一种五莲杨组织培养方法与流程

文档序号:11163902阅读:673来源:国知局
一种五莲杨组织培养方法与制造工艺
本发明涉及植物组织培养领域,尤其是一种五莲杨组织培养方法。
背景技术
:五莲杨(populuswulianensis)属于杨柳科(salicaceae),杨属(populus)白杨派,为难生根树种。其又名昆嵛杨,为山东特有珍稀树种,主要分布于山东日照(五莲山)和烟台(昆嵛山、招虎山)等地,生于海拔300~500m山沟杂木林中,散生或形成片林。形态上介于山杨(polulusdavidianadode.)与响叶杨(polulusadenopudamaxim.)之间,是良好的用材树种,具有优良的耐水淹能力,对洪灾和风浪有很强的抵御能力,适应风力强劲的生长环境。利用组织培养方法繁殖杨属植物良种资源,不受季节和生长时间的限制,可以在短时间内以较快的速度获得大量苗木。在常规的杨属植物组织培养过程中,尤其白杨派植物的组织培养中,极易出现玻璃化现象。玻璃化现象是植物组织培养中特有的一种生理失调或生理病变,表现为试管苗呈半透明状、失绿、叶片皱缩卷曲、易碎。五莲杨在初代培养过程中玻璃化发生率为50%~80%。降低组培过程中的玻璃化发生率,成为杨属植物组织培养的重点研究问题。技术实现要素:本发明旨在提供一种五莲杨组织培养方法,解决五莲杨组培过程中玻璃化发生率高、成活率低、无法推广五莲杨规模化育苗的问题。本发明的技术方案是这样实现的,步骤如下:(1)初代培养:将外植体接种到初代培养基中进行启动培养,得到初代苗;(2)去玻璃化培养:将上一步得到的初代苗,接种于去玻璃化培养基中进行去玻璃化培养,得到去玻璃化苗;(3)增殖培养:将去玻璃化苗接种于增殖培养基中进行增殖培养,得到继代苗;(4)生根培养:将继代苗转入生根培养基中进行生根培养,得到生根苗;所述初代培养基为,添加25g/l蔗糖+5.5g/l琼脂粉的ms基础培养基,调节ph值至5.8;所述去玻璃化培养基为,添加0.05mg/lnaa+0.4mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉的1/2(n)ms培养基,调节ph值至5.8;所述增殖培养基为,添加0.03mg/lnaa+0.4~0.5mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉的ms培养基,调节ph值至5.8;所述生根培养基为,添加0.05mg/lnaa+15g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉的1/2ms培养基,调节ph值至5.8。作为一种优选的实施方案,所述外植体选用1.5~2.0cm的带茎芽段。作为一种优选的实施方案,所述带茎芽段是春季3月中旬采集的新抽生顶部带芽茎段。作为一种优选的实施方案,所述初代培养之前还包括外植体消毒过程,所述外植体消毒过程:用洗衣粉清洗外植体表面,用细流水过夜冲洗外植体,将冲洗干净的外植体,置于超净工作台上进行灭菌,采用75%酒精处理35s,用5%次氯酸钠处理9min进行消毒处理,消毒后带茎芽段切成0.8~1.5cm芽茎段,置于初代培养基中培养。作为一种优选的实施方案,所述组织培养快繁方法的培养条件是:白天温度为25±2℃,夜间18±2℃,光照时间为16h,光照强度为3000~5000lx。作为一种优选的实施方案,所述初代培养的时间是25d,所述去玻璃化培养的时间是35d,所述增殖培养的时间是35d。作为一种优选的实施方案,所述组织培养方法还包括炼苗,所述炼苗:将生根苗移栽于温室中封口炼苗,5d后,去除无菌盖,继续炼苗3~4d。作为一种优选的实施方案,所述组织培养方法还包括移栽,所述移栽:清水冲洗成活的幼苗,将其移栽至经过0.5%高锰酸钾消毒的轻基质,所述轻基质包括草炭与蛭石,所述轻基质中草炭与蛭石的比例是1:1。本发明的有益效果:本发明提供的组织培养方法增加了去玻璃化步骤,将经过初代培养后得到的无菌苗接种于去玻璃化培养基上,通过去玻璃化步骤降低五莲杨组培玻璃化发生率,去玻璃化培养基配比简单,同时为了更好解决技术问题,本发明选用的外植体优先选用春季3月中旬采集的新抽生顶部带芽茎段,剪成1.5~2.0cm长度,进行组织培养,通过芽的增殖进行快速繁殖,保证了遗传的稳定性,取材容易;同时,本发明提供的组织培养方法降低了组织繁育成本,提高五莲杨组培育苗效率。附图说明图1为灭菌成活的外植体的照片图;图2为五莲杨未玻璃化苗的照片图;图3为去玻璃化组培苗的照片图;图4为增殖继代培养的照片图;图5为生根培养阶段的照片图;图6为炼苗移栽成活后植株照片图。具体实施方式下面将结合本发明的具体实施例与附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。实施例一一种五莲杨组织培养方法,步骤如下:(1)外植体消毒培养用枝剪快速剪下1.5~2.0cm的带茎芽段,作为外植体,用洗衣粉清洗表面,用细流水过夜冲洗,将冲洗干净的带芽茎段置于超净工作台上,采用75%酒精处理35s,用5%次氯酸钠处理9min进行灭菌,用手术刀将脱毒后带茎芽段切成0.8~1.5cm,置于ms空白培养基中培养,培养时间是25d,培养结果参照图1。(2)去玻璃化培养:从上一步得到的无菌苗中,选取未玻璃化、茎高1.5~2.0cm的丛生苗茎段,接种于去玻璃化培养基中进行去玻璃化培养35d,得到去玻璃化苗。未玻璃化苗参照图2。试验所用去玻璃化培养基,是选取ms或1/2(n)ms作为母液,选择性添加naa、6-ba两种细胞生长素及活性炭(ac),培养基ph值调为5.8,添加结果见表1。表1去玻璃化培养基的选择试验方法:将选取的未玻璃化、茎高1.5~2.0cm的茎段分成11组,每组48个茎段,将试验对象接种于表1所列出的不同培养基中进行培养,统一光照培养条件:白天温度为25±2℃,夜间18±2℃,光照时间为16h,光照强度为3000~5000lx,培养天数是35d,得到各组玻璃化发生率数据,试验结果见表2。表2不同培养基的玻璃化发生率数据由表2可见,ms母液中n含量减半可缓减玻璃化,提高增殖系数。加入ac后,玻璃化程度并未得到缓解,此处可得出,加入ac并未对五莲杨玻璃化起到良性效果。根据综合数据分析,1/2(n)ms+0.05mg/lnaa+0.4mg/l6-ba培养基玻璃化发生率为10.1%,增值系数达7.37,平均茎高为3.33cm;1/2(n)ms+0.05mg/lnaa+0.5mg/l6-ba培养基玻璃化发生率降为14%,增值系数达7.35,平均茎高为3.51cm,上述两种培养基均具有显著的去玻璃化效果。在上述基础上进行了第二次试验:选取未玻璃化、茎高1.5~2.0cm的茎段,分成8组,每组48个,在1/2(n)ms+0.05mg/lnaa+0.4mg/l6-ba培养基和1/2(n)ms+0.05mg/lnaa+0.5mg/l6-ba培养基基础上分别添加不同浓度的蔗糖与琼脂粉,培养基ph值调为5.8,进一步进行去玻璃化试验。表3添加蔗糖和琼脂的去玻璃化培养基处理母液naa(mg/l)6-ba(mg/l)蔗糖(g/l)琼脂粉(g/l)11/2(n)ms0.050.425621/2(n)ms0.050.4256.531/2(n)ms0.050.430641/2(n)ms0.050.4306.551/2(n)ms0.050.525661/2(n)ms0.050.5256.571/2(n)ms0.050.530681/2(n)ms0.050.5306.5试管苗茎段接种到培养基中后,光照培养条件为:白天温度为25±2℃,夜间18±2℃,光照时间为16h,光照强度为3000~5000lx。培养35d,培养结果见表4。表4添加蔗糖和琼脂的去玻璃化试验结果由表4可见,增大蔗糖及琼脂粉的添加,有利于降低玻璃化发生率,添加30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉时,出现玻璃化发生率最低值;从综合数据分析可知,1/2(n)ms+0.05mg/lnaa+0.4mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉的培养基玻璃化发生率最低值为0,增殖系数为7.65,平均茎高是3.75cm。从表4的平均玻璃化程度水平数据结果得出,高浓度蔗糖及琼脂的添加利于五莲杨试管苗的玻璃化去除。因此选用的去玻璃化培养基为,添加0.05mg/lnaa+0.4mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉的1/2(n)ms培养基,培养结果参照图3。(4)增殖培养:将去玻璃化苗接种于增殖培养基中进行增殖培养35d,得到继代苗,试验所用的增殖培养基以ms培养基为母液,添加不同浓度的naa和6-ba,添加情况见表5。表5五莲杨增殖培养基试验处理naa(mg/l)6-ba(mg/l)10.030.420.040.430.050.440.030.550.040.560.050.570.030.680.040.690.050.6试验方法:将健壮试管丛生苗茎段分成9组,每组48个茎段,分别在ms+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉中附加不同浓度的naa和6-ba的增殖培养基中进行正交试验,培养基ph值调为5.8。培养条件为:白天温度为25±2℃,夜间18±2℃,光照时间为16h,光照强度为3000~5000lx。培养35d,各组增殖效果见表6。表6五莲杨增殖培养结果由表6可知,处理1和处理4的增殖系数较突出,有效苗及茎高均有较高值,处理1玻璃化发生率有最小值为0;处理4玻璃化发生率为1.4%。与表5相比较,先进行去玻璃化培养,微调节激素浓度,有利于组培苗增殖系数的扩增及茎的伸长,并促进了有效苗的增加。从玻璃化发生率最低出发,利于五莲杨增殖的培养基选用添加0.03mg/lnaa+0.4mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉的ms培养基,在此培养基上得到的培养结果,参照图4。(5)生根培养:将继代苗转入生根培养基中进行生根培养35d,得到生根苗。所用的生根培养基选用1/2ms+6.5g/l琼脂粉中附加不同浓度蔗糖、naa或iba的生根培养基,培养基选取结果见表7。表7生根培养基试验处理naa(mg/l)iba(mg/l)蔗糖(g/l)10.013020.023030.033040.043050.053060.051570.043080.083090.1230100.1630110.230120.215试验方法:将健壮试管丛生苗茎段分成12组,每组48个茎段,分别在1/2ms+6.5g/l琼脂粉并附加不同浓度蔗糖、naa或iba的生根培养基中进行浓度梯度试验,培养基ph值调为5.8。统一培养条件为:白天温度为25±2℃,夜间18±2℃,光照时间为16h,光照强度为3000~5000lx,培养天数是35d。各培养基培养结果见表8.表8不同生根培养基试验结果由表8可知,整体达到最高峰值均出现在处理6,其生根率达91.7%,平均茎高为4.58cm,玻璃化发生率为0。从添加单一因素分析,激素naa作用效果强于iba;蔗糖减半后,利于五莲杨组培苗生根。因此利于五莲杨生根培养基,选用添加0.05mg/lnaa+15g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉1/2ms培养基,在此生根培养基上的培养结果参照图5。(6)炼苗,将生根苗移栽于温室中封口炼苗,5d后,去除无菌盖,继续炼苗3d,用清水洗去根系表面附着的培养基。(7)移栽,选用成活的幼苗,用清水冲洗掉幼苗根部的培养基,将其移栽至经0.5%高锰酸钾消毒的轻基质,所述轻基质包括草炭与蛭石,所述轻基质中草炭与蛭石的比例是1:1,移栽成活情况参照图6。实施例二与实施例一的区别在于:选用的增殖培养基为,添加0.03mg/lnaa+0.5mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉的ms培养基。将去玻璃化苗接种于增殖培养基中进行增殖培养35d,得到继代苗,试验所用的增殖培养基以ms培养基为母液,添加不同浓度的naa和6-ba,添加情况见表9。表9五莲杨增殖培养基试验试验方法:将健壮试管丛生苗茎段分成9组,每组48个茎段,分别在ms+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉中附加不同浓度的naa和6-ba的增殖培养基中进行正交试验,培养基ph值调为5.8。培养条件为:白天温度为25±2℃,夜间18±2℃,光照时间为16h,光照强度为3000~5000lx。培养35d,各组增殖效果见表10。表10五莲杨增殖培养结果由表10可知,处理1和处理4的增殖系数较突出,有效苗及茎高均有较高值,处理1玻璃化发生率有最小值为0,有效苗为6.67株,增殖系数是10.5,平均茎高5.88cm;处理4玻璃化发生率为1.4%,有效苗为6.67株,增殖系数为11.58,平均茎高为5.96cm,,处理4的增殖系数高于处理1,平均茎高高于处理1,综合比较下,利于五莲杨增殖的培养基选用添加0.03mg/lnaa+0.5mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉的ms培养基,在此培养基上得到的培养结果。实施例三与实施例一的区别在于:本实施中五莲杨组织培养步骤依次为:外植体消毒、初代培养、去玻璃化培养、增殖培养、生根培养、炼苗、移栽,去玻璃化培养之前,即外植体消毒之后增加了初代培养步骤。初代培养步骤如下:将经过消毒的外植体接种到初代培养基进行启动培养,培养得到初代无菌苗,初代培养基选用添加25g/l蔗糖+5.5g/l琼脂粉的ms基础培养基,ph值调节至5.8,培养条件为:白天温度为25±2℃,夜间18±2℃,光照时间为16h,光照强度为3000~5000lx,培养时间是25d,将培养后的初代苗接种在去玻璃化培养培养中进行去玻璃化培养。常用的初代培养基为了诱导培养物腋芽萌发,以获得愈伤组织诱导的无菌幼叶,通常选用在ms基础培养基基础上添加生长激素、分裂素等。选用8组,每组48个无菌茎段作为实验对象,选用比较常见的初代培养基,即添加0.5mg/l6-ba+0.05mg/lnaa的ms基础培养基作为对照组,运用到本实施例中,与选用25g/l蔗糖+5.5g/l琼脂粉的ms基础培养基对比培养结果,对照组与实验组培养步骤依次为:外植体消毒、初代培养、去玻璃化培养、增殖培养、生根培养、炼苗、移栽,初代培养选用8组,每组48个无菌茎段,玻璃化率结果见表11。表11初代培养基试验结果由表11中,可以看出,运用本实施例的初代培养基对杨树茎段进行初代培养,玻璃化率低,组织培养效率高。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12
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