一种太阳光条件下金花茶嫩枝培育组培苗的方法与流程

本发明涉及植物无性快繁
技术领域：
，尤其是涉及一种太阳光条件下金花茶嫩枝培育组培苗的方法。
背景技术：
：金花茶（camellianittidissimachi），属山茶科山茶属，是山茶花家族中唯一具有金黄色花瓣的种类，是我国特有的传统名花。也是国家8种一级重点保护植物之一，在国内外都享有盛名。国内将金花茶誉为“茶族皇后”、“植物界的大熊猫”，国外则称之为“幻想中的黄色山茶”、“神奇的东方魔茶”。金花茶不仅观赏价值高，还是名贵药材，其药用价值也得到社会的广泛认可。金花茶含有d然有机锗、锌、硒、矾等多种对人体有重要保健作用的微量元素，以及茶多酚和人体所必需的氨基酸、维生素等，在降低血糖、血脂，防癌、抗癌方面有特殊功效。目前，市场上的金花茶产品倍受群众青睐，而金花茶主产区广西只能满足其销售量的1/10。由此可见金花茶市场前景十分广阔。随着金花茶药用价值被社会广泛认可，产品畅销，价格昂贵，资源紧俏，金花茶种植产业犹如雨后春笋快速地发展。为了尽快将金花茶资源应用于社会，专业学者们开展了金花茶组织培养技术的研究，相关论文的报道有：颜慕勤等从1980年起陆续对七种具有重瓣，大花，芳香等特性的金花茶种进行组织培养研究，在1981年获完整植株并已移栽成活；1987年廖汉刃等已开展金花茶嫩茎的组织培养，生根率为75%，且移栽成活，将无根苗剪下嫁接到普通油茶或越南油茶的芽苗砧木上，成活率为78%；黄晓娜等就金花茶瓶内生根困难进行了组培苗试管外生根研究，生根效果可达到85%。国家授权的相关专利有：①一种金花茶组培快繁方法（zl20140755440.8），以7至8月份金花茶叶片为外植体，诱导叶片产生愈伤组织，将愈伤组织接种于芽诱导培养基内，置于温度25～28℃，光暗培养条件培养35～40d，愈伤组织分化出芽；将芽接种于生根培养基内，置于温度25～28℃，光暗培养条件培养20～30d，培养出组培幼苗；芽诱导的培养基配方为：ms+6～8g/l琼脂+25～29g/l蔗糖+0.3～0.8mg/l6-ba+0.8～1.5mg/lnaa，生根培养基ms+6～8g/l琼脂+25～29g/l蔗糖+0.8～2.5mg/liaa+0.5～1.5mg/lnaa+0.8～1.5mg/l活性炭（wc）+0.8～1.5mg/l硫酸亚铁。②一种金花茶组培繁殖方法（zl201410581398.2）以金花茶成熟种胚为外植体，5%～10%nacl2溶液消毒灭菌20～30min接种于初代配培养基中获取无菌芽，无菌芽在增殖培养基和壮芽培养基中重复培养，培养周期5～6周；剪切壮芽并将壮芽基部浸于500～1000mg/liba中10～20min再转接到生根培养基内培养，生根率95%～98%，苗木移栽成活率90%以上；初代培养基为ms+6g/l琼脂+30g/l蔗糖+0.2～0.5mg/l6-ba+0.2～0.5mg/lnaa，增殖培养基为ms+6g/l琼脂+40g/l蔗糖+1.5～2.0mg/l6-ba+1.5～2.0mg/lkt；壮芽培养基为ms+6g/l琼脂+40g%蔗糖+0.5～1.0mg/liaa，采用白炽灯进行光照培养，光照16h，暗培养8h，光照强度2000～3000lx，温度25±3℃～28℃。③金花茶组织培养基（zl85102805）改良er；nh4no31200mg/l，kno31800mg/l，caci2200mg/l，kh2po4400mg/l，h3bo31mg/l，mnso4·h2o0.5mg/l，znso4·7h2o1mg/l，nam0o4·h2o1mg/l，cuso4·5h2o0.1mg/l，feso4+na2edta【27.8+37.3(络合物5ml)】，烟酸10mg/l，甘氨酸2.0mg/l，肌醇5mg/l，盐酸吡哆醇1mg/l，盐酸硫铵4mg/l，琼脂6g/l，蔗糖30g/l，6-ba1～5mg/l，iaa1～3mg/l。以上报道主要采用白炽灯提供光照条件，然而白炽灯光谱仅红光、绿光和蓝光光谱比较强，对植物生长的作用远弱于太阳光。太阳光光谱丰富，有7种可见光（赤橙红绿青蓝紫）和2种不可见光（紫外线和红外线）。太阳光中的蓝紫光与青光对植物生长及幼芽的形成有很大的作用，抑制植物节间的伸长，促进芽的分化。蓝光也是支配细胞分化最重要的光谱，同时影响植物的向光性。蓝紫光有利于蛋白质和有机酸的合成，有助于花色素和维生素的合成。红光和红外线光有利于碳水化合物的合成，促进种子的萌发和茎的伸长，促进二氧化碳的分解和叶绿素的形成。因此，通过调节太阳光的光照强度，有助于提高金花茶组培苗光合作用和促进组培苗的生长。然而目前未见有关于利用太阳光对金花茶组培苗进行工厂化育苗的文献和专利。技术实现要素：本发明目的是克服现有技术中使用白炽灯进行金花茶组培苗培育的不足，提供一种太阳光条件下金花茶嫩枝培育组培苗的方法，使金花茶的组培苗培育不受地域和气候的限制，既能保持金花茶优良性状的遗传稳定性，又节约能源、节约成本，利于产业化快速培育金花茶优良组培苗。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种太阳光条件下金花茶嫩枝培育组培苗的方法，包括以下步骤：（1）外植体消毒和芽初代培养：在连续3d以上晴朗的天气，采回长势优良的当年生金花茶半木质化或刚木质化的嫩枝，剪去叶片，留0.5～1cm长的叶柄，用5‰的洗衣粉水刷洗嫩枝2min，将嫩枝剪切成含有一个以上腋芽的2~3cm茎段，将半木质化的茎段和刚木质化的茎段分别装入不同的容器中，自来水冲洗2～3次，置于超净工作台上，75%酒精溶液消毒30s，无菌水洗3次，然后置于质量分数1‰hgcl2溶液中，半木质化的茎段浸泡6min，刚木质化的茎段浸泡8min，无菌水清洗5次～6次，剪去茎段上的叶柄，将半木质化的茎段和刚木质化的茎段分别接种于初代培养基中，置于300～800lx的太阳光照条件下进行培养7～10d，之后移置于1000～2500lx的太阳光照条件下继续培养30~33d，始芽萌发率≥95%，芽高1.5~2cm；（2）芽继代增殖培养：将单芽或5～8颗芽为一丛的丛芽剪切，转接到增殖培养基中培养，置于1500～4000lx的太阳光照条件下培养10～15d，再置于4000～8000lx的太阳光照条件下继续进行芽继代增殖培养20~25d，芽增殖系数8～12；（3）芽生根培养：将继代增殖芽中高3～5cm，叶片翠绿，叶面光亮，带革质，有叶片3～5张的单芽剪切，直插于生根培养基中，置于2000～8000lx太阳光照条件下培养15～40d，当根系长0.5～1cm时，移至接近自然环境的炼苗棚内炼苗，生根率90~95%；（4）苗木移栽：瓶苗在炼苗棚内炼苗20～30d，苗木根系由白色变为灰白色时进行移栽，苗木移栽时，先打开瓶盖，取出生根苗，清洗干净粘附于根系上的生根培养基，移栽于经过基质消毒的营养杯内，置于温度15～28℃，湿度70～85%，遮荫度70～80%，阴凉的环境条件下培养，经苗期施肥管护，苗木高≥30cm，地径≥0.3cm时可以出圃或上大杯培养大苗。进一步优选的，所述芽继代增殖培养中，将单芽或5～8颗芽为一丛的丛芽剪切，转接到继代增殖培养基中培养，置于2500～4000lx的太阳光照条件下培养10～15d，再置于4000～8000lx的太阳光照条件下继续培养20~25d，芽增殖系数8～12。进一步优选的，所述芽生根培养中，将继代增殖芽中高3～5cm，叶片翠绿，叶面光亮，带革质，有叶片3～5张的单芽剪切，直插于生根培养基中，置于4000～8000lx太阳光照条件下培养15～40d，当根系长0.5～1cm时，移至接近自然环境的炼苗棚内炼苗，生根率90~95%。进一步优选的，所述初代培养基的配方为：ms+50mg/lna2so4+2mg/l6-苄氨基腺嘌呤+0.5mg/l萘乙酸+10mg/l维生素c+600mg/l水解酪蛋白+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8。进一步优选的，所述继代增殖培养基的配方为：ms+50mg/lna2so4+3mg/l6-苄氨基腺嘌呤+1mg/l萘乙酸+15mg/l维生素c+15～20mg/l谷氨酰氨+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8。进一步优选的，所述生根培养基的配方为：2/3(ms+50mg/lna2so4)+3mg/l吲哚丁酸+5mg/l吲哚乙酸+0.3mg/l萘乙酸+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，或2/3（ms+50mg/lna2so4－1650mg/lnh4no3+100mg/lca(no3)2·4h2o）+3mg/l吲哚丁酸+5mg/l吲哚乙酸+0.3mg/l萘乙酸+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8。在ms培养基中增加适当浓度的na+可以调节植物细胞的渗透势，促进细胞分裂，提高叶片的光合作用，促进苗木健壮生长，在生根培养中，将ms培养基去除nh4no3增加100mg/lca(no3)2·4h2o，可以解决培养基中n含量偏低，生根芽生长过程中缺n现象，避免叶片黄化，影响芽的生根率。进一步优选的，所述芽初代培养、芽继代增殖培养和芽生根培养均在墙体80%为双层玻璃窗的培养室内进行。进一步优选的，所述培养室的光照时间为11～14h/d，温度为22~28℃。本发明具备以下的优点和积极效果：（1）本发明采用的光源来自太阳光，通过对光照强度和光照时间调节，充分发挥太阳光对金花茶组培苗生长的促进作用，金花茶组培苗生根率高达90%～95%，比使用白炽灯作为光源的方法生根率提高20%以上，同一生根培养基，太阳光条件下芽长根点的平均时间为20～25d，白炽灯下芽长根点平均时间为30~35d，前者比后者芽长根点时间缩短5～10d。（2）本发明培育的金花茶组培苗增殖系数8～12，移栽成活率95%以上，达到了产业化生产金花茶苗木的要求。（3）本发明的外植体来源于具有生长优势的植株，枝叶茂盛，花多（2500朵/a.株以上），产花大小年不明显，采用“以芽繁芽”的组培方法，培育的组培苗遗传稳定性好，能保持母树优良的性状。（4）本发明所用基本培养基为ms培养基，在培养基中添加低浓度的na2so4,na+能够调节植物细胞的渗透势，促进细胞分裂，提高叶片的光合作用，促进苗木健壮生长，在初代和增殖中培养基中添加适量浓度的水解酪蛋白，能促进酶活性，对细胞和组织的增殖和分化有明显促进作用。（5）本发明工艺简单，可操作性强，使用太阳光作为光源，降低了电力成本。附图说明图1：培养室；图2：培养室太阳光光谱图；图3：白炽灯光谱图；图4：继代增殖芽形态对比图，图左为实施例1培育的继代增殖芽，图右为对比例1培育的继代增殖芽：图5：生根苗根系形态对比图，图左为实施例1培育的生根苗，图右为对比例1培育的生根苗；图6：生根苗生产图。具体实施方式以下结合实例描述本发明一种太阳光条件下金花茶嫩枝培育组培苗的方法，这些描述并不是对本
发明内容的限定。实施例1一种太阳光条件下金花茶嫩枝培育组培苗的方法，包括以下步骤：（1）外植体消毒和芽初代培养：在连续3d以上晴朗的天气，从广西南宁树木园金花茶资源圃采回长势优良的当年生金花茶半木质化或刚木质化的嫩枝，剪去叶片，留1cm长的叶柄，用5‰的洗衣粉水刷洗嫩枝2min，嫩枝剪切成含有一个以上腋芽的3cm茎段，将半木质化的茎段和刚木质化的茎段分别装入不同的容器中，自来水冲洗3次，置于超净工作台上，75%酒精溶液消毒30s，无菌水洗3次，然后置于质量分数1‰hgcl2溶液中，半木质化的茎段浸泡6min，刚木质化的茎段浸泡8min，无菌水清洗5次，剪去叶柄，将半木质化的茎段和刚木质化的茎段分别接种于初代培养基中，初代培养基的配方为ms+50mg/lna2so4+2mg/l6-苄氨基腺嘌呤+0.5mg/l萘乙酸+10mg/l维生素c+600mg/l水解酪蛋白+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于墙体80%为双层玻璃窗的培养室内（图1），培养室内光照时间11～14h/d，温度22~28℃，300～800lx的太阳光照条件下进行初代培养8d，之后移置于1000～2500lx的太阳光照条件下培养30d，始芽萌发率≥95%，一般情况下，培养15～20d腋芽萌出，待萌芽高1.5～2cm时，将芽接种于增殖培养基诱导丛生芽；（2）芽继代增殖培养：将单芽或5～8颗芽为一丛的丛芽剪切，转接到增殖培养基中培养，继代增殖培养基的配方为：ms+50mg/lna2so4+3mg/l6-苄氨基腺嘌呤+1mg/l萘乙酸+15mg/l维生素c+20mg/l谷氨酰氨+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于2500～4000lx的太阳光照条件下进行芽继代增殖培养10d，置于4000～8000lx的太阳光照条件下继续培养，光照时间11～14h/d，温度22~28℃：继代增殖培养第35d，继代增殖芽高3～5cm，翠绿，茎干半木质化，叶片2/3展开，增殖系数12；继代增殖培养第40d，继代增殖芽高3～6cm，翠绿，茎干木质化，叶片2/3展开，带革质，叶面光亮，增殖系数12；继代增殖培养第50d，继代增殖芽高3～6cm，翠绿，茎干木质化较强，叶片2/3展开，较大，叶面光亮，革质，增殖系数12；（3）芽生根培养：分别取培养35d、40d和50d的继代增殖芽中芽高3～6cm，叶片翠绿，叶面光亮，带革质，有叶片3～5张的单芽剪切，直插式插于生根培养基中，生根培养基的配方为2/3(ms+50mg/lna2so4)+3mg/l吲哚丁酸+5mg/l吲哚乙酸+0.3mg/l萘乙酸+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于4000～8000lx太阳光照条件下进行芽生根培养15～40d，光照时间11～14h/d，温度22~28℃，培养35d的继代增殖芽在生根培养的第16d长出根点，第25d根系长0.5~1.0cm，平均生根率96.7%；培养40d的继代增殖芽在生根培养的第15d长出根点，第24d根系长0.5~1.0cm，平均生根率98.3%；培养50d的继代增殖芽在生根培养的第30d长出根点，第45d根系长0.5~1.0cm，平均生根率83.3%；（4）苗木移栽：将根系长0.5～1cm的瓶苗移至炼苗棚内炼苗20d，苗木根系由白色变为灰白色时进行移栽，苗木移栽时，先打开瓶盖，取出生根苗，清洗干净粘附于根系上的生根培养基，移栽于经过基质消毒的营养杯内，置于温度15～28℃，湿度70～85%，遮荫度70～80%，阴凉的环境条件下培养，经苗期施肥管护，苗木高≥30cm，地径≥0.3cm时可以出圃或上大杯培养大苗，平均移栽成活率99.6%。实施例2一种太阳光条件下金花茶嫩枝培育组培苗的方法，包括以下步骤：（1）外植体消毒和芽初代培养：在连续3d以上晴朗的天气，从广西南宁树木园金花茶资源圃采回长势优良的当年生金花茶半木质化或刚木质化的嫩枝，剪去叶片，留0.5cm长的叶柄，用5‰的洗衣粉水刷洗嫩枝2min，将嫩枝剪切成含有一个以上腋芽的2cm茎段，将半木质化的茎段和刚木质化的茎段分别装入不同的容器中，自来水冲洗3次，置于超净工作台上，75%酒精溶液消毒30s，无菌水洗3次，然后置于质量分数1‰hgcl2溶液中，半木质化的茎段浸泡6min，刚木质化的茎段浸泡8min，无菌水清洗6次，剪去叶柄，将半木质化的茎段和刚木质化的茎段分别接种于初代培养基中，初代培养基的配方为ms+50mg/lna2so4+2mg/l6-苄氨基腺嘌呤+0.5mg/l萘乙酸+10mg/l维生素c+600mg/l水解酪蛋白+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于墙体80%为双层玻璃窗的培养室内（图1），培养室内光照时间11～14h/d，温度22~28℃，300～800lx的太阳光照条件下进行初代培养7d，之后移置于1000～2500lx的太阳光照条件下培养30d，始芽萌发率≥95%，一般情况下，培养15～20d腋芽萌出，待萌芽高1.5～2cm时，将芽接种于增殖培养基诱导丛生芽；（2）芽继代增殖培养：将单芽或5～8颗芽为一丛的丛芽剪切，转接到增殖培养基中，继代增殖培养基的配方为：ms+50mg/lna2so4+3mg/l6-苄氨基腺嘌呤+1mg/l萘乙酸+15mg/l维生素c+18mg/l谷氨酰氨+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于1500～3000lx的太阳光照条件下进行芽继代增殖培养10d，之后置于4000～6000lx的太阳光照条件下继续培养，光照时间11～14h/d，温度22~28℃：继代增殖培养第35d，芽高2～4cm，翠绿，茎干半木质化，叶片1/2展开，增殖系数10；继代增殖培养第40d，芽高3～4cm，翠绿，茎干刚木质化，叶片2/3展开，带革质，叶面光亮，增殖系数11；继代增殖培养第50d，芽高3～5cm，翠绿，茎干木质化，叶片2/3展开，叶面光亮，革质，增殖系数11；（3）芽生根培养：分别取培养35d、40d和50d的继代增殖芽中芽高3～5cm，叶片翠绿，叶面光亮，带革质，有叶片3～5张的单芽剪切，直插式插于生根培养基中，生根培养基的配方为2/3(ms+50mg/lna2so4)+3mg/l吲哚丁酸+5mg/l吲哚乙酸+0.3mg/l萘乙酸+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于3000～6000lx太阳光照条件下进行芽生根培养，光照时间11～14h/d，温度22~28℃，培养35d的继代芽在生根培养的第20d长出根点，第30d根系长0.5~1.0cm，平均生根率93.3%；培养40d的继代芽在生根培养的第17d长出根点，第26d根系长0.5~1.0cm，平均生根率94.8%；培养50d的继代芽在生根培养的第30d长出根点，第45d根系长0.5~1.0cm，平均生根率85.3%；（4）苗木移栽：将根系长0.5～1cm的瓶苗移至炼苗棚内炼苗24d，苗木根系由白色变为灰白色时进行移栽，苗木移栽时，先打开瓶盖，取出生根苗，清洗干净粘附于根系上的生根培养基，移栽于经过基质消毒的营养杯内，置于温度15～28℃，湿度70～85%，遮荫度70～80%，阴凉的环境条件下培养，经苗期施肥管护，苗木高≥30cm，地径≥0.3cm时可以出圃或上大杯培养大苗，平均移栽成活率98.5%。实施例3一种太阳光条件下金花茶嫩枝培育组培苗的方法，包括以下步骤：（1）外植体消毒和芽初代培养：在连续3d以上晴朗的天气，从广西南宁树木园金花茶资源圃采回长势优良的当年生金花茶半木质化或刚木质化的嫩枝，剪去叶片，留0.5cm长的叶柄，用5‰的洗衣粉水刷洗嫩枝2min，将嫩枝剪切成含有一个以上腋芽的2.5cm茎段，将半木质化的茎段和刚木质化的茎段分别装入不同的容器中，自来水冲洗3次，置于超净工作台上，75%酒精溶液消毒30s，无菌水洗3次，然后置于质量分数1‰hgcl2溶液中，半木质化的茎段浸泡6min，刚木质化的茎段浸泡8min，无菌水清洗5次，剪去叶柄，将半木质化的茎段和刚木质化的茎段分别接种于初代培养基中，初代培养基的配方为ms+50mg/lna2so4+2mg/l6-苄氨基腺嘌呤+0.5mg/l萘乙酸+10mg/l维生素c+600mg/l水解酪蛋白+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于墙体80%为双层玻璃窗的培养室内（图1），培养室内光照时间11～14h/d，温度22~28℃，300～800lx的太阳光照条件下进行初代培养8d，之后移置于1000～2500lx的太阳光照条件下培养32d，始芽萌发率≥95%，一般情况下，培养15～20d腋芽萌出，待萌芽高1.5～2cm时，将芽接种于增殖培养基诱导丛生芽；（2）芽继代增殖培养：将单芽或5～8颗芽为一丛的丛芽剪切，转接到继代增殖培养基中，继代增殖培养基的配方为：ms+50mg/lna2so4+3mg/l6-苄氨基腺嘌呤+1mg/l萘乙酸+15mg/l维生素c+15～20mg/l谷氨酰氨+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于1500～2500lx的太阳光照条件下进行芽继代增殖培养10d，之后置于4000～5000lx的太阳光照条件下继续进行芽继代增殖培养，光照时间11～14h/d，温度22~28℃：继代增殖培养第35d，芽高2～4cm，翠绿，茎干半木质化，叶片1/2展开，增殖系数8.0；继代增殖培养第40d，芽高3～4cm，翠绿，茎干刚木质化，叶片2/3展开，带革质，叶面光亮，增殖系数9；继代增殖培养第50d，芽高3～5cm，翠绿，茎干木质化，叶片2/3展开，叶面光亮，革质，增殖系数9.5；（3）芽生根培养：分别取培养35d、40d和50d的继代增殖芽中芽高3～5cm，叶片翠绿，叶面光亮，带革质，有叶片3～5张的单芽剪切，直插式插于生根培养基中，生根培养基的配方为2/3(ms+50mg/lna2so4)+3mg/l吲哚丁酸+5mg/l吲哚乙酸+0.3mg/l萘乙酸+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于2000～5000lx太阳光照条件下进行芽生根培养，光照时间11～14h/d，温度22~28℃，培养35d的继代增殖芽在生根培养的第25d长出根点，第35d根系长0.5~1.0cm，平均生根率90.1%；培养40d的继代增殖芽在生根培养的第20d长出根点，第30d根系长0.5~1.0cm，平均生根率91.3%；培养50d的继代增殖芽在生根培养的第25d长出根点，第40d根系长0.5~1.0cm，平均生根率86.3%；（4）苗木移栽：将根系长0.5～1cm的瓶苗移至炼苗棚内炼苗26d，苗木根系由白色变为灰白色时进行移栽，苗木移栽时，先打开瓶盖，取出生根苗，清洗干净粘附于根系上的生根培养基，移栽于经过基质消毒的营养杯内，置于温度15～28℃，湿度70～85%，遮荫度70～80%，阴凉的环境条件下培养，经苗期施肥管护，苗木高≥30cm，地径≥0.3cm时可以出圃或上大杯培养大苗，平均移栽成活率96.3%。实施例4一种太阳光条件下金花茶嫩枝培育组培苗的方法，包括以下步骤：（1）外植体消毒和芽初代培养：在连续3d以上晴朗的天气，从广西南宁树木园金花茶资源圃采回长势优良的当年生金花茶半木质化或刚木质化的嫩枝，剪去叶片，留1cm长的叶柄，用5‰的洗衣粉水刷洗嫩枝2min，将嫩枝剪切成含有一个以上腋芽的2cm茎段，将半木质化的茎段和刚木质化的茎段分别装入不同的容器中，自来水冲洗3次，置于超净工作台上，75%酒精溶液消毒30s，无菌水洗3次，然后置于质量分数1‰hgcl2溶液中，半木质化的茎段浸泡6min，刚木质化的茎段浸泡8min，无菌水清洗5次，剪去的叶柄，将半木质化的茎段和刚木质化的茎段分别接种于初代培养基中，初代培养基的配方为ms+50mg/lna2so4+2mg/l6-苄氨基腺嘌呤+0.5mg/l萘乙酸+10mg/l维生素c+600mg/l水解酪蛋白+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于墙体80%为双层玻璃窗的培养室内（图1），培养室内光照时间11～14h/d，温度22~28℃，300～800lx的太阳光照条件下进行初代培养10d，之后移置于1000～2500lx的太阳光照条件下培养33d，始芽萌发率≥95%，一般情况下，培养15～20d腋芽萌出，待萌芽高1.5～2cm时，将芽接种于增殖培养基诱导丛生芽；（2）芽继代增殖培养：将单芽或5～8颗芽为一丛的丛芽剪切，将单芽或丛芽转接到继代培养基中，继代培养基的配方为：ms+50mg/lna2so4+3mg/l6-苄氨基腺嘌呤+1mg/l萘乙酸+15mg/l维生素c+15～20mg/l谷氨酰氨+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于2500～4000lx的太阳光照条件下进行芽继代增殖培养10d，之后置于4000～8000lx的太阳光照条件下继续进行芽继代增殖培养，光照时间11～14h/d，温度22~28℃：继代增殖培养第35d，芽高3～6cm，红绿色，茎干较脆，叶片1/2展开，增殖系数9.0；继代增殖培养第40d，芽高3.5～6cm，翠绿，茎干半木质化，叶片2/3展开，带革质，叶面光亮，增殖系数10；继代增殖培养第50d，芽高4～6cm，翠绿，茎干木质化，叶片2/3展开，叶面光亮，革质，增殖系数10；（3）芽生根培养：分别取培养35d、40d和50d的继代增殖芽中芽高3～6cm，叶片翠绿，叶面光亮，带革质，有叶片3～5张的单芽剪切，直插式插于生根培养基中，生根培养基的配方为2/3（ms－1650mg/lnh4no3+100mg/lca(no3)2·4h2o）+3mg/l吲哚丁酸+5mg/l吲哚乙酸+0.3mg/l萘乙酸+4.5g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于4000～8000lx太阳光照条件下进行芽生根培养，光照时间11～14h/d，温度22~28℃，培养35d的继代增殖芽在生根培养的第21d长出根点，第29d根系长0.5~1.0cm，平均生根率91.3%；培养40d的继代增殖芽在生根培养的第18d长出根点，第30d根系长0.5~1.0cm，平均生根率92.6%；培养50d的继代增殖芽在生根培养的第25d长出根点，第43d根系长0.5~1.0cm，平均生根率85.3%；（4）苗木移栽：将根系长0.5～1cm的瓶苗移至炼苗棚内炼苗28d，苗木根系由白色变为灰白色时进行移栽，苗木移栽时，先打开瓶盖，取出生根苗，清洗干净粘附于根系上的生根培养基，移栽于经过基质消毒的营养杯内，置于温度15～28℃，湿度70～85%，遮荫度70～80%，阴凉的环境条件下培养，经苗期施肥管护，苗木高≥30cm，地径≥0.3cm时可以出圃或上大杯培养大苗，平均移栽成活率94.6%。对比例1对比例1与实施例1的区别在于，对比例1采用的光源为白炽灯，太阳光和白炽灯光谱如图2、图3所示，对比例1在芽初代培养、继代增殖培养、生根培养每个步骤中，都采用接种后8d置于300～800lx的太阳光照条件下培养，之后置于2500lx白炽灯光培养。对比例1所用的外植体处理方法、初代培养基、继代培养基、生根培养基以及培养室温度环境与实例1同；在芽初代培养中，培养15～20d腋芽萌出，芽较弱，待萌芽高1.5～2cm时，将芽接种于增殖培养基诱导丛生芽，始芽萌发率90.1%；在芽继代增殖培养中，继代增殖培养第35d，继代增殖芽高2～3cm，红绿色，茎干较脆，叶片1/3展开，叶面暗淡，增殖系数2.5；继代增殖培养第40d，继代增殖芽高2.5～4cm，绿棕色，茎干较脆，叶片1/3展开，增殖系数3.0；继代增殖培养第50d，继代增殖芽高3～5cm，绿棕色，茎干半木质化，叶片1/2展开，叶面有光泽，增殖系数3.5；在芽生根培养中，培养35d的继代增殖芽在生根培养的第35d长出根点，第55d根系长0.5~1.0cm，平均生根率33.1%；培养40d的继代增殖芽在生根培养的第30d长出根点，第50d根系长0.5~1.0cm，平均生根率38.5%；培养50d的继代增殖芽在生根培养的第25d长出根点，第45d根系长0.5~1.0cm，平均生根率62.0%，移栽后的平均成活率为52.7%。对比例2对比例2与实施例2的区别在于，对比例2采用的光源为白炽灯，太阳光和白炽灯光谱如图2、图3所示，对比例2在芽初代培养、芽继代增殖培养、芽生根培养每个步骤中，都采用接种后7d置于300～800lx的太阳光照条件下培养，之后置于2500lx白炽灯光培养；对比例2所用的外植体处理方法、初代培养基、继代培养基、生根培养基以及培养室温度环境与实例2一致；在芽初代培养中，培养15～20d腋芽萌出，芽较弱，待萌芽高1.5～2cm时，将芽接种于增殖培养基诱导丛生芽，始芽萌发率90.3%；在芽继代增殖培养中，继代增殖培养第35d，继代增殖芽高2～4cm，红紫色，茎干较脆，叶片1/3展开，叶面暗淡，增殖系数2.6；继代增殖培养第40d，继代增殖芽高2.5～4cm，绿棕色，茎干较脆，叶片1/3展开，增殖系数3.0；继代增殖培养第50d，继代增殖芽高3～5cm，绿棕色，茎干半木质化，叶片1/2展开，叶面有光泽，增殖系数3.3；在芽生根培养中，培养35d的继代增殖芽在生根培养的第35d长出根点，第55d根系长0.5~1.0cm，平均生根率32.2%；培养40d的继代增殖芽在生根培养的第30d长出根点，第50d根系长0.5~1.0cm，平均生根率33.6%；培养50d的继代增殖芽在生根培养的第25d长出根点，第45d根系长0.5~1.0cm，平均生根率61.8%，移栽后的平均成活率为52.4%。对比例3对比例3与实施例3的区别在于，对比例3采用的光源为白炽灯，太阳光和白炽灯光谱如图2、图3所示，对比例3在芽初代培养、芽继代增殖培养、芽生根培养每个步骤中，都采用接种后8d置于300～800lx的太阳光照条件下培养，之后置于2500lx白炽灯光培养。对比例3所用的外植体处理方法、初代培养基、继代培养基、生根培养基以及培养室温度环境与实例3一致；在芽初代培养中，培养15～20d腋芽萌出，芽较弱，待萌芽高1.5～2cm时，将芽接种于增殖培养基诱导丛生芽，始芽萌发率91.2%；在芽继代增殖培养中，继代增殖培养第35d，继代增殖芽高2～4cm，红紫色，茎干较脆，叶片1/3展开，叶面暗淡，增殖系数2.5；继代增殖培养第40d，继代增殖芽高2.5～4cm，绿棕色，茎干较脆，叶片1/3展开，增殖系数2.8；继代增殖培养第50d，继代增殖芽高3～5cm，绿棕色，茎干半木质化，叶片1/2展开，叶面有光泽，增殖系数3.2；在芽生根培养中，培养35d的继代增殖芽在生根培养的第35d长出根点，第55d根系长0.5~1.0cm，平均生根率30.6%；培养40d的继代增殖芽在生根培养的第30d长出根点，第50d根系长0.5~1.0cm，平均生根率35.8%；培养50d的继代增殖芽在生根培养的第25d长出根点，第45d根系长0.5~1.0cm，平均生根率60.2%，移栽后的平均成活率为51.8%。对比例4对比例4与实施例4的区别在于，对比例4采用的光源为白炽灯，太阳光和白炽灯光谱如图2、图3所示，对比例4在芽初代培养、芽继代增殖培养、芽生根培养每个步骤中，都采用接种后10d置于300～800lx的太阳光照条件下培养，之后置于2500lx白炽灯光培养。对比例4所用的外植体处理方法、初代培养基、继代培养基、生根培养基以及培养室温度环境与实例4一致；在芽初代培养中，培养15～20d腋芽萌出，芽较弱，待萌芽高1.5～2cm时，将芽接种于增殖培养基诱导丛生芽，始芽萌发率90.5%；在芽继代增殖培养中，继代增殖培养第35d，继代增殖芽高2～4cm，红紫色，茎干较脆，叶片1/3展开，叶面暗淡，增殖系数2.5；继代增殖培养第40d，继代增殖芽高2.5～4cm，绿棕色，茎干较脆，叶片1/3展开，增殖系数2.8；继代增殖培养第50d，继代增殖芽高3～5cm，绿棕色，茎干半木质化，叶片1/2展开，叶面有光泽，增殖系数3.0；在芽生根培养中，培养35d的继代增殖芽在生根培养的第38d长出根点，第60d根系长0.5~1.0cm，平均生根率29.5%；培养40d的继代增殖芽在生根培养的第35d长出根点，第65d根系长0.5~1.0cm，平均生根率32.8%；培养50d的继代增殖芽在生根培养的第32d长出根点，第46d根系长0.5~1.0cm，平均生根率55.2%，移栽后的平均成活率为45.4%。由以上实施例和对比例看出，芽继代增殖培养40d的组培苗各项生理指标最优，实际生产也采用芽继代增殖培养40d的工艺，以下就实施例和对比例的芽继代增殖培养40d得到的技术效果进行比较，如图4、图5和表1所示：表1实施例与对比例芽继代增殖培养40d的技术效果对比芽继代增殖培养40d芽生根培养至根系长0.5-1cm移栽成活率实施例1继代增殖芽高3～6cm，翠绿，茎干木质化，叶片2/3展开，带革质，叶面光亮，增殖系数12第15d长出根点，第24d根系长0.5~1.0cm，平均生根率98.3%99.6%对比例1继代增殖芽高2.5～4cm，绿棕色，茎干较脆，叶片1/3展开，增殖系数3.0第30d长出根点，第50d根系长0.5~1.0cm，平均生根率38.5%52.7%实施例2继代增殖芽高3～4cm，翠绿，茎干刚木质化，叶片2/3展开，带革质，叶面光亮，增殖系数11第17d长出根点，第26d根系长0.5~1.0cm，平均生根率94.8%98.5%对比例2继代增殖芽高2.5～4cm，绿棕色，茎干较脆，叶片1/3展开，增殖系数3.0第30d长出根点，第50d根系长0.5~1.0cm，平均生根率33.6%52.4%实施例3继代增殖芽高3～4cm，翠绿，茎干刚木质化，叶片2/3展开，带革质，叶面光亮，增殖系数9第20d长出根点，第30d根系长0.5~1.0cm，平均生根率91.3%96.3%对比例3继代增殖芽高2.5～4cm，绿棕色，茎干较脆，叶片1/3展开，增殖系数2.8第30d长出根点，第50d根系长0.5~1.0cm，平均生根率35.8%51.8%实施例4继代增殖芽高3.5～6cm，翠绿，茎干半木质化，叶片2/3展开，带革质，叶面光亮，增殖系数10第18d长出根点，第30d根系长0.5~1.0cm，平均生根率92.6%94.6%对比例4继代增殖芽高2.5～4cm，绿棕色，茎干较脆，叶片1/3展开，增殖系数2.8第35d长出根点，第65d根系长0.5~1.0cm，平均生根率32.8%45.4%图4、图5和表1所示，本发明一种太阳光条件下金花茶嫩枝培育组培苗的方法比白炽灯条件下培育组培苗的方法优：继代芽培养周期短，芽增殖系数高，生长健壮；芽始根时间短，生根率高，苗木移栽成活率高。因此，本发明的方法比白炽灯下培育组培苗的方法高效，更适合于规模化生产（图6）。当前第1页12