本发明涉及牧草栽培领域，具体涉及一种白三叶的栽培方法。
背景技术：
白三叶(trifoliumrepens)是世界范围内广泛栽培的多年生豆科牧草，产草量高、品质好，各种家畜均喜采食，在草地中兼有提供优质饲草和固定土壤氮素的双重作用。此外，白三叶也是环境保护和生态建设中重要的水土保持和庭院绿化植物。但是，在生产中因干旱导致的减产或枯死现象日益突出。因此，在白三叶栽培中，急需探寻提高白三叶抗旱性的栽培措施与方法。
干旱胁迫是影响植物生长发育和产量的主要非生物逆境因子之一。因全球气候变化，我国北方大多数地区的持续干旱形势可能更加严峻，而南方的季节性和持续性干旱亦愈益凸现，导致我国农作物干旱受灾面积逐年增加。
农业生产中，通过施用外源添加物提高作物抗旱性具有操作简单、见效快等特点，在果树、蔬菜、小麦等作物上已有大量报道。然而，目前有关外源添加提高植物抗逆性的研究报道绝大多数采用的是单一的添加物，而国内外通过外源添加提高白三叶抗旱性的相关研究少有报道，有效的添加组合尤其罕见。
因此，针对生产栽培中白三叶抗旱性差，对水分需求量大，干旱胁迫对白三叶生长及产量造成的损失极为严重，且当前缺乏能有效改善白三叶抗旱性且施用简单的外源添加及其组合，急需探寻提高白三叶在干旱下的存活率和生长量的简单有效手段，以期为生产中白三叶的抗旱栽培提供实用、有效的途径和方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够显著提高白三叶抗旱性的白三叶的栽培方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该白三叶的栽培方法，包括以下步骤：
a、选取白三叶种子，并对选取的白三叶种子进行消毒处理；
b、将经过消毒处理的白三叶种子撒入育苗盘中，并在育苗盘中加入去离子水；
c、将育苗盘放入培养箱中培养5-9天进行种子萌发，并每天更换育苗盘内的去离子水，所述培养箱内白天的温度为21-25℃，培养箱内晚上的温度为17-21℃，所述培养箱内的相对湿度为70-80％，培养箱内的光照强度为280-320μmol·m-2·s-1；
d、当种子萌发结束后，将育苗盘内的去离子水更换成霍格兰氏营养液，继续放入培养箱内培养21-25天进行育苗处理，并每隔一天更换育苗盘内的霍格兰氏营养液；
e、制备外源添加剂，所述外源添加剂包括溶剂和溶质，所述溶剂为霍格兰氏营养液，所述溶质包括壳聚糖(cts)和精胺(spm)，所述cts的浓度为0.5g/l-1.5g/l，所述spm的浓度为50.58mg/l-151.74mg/l；
f、将制备的外源添加剂施加在白三叶幼苗的根部即可。
进一步的是，在步骤a中，所述消毒处理的过程如下所述：首先，采用0.1％氯化汞对白三叶种子进行连续消毒，所述连续消毒的时间为5分钟，连续消毒后采用蒸馏水进行4次漂洗。
进一步的是，在步骤b中，所述育苗盘中铺满石英砂，育苗盘大小为长35cm、宽25cm、高10cm。
进一步的是，在步骤c中，育苗盘放入培养箱中培养的时间为7天，所述培养箱内白天的温度为23℃，培养箱内晚上的温度为19℃，所述培养箱内的相对湿度为75％，培养箱内的光照强度为300μmol·m-2·s-1。
进一步的是，在步骤d中，进行育苗处理的时间为23天。
进一步的是，在步骤e中，所述cts的浓度为1g/l，所述spm的浓度为101.17mg/l。
本发明的有益效果在于：本发明所述的白三叶的栽培方法通过对选取的白三叶种子进行消毒处理；然后将其撒入育苗盘中，并在育苗盘中加入去离子水；放入培养箱中培养5-9天进行种子萌发，当种子萌发结束后，将育苗盘内的去离子水更换成霍格兰氏营养液，继续放入培养箱内培养21-25天进行育苗处理，育苗处理结束后，白三叶长出幼苗，然后在幼苗的根部施加外源添加剂，所述外源添加剂包括溶剂和溶质，所述溶剂为霍格兰氏营养液，所述溶质包括壳聚糖(cts)和精胺(spm)，所述cts的浓度为0.5g/l-1.5g/l，所述spm的浓度为50.58mg/l-151.74mg/l；上述抗旱组合物形成的外源添加剂可以有效缓解干旱胁迫下白三叶生长受阻、叶片萎蔫，相对于单剂具有显著的增效效应，可以显著的提高白三叶的抗旱性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
该白三叶的栽培方法，包括以下步骤：
a、选取白三叶种子，并对选取的白三叶种子进行消毒处理；
b、将经过消毒处理的白三叶种子撒入育苗盘中，并在育苗盘中加入去离子水；
c、将育苗盘放入培养箱中培养5-9天进行种子萌发，并每天更换育苗盘内的去离子水，所述培养箱内白天的温度为21-25℃，培养箱内晚上的温度为17-21℃，所述培养箱内的相对湿度为70-80％，培养箱内的光照强度为280-320μmol·m-2·s-1；
d、当种子萌发结束后，将育苗盘内的去离子水更换成霍格兰氏营养液，继续放入培养箱内培养21-25天进行育苗处理，并每隔一天更换育苗盘内的霍格兰氏营养液；
e、制备外源添加剂，所述外源添加剂包括溶剂和溶质，所述溶剂为霍格兰氏营养液，所述溶质包括壳聚糖(cts)和精胺(spm)，所述cts的浓度为0.5g/l-1.5g/l，所述spm的浓度为50.58mg/l-151.74mg/l；
f、将制备的外源添加剂施加在白三叶幼苗的根部即可。
本发明所述的白三叶的栽培方法通过对选取的白三叶种子进行消毒处理；然后将其撒入育苗盘中，并在育苗盘中加入去离子水；放入培养箱中培养5-9天进行种子萌发，当种子萌发结束后，将育苗盘内的去离子水更换成霍格兰氏营养液，继续放入培养箱内培养21-25天进行育苗处理，育苗处理结束后，白三叶长出幼苗，然后在幼苗的根部施加外源添加剂，所述外源添加剂包括溶剂和溶质，所述溶剂为霍格兰氏营养液，所述溶质包括壳聚糖(cts)和精胺(spm)，所述cts的浓度为0.5g/l-1.5g/l，所述spm的浓度为50.58mg/l-151.74mg/l；上述抗旱组合物形成的外源添加剂可以有效缓解干旱胁迫下白三叶生长受阻、叶片萎蔫，相对于单剂具有显著的增效效应，可以显著的提高白三叶的抗旱性。
在上述实施方式中，为了保证白三叶种子的消毒处理效果，在步骤a中，所述消毒处理的过程如下所述：首先，采用0.1％氯化汞对白三叶种子进行连续消毒，所述连续消毒的时间为5分钟，连续消毒后采用蒸馏水进行4次漂洗。
为了保证白三叶种子的发芽率，在步骤b中，所述育苗盘中铺满石英砂。同时，为了提高白三叶种子的发芽率，在步骤c中，育苗盘放入培养箱中培养的时间为7天，所述培养箱内白天的温度为23℃，培养箱内晚上的温度为19℃，所述培养箱内的相对湿度为75％，培养箱内的光照强度为300μmol·m-2·s-1。
为了使白三叶幼苗长出健康完整的幼苗，在步骤d中，进行育苗处理的时间为23天。
为了使白三叶的抗旱性最大限度的提高，在步骤e中，所述cts的浓度为1g/l，所述spm的浓度为101.17mg/l。
对比试验1
试验材料：以干旱敏感型的‘拉丁诺’白三叶作为供试材料。
材料培育：种子经0.1％氯化汞消毒5分钟，蒸馏水漂洗4次后备用。消毒后的种子0.1g均匀地撒在长35cm、宽25cm、高10cm铺满石英砂的育苗盘中，倒入去离子水并将育苗盘置于培养箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相对湿度；300μmol·m-2·s-1的光照强度)让种子进行为期7d的萌发，每天更换去离子水。待种子萌发完成后，倒出所有的去离子水更换为霍格兰氏营养液培养，每隔一天更换一次营养液，继续培养23天(2片成熟叶片)时选取长势一致的材料用于试验。
试验设计：①cts浓度水平：设0g/l(对照)、0.50g/l、0.75g/l、1.00g/l、1.25g/l、1.50g/l、5个浓度梯度，共计6个处理，每处理4次重复。
外源添加及干旱胁迫处理：用培育材料的霍格兰氏营养液作为溶剂分别配制上述不同浓度的cts溶液，并加入20％(w/v)聚乙二醇6000(peg-6000)渗透剂模拟干旱胁迫，现配现用。在霍格兰氏营养液中加入相应浓度的cts预处理6天后，更换为含有20％(w/v)peg-6000的处理液(含相应浓度的cts)进行干旱胁迫处理。处理期间，每天更换一次处理液，每次300ml。所有材料置于智能光照培养箱中，条件同材料培育。从更换为含有20％(w/v)peg-6000的处理液时开始计时，调查白三叶叶片在中度胁迫(7天)和重度胁迫(14天)的萎蔫程度。所述萎蔫程度采用1、2、3、4、5、6、7、8、9表示，其中1表示萎蔫程度最轻，9表示萎蔫程度较重，结果见表1。
表1不同cts浓度根施预处理提高白三叶抗旱性效应
由表1可以看出，根施cts1.0g/l时，提高白三叶抗旱性的效果较好，与对照相比，在同等渗透胁迫强度下可延迟白三叶叶片萎蔫。
对比试验2
试验材料：以干旱敏感型的‘拉丁诺’白三叶作为供试材料。
材料培育：种子经0.1％氯化汞消毒5分钟，蒸馏水漂洗4次后备用。消毒后的种子0.1g均匀地撒在长35cm、宽25cm、高10cm铺满石英砂的育苗盘中，倒入去离子水并将育苗盘置于培养箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相对湿度；300μmol·m-2·s-1的光照强度)让种子进行为期7d的萌发，每天更换去离子水。待种子萌发完成后，倒出所有的去离子水更换为霍格兰氏营养液培养，每隔一天更换一次营养液，继续培养23天(2片成熟叶片)时选取长势一致的材料用于试验。
试验设计：①spm浓度水平：设0mg/l(对照)、20.23mg/l、50.58mg/l、101.17mg/l、151.74mg/l、202.34mg/l，5个浓度梯度，共计6个处理，每处理4次重复。
外源添加及干旱胁迫处理：用培育材料的霍格兰氏营养液作为溶剂分别配制上述不同浓度的spm溶液，并加入20％(w/v)聚乙二醇6000(peg-6000)渗透剂模拟干旱胁迫，现配现用。在霍格兰氏营养液中加入相应浓度的spm预处理6天后，更换为含有20％(w/v)peg-6000的处理液(含相应浓度的spm)进行干旱胁迫处理。处理期间，每天更换一次处理液，每次300ml。所有材料置于智能光照培养箱中，条件同材料培育。从更换为含有20％(w/v)peg-6000的处理液时开始计时，调查白三叶叶片在中度胁迫(7天)和重度胁迫(14天)的萎蔫程度。所述萎蔫程度采用1、2、3、4、5、6、7、8、9表示，其中1表示萎蔫程度最轻，9表示萎蔫程度较重，结果见表2。
表2不同spm浓度根施预处理提高白三叶抗旱性效应
由表2可以看出，根施spm101.17mg/l时，提高白三叶抗旱性的效果较好，与对照相比，在同等渗透胁迫强度下可延迟白三叶叶片萎蔫。
实施例
试验材料：以干旱敏感型的‘拉丁诺’白三叶作为供试材料。
材料培育：种子经0.1％氯化汞消毒5分钟，蒸馏水漂洗4次后备用。消毒后的种子0.1g均匀地撒在长35cm、宽25cm、高10cm铺满石英砂的育苗盘中，倒入去离子水并将育苗盘置于培养箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相对湿度；300μmol·m-2·s-1的光照强度)让种子进行为期7d的萌发，每天更换去离子水。待种子萌发完成后，倒出所有的去离子水更换为霍格兰氏营养液培养，每隔一天更换一次营养液，继续培养23天(2片成熟叶片)时选取长势一致的材料用于试验。
试验设计：cts设5个浓度梯度，包括0.50g/l、0.75g/l、1.00g/l、1.25g/l和1.50g/l；spm设3个浓度梯度，50.58mg/l、101.17mg/l和151.74mg/l，两两组合共15个处理组，每个处理组重复4次。
外源添加及干旱胁迫处理：用培育材料的霍格兰氏营养液作为溶剂分别配制上述不同浓度的处理组溶液，并加入20％(w/v)聚乙二醇6000(peg-6000)渗透剂模拟干旱胁迫，现配现用。在霍格兰氏营养液中加入相应浓度的处理组预处理6天后，更换为含有20％(w/v)peg-6000的处理液(含相应浓度的处理组)进行干旱胁迫处理。处理期间，每天更换一次处理液，每次300ml。所有材料置于智能光照培养箱中，条件同材料培育。从更换为含有20％(w/v)peg-6000的处理液时开始计时，调查白三叶叶片在中度胁迫(7天)和重度胁迫(14天)的萎蔫程度。所述萎蔫程度采用1、2、3、4、5、6、7、8、9表示，其中1表示萎蔫程度最轻，9表示萎蔫程度较重，结果见表3。
表3外源cts与spm不同浓度组合处理提高白三叶抗旱性效应
由表3可以看出，与对照(未经预处理)相比，不同浓度cts与spm组合处理都能在一定程度上延迟干旱胁迫下白三叶叶片萎蔫。其中，效果最好的组合是1g/lcts+101.17mg/lspm，可有效减轻白三叶萎蔫程度，其它效果较好的组合还包括1g/lcts+50.58mg/lspm，1g/lcts+151.74mg/lspm，1.25g/lcts+101.17mg/lspm，1.5g/lcts+101.17mg/lspm由此可见，cts与spm组合处理的最适浓度范围分别为1-1.5g/l与50.58-101.17mg/l。并且，结合对比试验1和对比试验2的试验数据可知，浓度范围分别为1-1.5g/l与50.58-101.17mg/l的cts与spm组合的抗旱效果显著优于单剂最优施用浓度(cts1g/l、spm101.17mg/l)的效果。结果表明，本发明提供的cts与spm组合在浓度范围分别为1-1.5g/l与50.58-101.17mg/l时具有显著的增效效应，可以显著的提高白三叶的抗旱性。
验证试验1：外源cts与spm最佳浓度组合，即1g/lcts+101.17mg/lspm，对正常条件下白三叶生理指标的影响
试验材料：以干旱敏感型的‘拉丁诺’白三叶作为供试材料。
材料培育：种子经0.1％氯化汞消毒5分钟，蒸馏水漂洗4次后备用。消毒后的种子0.1g均匀地撒在长35cm、宽25cm、高10cm铺满石英砂的育苗盘中，倒入去离子水并将育苗盘置于培养箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相对湿度；300μmol·m-2·s-1的光照强度)让种子进行为期7d的萌发，每天更换去离子水。待种子萌发完成后，倒出所有的去离子水更换为霍格兰氏营养液培养，每隔一天更换一次营养液，继续培养23天(2片成熟叶片)时选取长势一致的材料用于试验。
试验设计：试验共设4个处理：单一根施cts、spm，以及cts与spm组合，以霍格兰营养液为对照处理(control)。用霍格兰营养液溶剂分别配制1g/lcts、101.17mg/lspm以及1g/lcts+101.17mg/lspm混合溶液各300ml进行根施，现配现用，每处理4次重复。
观测指标：处理6天后取样测定如下指标，反映白三叶体内多胺情况的多胺含量以及s腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)活性；反映白三叶体内激素水平的脱落酸、细胞分裂素、赤霉素和生长素含量；抗氧化酶基因表达水平：铁超氧化物歧化酶(fesod)、愈创木酚过氧化物酶(gpox)、抗坏血酸过氧化物酶(apx)、单脱氢抗坏血酸还原酶(mdhar)、谷胱甘肽还原酶(gr)、谷胱甘肽s-转移酶(gst)；以及与生长和抗旱相关的次生代谢物类黄酮和总酚含量。结果见表4。
表4外源cts与spm组合处理对白三叶生理指标的影响
注：同行数据上标字母相同者表示差异不显著(p＞0.05)，同行数据上标字母不相同者表示差异显著(p＜0.05)。
从表4可以看出，不同处理的生理指标证明了在正常条件下1g/lcts或101.17mg/lspm单一处理能有效促进白三叶生长，且1g/lcts和101.17mg/lspm组合处理比单一处理效果更为突出。
验证试验2：外源cts与spm最佳浓度组合对干旱胁迫下白三叶生理指标的影响
试验材料：以干旱敏感型的‘拉丁诺’白三叶作为供试材料。
材料培育：种子经0.1％氯化汞消毒5分钟，蒸馏水漂洗4次后备用。消毒后的种子0.1g均匀地撒在长35cm、宽25cm、高10cm铺满石英砂的育苗盘中，倒入去离子水并将育苗盘置于培养箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相对湿度；300μmol·m-2·s-1的光照强度)让种子进行为期7d的萌发，每天更换去离子水。待种子萌发完成后，倒出所有的去离子水更换为霍格兰氏营养液培养，每隔一天更换一次营养液，继续培养23天(2片成熟叶片)时选取长势一致的材料用于试验。
试验设计：试验共设5个处理：单一根施1g/lcts、101.17mg/lspm，以及1g/lcts+101.17mg/lspm，以霍格兰营养液(control)和直接peg渗透胁迫为对照。
外源添加及干旱胁迫处理：用培育材料的营养液(hoagland全营养液)作为溶剂分别配制上述相应浓度的cts、spm、cts+spm溶液，预处理6天后，更换为含有20％(w/v)peg-6000的处理液(含相应浓度的cts及spm)进行干旱胁迫处理。处理期间，每天更换一次处理液，每次300ml。所有材料置于智能光照培养箱中，条件同材料培育。从更换为含有20％(w/v)peg-6000的处理液时开始计时，调查白三叶叶片在中度胁迫(7天)和重度胁迫(14天)的相关生理指标，每处理4次重复。
观测指标如下：反映白三叶生长及水分状况的相对含水量相对生长速率；反映白三叶体内多胺代谢情况的多胺含量以及s腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)、精氨酸脱羧酶(adc)、多胺氧化酶(pao)和二胺氧化酶(dao)活性；反映白三叶体内激素水平的脱落酸、细胞分裂素、赤霉素和生长素含量；抗氧化酶基因表达水平：铁超氧化物歧化酶(fesod)、锰超氧化物歧化酶(mnsod)、愈创木酚过氧化物酶(gpox)、抗坏血酸过氧化物酶(apx)、单脱氢抗坏血酸还原酶(mdhar)、脱氢抗坏血酸还原酶(dhar)、谷胱甘肽还原酶(gr)、谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)、谷胱甘肽s-转移酶(gst)；与生长和抗旱相关的次生代谢物类黄酮和总酚含量。以及活性氧和膜稳定性相关指标超氧阴离子、过氧化氢、丙二醛含量、相对电导率。结果见表5、6。
表5外源cts与spm组合处理对白三叶抗旱生理指标的影响(7天)
注：同行数据上标字母相同者表示差异不显著(p＞0.05)，同行数据上标字母不相同者表示差异显著(p＜0.05)。
表6外源cts与spm组合处理对白三叶抗旱生理指标的影响(14天)
注：同行数据上标字母相同者表示差异不显著(p＞0.05)，同行数据上标字母不相同者表示差异显著(p＜0.05)。
从表5和6可以看出，不同处理的生理指标证明了1g/lcts或101.17mg/lspm单一处理能有效提高白三叶抗旱性，且1g/lcts和101.17mg/lspm组合处理比单一处理效果更能有效缓解干旱胁迫。
验证试验3：外源添加剂施用时间对施用效果的影响
试验材料：以干旱敏感型的‘拉丁诺’白三叶作为供试材料。
材料培育：种子经0.1％氯化汞消毒5分钟，蒸馏水漂洗4次后备用。消毒后的种子0.1g均匀地撒在长35cm、宽25cm、高10cm铺满石英砂的育苗盘中，倒入去离子水并将育苗盘置于培养箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相对湿度；300μmol·m-2·s-1的光照强度)让种子进行为期7d的萌发，每天更换去离子水。待种子萌发完成后，倒出所有的去离子水更换为霍格兰氏营养液培养，每隔一天更换一次营养液，继续培养23天(2片成熟叶片)时选取长势一致的材料用于试验。
试验设计及处理：设上午8:00、上午10:00、下午15:00、傍晚18:00，共计4个时间根施处理(1g/lcts+101.17mg/lspm)，每处理4次重复。
外源添加及干旱胁迫处理：同实例1，结果见表7。
表7外源cts与spm组合处理不同施用时间提高白三叶抗旱性效应
由表7可知，不同根施时间对cts与spm组合提高白三叶抗旱性效应无明显影响。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可以利用上述的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的变动和修饰，均属于本发明技术方案保护的范围内。