布于西藏云南海拔1700到2500米的山坡或沟谷中，国外主要分布在不丹、印度东北、缅甸及尼泊尔，国内研究报道较少，国外有报道其提取物具有温和抑制中枢神经的作用。未见尼泊尔野桐种子储藏方面的研究报道。
将正常型种子干燥后低温(-18℃至-20℃)保藏可以极大的延长其寿命，这在国际上已经形成共识，并且基于这一理论建立了多个农作物及野生植物种子库；但一些植物的种子在干燥和/或冷藏后萌发特性会发生变化，如本发明所涉及的尼泊尔野桐种子，低温(-18℃至-20℃)保存一段时间后则几乎完全不能萌发。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术中在低温(-18℃至-20℃)保存一段时间后的尼泊尔野桐种子几乎完全不能萌发的技术难题，提供一种简便高效萌发低温保存后尼泊尔野桐种子的方法。为实现该物种的长期有效保存及利用提供技术支持。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种促进低温保存后尼泊尔野桐种子萌发的方法，包括如下步骤：
(1)将在-18℃至-20℃冷藏保存后的种子连同其密闭容器取出，在温度为15℃、相对湿度15％的环境中放置24小时回温；
(2)将回温后的种子从密闭容器中取出，放置在温度为45℃-55℃的培养箱中，热处理6小时后取出；
(3)将步骤(2)处理后的种子放置在室温下，待种子温度恢复到室温后播种于含200毫克/升赤霉素的1％琼脂培养基中，放置于20℃下萌发，光照强度为1000勒克斯，光周期为12小时光照/12小时黑暗。
根据所述的一种促进低温保存后尼泊尔野桐种子萌发的方法，其中所述步骤(1)在-18℃至-20℃冷藏保存的种子是采集成熟饱满的种子，先将种子置于温度为15℃、相对湿度15％的环境中直到种子的平衡相对湿度达到15％(此时种子的含水量通常低于10％)，然后再将种子放入密闭容器中，保存于-18℃至-20℃。
本发明为一种促进低温保存后尼泊尔野桐种子萌发的方法，更具体的步骤是：
采集成熟饱满的种子，将种子置于温度为15℃、相对湿度15％的环境中，至种子的平衡相对湿度达到15％时，将种子放入密闭容器，保存于-18℃至-20℃中，以上为国际通用的正常型种子保存方法。种子保存一段时间后，根据需要，将装有种子的密闭容器取出，在温度为15℃、相对湿度15％的环境中放置24小时回温；随后将种子从容器中取出，放置在培养箱温度为45℃-55℃的培养箱中，热处理6小时后取出，待种子温度恢复到室温后播种于含200毫克/升赤霉素的1％琼脂培养基上，将培养基放置于20℃下萌发，光照强度为1000勒克斯，光周期为12小时光照/12小时黑暗。
具体实施方式
下面用本发明实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2014年10月，安徽黄山徽州区富溪乡新田村采集成熟的新鲜尼泊尔野桐(mallotusnepalensis)种子。采集后运回昆明植物研究所西南野生生物种质资源库种子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回温：将1.1步骤采集到的种子置于15℃，15％相对湿度的干燥间中干燥。定期以rotronicltd.公司生产的hygrolabc1unit相对湿度测定仪结合同一公司生产的rotronichc2-aw探头对种子相对湿度进行测定，待平衡相对湿度达到15％后装入密闭的容器中。2015年9月14日将装有种子的密闭容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏处理1年后将装有种子的密闭容器取出。放入15℃，15％相对湿度的干燥间中24小时回温后打开装有种子的容器，随机取出实验所需种子。
1.2.2实验设计：将种子分为2组处理，分别为对照组和热处理组；热处理温度设置45、55和60℃三个梯度，时间设置6个小时。每个处理3个重复，每个重复20粒种子。
1.2.3热处理方法：将种子放入培养箱，培养箱温度设定为45、55和60℃。处理6小时后每个温度随机取出60粒种子用于萌发实验。
1.2.4萌发：将热处理后的种子取出，放置在室温下，待种子温度恢复到室温后将种子播种于含有200毫克每升赤霉素的1％琼脂培养基上，将培养基装入透明自封袋中防止水分散失，然后置于于20℃的光照培养箱中，光照强度为1000勒克斯，光周期为12小时光照/12小时黑暗。每间隔2-3天检查一次萌发，胚根伸长超过5mm即认为种子萌发，将萌发种子取出，并记录萌发数量；实验开始4周后连续2周无萌发即结束实验。
1.2.5数据分析：利用spss16.0软件对萌发数据进行分析，采用one-wayanova进行方差分析，并用s-n-k法对不同温度处理的萌发率做多重比较。
2.结果
2.1不同温度热处理对采自安徽黄山冷藏后的尼泊尔野桐种子萌发的影响：
表1不同温度热处理对冷藏后安徽黄山尼泊尔野桐种子萌发率(％)的影响
注：数字为平均值±标准误,不同字母表示不同处理间的萌发率具有显著差异
由表1可以看出，-20℃下冷藏1年后未经热处理的种子均完全没有萌发，45℃处理6小时后萌发率达到28.3％，55℃和60℃处理6小时后萌发率均为35％；45、55及60℃处理之间无显著差异。综合考虑能耗与效果，在下面的实施例2中，将采用45-55℃处理6小时的方法。
实施例2：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2012年9月4日云南省文山州文山县采集成熟的新鲜尼泊尔野桐(mallotusnepalensis)种子。采集后运回昆明植物研究所西南野生生物种质资源库种子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回温：将1.1采集到的种子置于15℃，15％相对湿度的干燥间中干燥。定期以rotronicltd.公司生产的hygrolabc1unit相对湿度测定仪结合同一公司生产的rotronichc2-aw探头对种子相对湿度进行测定，待平衡相对湿度达到15％后装入密闭的容器中。2013年8月6日将装有种子的密闭容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏3年2个月后将装有种子的容器取出。放入15℃，15％相对湿度的干燥间中24小时回温后打开装有种子的容器，随机取出实验所需种子。
1.2.2实验设计：将种子分为2组处理，分别为对照组和热处理组；热处理温度设置45和55℃二个梯度，处理时间均为6小时。每个处理3个重复，每个重复20粒种子。
1.2.3热处理方法：将种子放入培养箱，培养箱温度设定为45和55℃。处理6小时后取出60粒种子用于萌发实验。
1.2.4萌发：将热处理后的种子取出，放置在室温下，待种子温度恢复到室温后将种子播种于含有200毫克每升赤霉素的1％琼脂培养基上，将培养基装入透明自封袋中防止水分散失，然后置于于20℃的光照培养箱中，光照强度为1000勒克斯，光周期为12小时光照/12小时黑暗。每间隔2-3天检查一次萌发，胚根伸长超过5mm即认为种子萌发，将萌发种子取出，并记录萌发数量；实验开始4周后连续2周无萌发即结束实验。
1.2.6数据分析：利用spss16.0软件对萌发数据进行分析，采用one-wayanova进行方差分析，并用s-n-k法对不同处理的萌发率做多重比较。
2.结果
2.1不同温度热处理对采自云南文山冷藏后尼泊尔野桐种子萌发的影响。
表2不同温度热处理对冷藏后云南文山尼泊尔野桐种子萌发率(％)的影响
注：数字为平均值±标准误，不同字母表示不同处理间的萌发率具有显著差异
由表2可以看出，-20℃下冷藏3年2个月的尼泊尔野桐种子，未经热处理的萌发率为0；经45℃热处理后，萌发率提高到6.7％，但是未达到有显著差异的水平，55摄氏度处理后萌发率为20％，与对照及45℃处理的均有显著差异。该份种子与实施例1中的种子在45℃热处理的效果略有不同，55℃的效果类似，可能与这两份种子产地不同有关。
3、本发明的积极效果如下：
与现有技术相比，本发明显著提高了不同产地(安徽及云南)，干燥后低温(-18℃至-20℃)下储存不同时间(1年及3年2个月)的尼泊尔野桐种子的萌发。较好的解决了尼泊尔野桐种子低温保藏后不能萌发的问题。且处理方法简便易行，根据产地不同45℃的效果有所不同，但55℃均有显著效果，而且无任何危险性及毒副作用。