本发明属于林木生物技术领域，涉及一种植物培育方法，具体涉及一种快速获得黑果枸杞再生苗的培育方法。
背景技术：
黑果枸杞(lyciumruthenicummurr)，为茄科(solanceae)枸杞属多年生多棘刺灌木植物，是重要的抗旱、抗盐碱沙漠先锋树种之一，其在我国西藏、宁夏贺兰山、青海东部、陕西北部、新疆北部、内岭、河床沙滩等条件相当恶劣的环境中皆有零星分布。
野生黑枸杞味甘、性平，富含蛋白质、脂肪、糖类、游离氨基酸、有机酸、矿物质、微量元素、生物碱、维生素c、b1、b2、钙、镁、铜、锌、锰、铁、铅、镍、镉、钴、铬、钾、钠等各种营养成分。经科学检测，黑果枸杞中的钙、铁、尼克酸含量分别为红果枸杞的2.3、4.6、16.7倍，尤其是原花青素(opc)含量甚至超过蓝莓(黑果枸杞含opc3690mg/100g；蓝莓含opc330～3380mg/100g)，是迄今为止发现opc含量最高的天然野生果实，也是最有效的天然抗氧化剂，其功效是vc的20倍、ve的50倍，具有超强的增强免疫力、延缓衰老的滋补作用。黑果枸杞中的维生素、矿物质等营养成分含量也很丰富，尤其含具有清除自由基、抗氧化功能的天然的花色甙素，药用，保健价值远远高于普通红枸杞，被誉为“软黄金”。
黑果枸杞集经济价值、生态价值、药用价值及保健价值于一身，其价格一直居高不下。近年来，农牧疯狂采摘让一些野生黑果枸杞不再挂果。如何充分合理的开发利用黑果枸杞资源，是亟需关注的重要课题。目前黑果枸杞苗木市场仍以种苗为主，但种苗价格较高，且很难完全保持亲本的优良性状。
植物的组织培养是根据植物细胞全能性理论于近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。因植物组织培养具有占用空间小、不受地区和季节限制、培养周期短、可短时间大量繁殖、不存在变异、可保持母本的一切遗传特征以及投资少、经济效益高等优势，使得该技术一经问世，便迅速在花卉、农作物和林木种苗生产中得到广泛应用。因此，借助植物的组织培养技术，建立黑果枸杞再生苗的培育方法，以规模化生产黑果枸杞种苗，从而满足黑果枸杞的优质丰产和产业化需要。
例如：中国专利文献cn105850733a公开了一种黑果枸杞再生苗培育方法，其直接通过黑果枸杞的叶片获得不定芽或者通过黑果枸杞的茎段获得丛生芽，由于该方法需要首先得到黑果枸杞的叶片或不定芽，因此组培时间久，且芽形成率不高。又如中国专利文献cn105815221a公开了一种以幼种苗作为外植体供体的黑果枸杞离体快速繁殖方法，其通过无菌种苗的获得、外植体(种苗的叶片或茎段)接种、继代增殖及炼苗移栽等完成，该方法实质亦是通过黑果枸杞的叶片或茎段获得丛生芽，在此过程中需要等待种苗长到叶片数为10～20时方可进行外植体的接种，且当利用种苗叶片为外植体接种一个月时的芽形成率为87.5％。由此可见，现有的黑果枸杞再生苗培育方法普遍存在组培时间长，且芽形成率不高的缺陷。
技术实现要素：
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中获得黑果枸杞再生苗的培育时间长及通过外植体获得的芽形成率不高的缺陷，从而提供一种快速获得黑果枸杞再生苗的培育方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案具体如下：
一种快速获得黑果枸杞再生苗的培育方法，该方法是直接由黑果枸杞的无菌种苗获得愈伤组织，再经组织培养培育得到黑果枸杞再生苗，其包括如下步骤：
(1)种子的消毒
选取黑果枸杞种子，依次经消毒剂消毒及无菌水冲洗后备用；
(2)无菌种苗的获得
将步骤(1)的种子置于ms-0培养基中，待所述种子萌发8～12天后得到无菌种苗；
所述ms-0培养基是通过向每升ms培养基中添加30g蔗糖和8.0g琼脂而得，所述ms-0培养基的ph值为5.0～5.5；
(3)愈伤组织的诱导
将步骤(2)的无菌种苗移栽至ms-1培养基中以诱导形成愈伤组织，培养条件为：温度23～27℃、光照12h/d、培养基ph值为5.0～5.5，培养35～45天；
所述ms-1培养基是通过向每升ms培养基中添加0.5～1.0mgnaa、1.5～2.5mg6-ba、30g蔗糖及8.0g琼脂而得；
(4)不定芽的获得
将步骤(3)的愈伤组织从外植体上剥离下来后置于ms-2培养基中以诱导分化不定芽，培养条件为：温度23～27℃、光照14h/d、培养基ph值为5.0～5.5，增殖培养3～5代；
所述ms-2培养基是通过向每升ms培养基中添加0.5～1.0mgnaa、0.5～1.4mg6-ba、30g蔗糖及6.0g琼脂而得；
(5)根的诱导
将步骤(4)的不定芽移栽到所述ms-0培养基中以诱导生根，即得黑果枸杞再生苗；
培养条件为：温度23～27℃、光照14h/d、培养时间17～22天。
优选的是，步骤(1)中的消毒环节为，先用70v％的酒精浸泡3～7min，再用0.1wt％的氯化汞溶液消毒10～20min。
更优选的是，所述氯化汞溶液消毒的时间为15min。
优选的是，所述ms培养基的配制方法包括，将ms微量元素母液、ms肌醇母液、ms铁盐母液分别稀释100倍后与稀释了40倍的ms大量元素母液混合；
所述ms微量元素母液、ms肌醇母液、ms铁盐母液、ms大量元素母液的体积之比为5:5:5:2；
所述ms大量元素母液的组成为，每升无菌水中含kno376.0g、nh4no366.0g、mgso4·7h2o14.8g、cacl2·2h2o17.6g、无水cacl213.28g；
所述ms微量元素母液的组成为，每升无菌水中含mnso4·h2o2.23g、znso4·7h2o0.86g、h3bo30.62g、ki0.083g、na2moo4·2h2o0.025g、cuso4·5h2o0.0025g、cocl2·6h2o0.0025g；
所述ms肌醇母液的组成为，每升无菌水中含肌醇10.0g、烟酸0.1g、vitb11.0g、vitb60.1g；
所述ms铁盐母液的组成为，feso4·7h2o2.78g、na2edta3.73g。
优选的是，所述ms-0培养基、ms-1培养基、ms-2培养基的ph值均为5.2。
优选的是，每升所述ms-1培养基中含naa1.0mg、6-ba2.0mg。
优选的是，每升所述ms-2培养基中含naa1.0mg、6-ba1.0mg。
优选的是，所述的一种快速获得黑果枸杞再生苗的培育方法，还包括，将步骤(5)得到的生根苗转入大棚内炼苗至少2周的步骤。
本发明中的v％表示体积百分含量，wt％表示质量百分含量。
本发明的技术方案，具有如下优点：
(1)本发明提供的快速获得黑果枸杞再生苗的培育方法，直接由黑果枸杞的无菌种苗获得愈伤组织，再经组织培养培育黑果枸杞再生苗，本发明的方法减少了无菌苗的生长环节，与传统通过种苗的叶片或茎段诱导愈伤组织相比，本发明能大大缩短组培的时间，极大地减少了黑果枸杞的培育成本，同时还有效提高了培育效率，再生苗的移栽成活率高达98％。
(2)本发明提供的快速获得黑果枸杞再生苗的培育方法，通过向每升ms培养基中添加0.5～1.0mgnaa和1.5～2.5mg6-ba，更易于获得分化的愈伤组织，且愈伤生成率高达到94％。
(3)本发明提供的快速获得黑果枸杞再生苗的培育方法，通过向每升ms培养基中添加0.5～1.0mgnaa和0.5～1.4mg6-ba，有利于不定芽的分化，可快速萌芽，且出芽率达到92％以上。
(4)本发明提供的快速获得黑果枸杞再生苗的培育方法，在诱导生根时不添加任何激素亦可保证生根率高达97％，且根的生长速度较快，每株小苗至少长出3条根，且根系粗壮、根毛繁密。
(5)本发明提供的快速获得黑果枸杞再生苗的培育方法，种子的消毒采用0.1wt％的氯化汞溶液消毒15min，消毒效果很好，且污染率和死亡率都非常低，分别为6.5％和8.5％。
(6)本发明提供的快速获得黑果枸杞再生苗的培育方法所培育的黑果枸杞具有遗传稳定性好、成本低廉、育苗周期短、繁殖系数高、操作简便的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例1提供的快速获得黑果枸杞再生苗的培育方法得到的黑果枸杞植株再生体系的生长状态示意图，其中，a:无菌苗种植1周左右，愈伤组织生长情况；b:无菌苗种植2周左右，愈伤组织生长情况；c:无菌苗种植3周左右，愈伤组织生长情况；d:愈伤剥离后，愈伤组织生长约20天；e:愈伤剥离后，愈伤组织生长约30天；f:愈伤剥离后，愈伤组织生长约40天；g:愈伤组织上出现多个分化小芽；h:愈伤组织上继续生长的分化幼苗；i:开始生根培养的黑枸杞小苗。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
实验例1：ms培养基配置
s1：ms培养基母液配置
对照表1-4，分别称取各组分。
表1：ms大量元素母液配方
称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解后混合，最后定容到1l。
表2：ms微量元素母液配方
称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解后混合，最后定容到1l。
表3：ms肌醇母液配方
称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解后混合，最后定容到1l。
表4：ms铁盐母液配方
称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解后混合，最后定容到1l。
s2：ms培养基配置
将s1中的ms微量元素母液、ms肌醇母液、ms铁盐母液分别稀释100倍后与稀释了40倍的ms大量元素母液按等比例混合。
实验例2：激素naa及6-ba的配置
称取0.04gnaa粉末，先用1ml无水乙醇溶解，再定容于200ml即得到0.2mg/ml的naa溶液，后保存于4℃冰箱备用。
称取0.04g6-ba粉末，先用1mol/l稀氢氧化钠溶液溶解，再定容于200ml即得到0.2mg/ml的6-ba溶液，后保存于4℃冰箱备用。
实施例1
1.种子的消毒
选取黑果枸杞种子，用70v％的酒精浸泡5min后再用0.1wt％的氯化汞溶液消毒15min，然后用无菌水冲洗3遍。
2.无菌种苗的获得
向每升ms培养基中添加30g蔗糖和8.0g琼脂，用1mol/l的naoh溶液调节ph值至5.8，后用121℃高压灭菌15min后得到ms-0培养基，此时培养基的ph值为5.2。
将步骤1的种子置于ms-0培养基中，待所述种子萌发8～12天后得到无菌种苗。
3.愈伤组织的诱导
向每升ms培养基中添加1.0mgnaa、2.0mg6-ba、30g蔗糖及8.0g琼脂，用1mol/l的naoh溶液调节ph值至5.8，后用121℃高压灭菌15min后得到ms-0培养基，此时培养基的ph值为5.2。
将步骤2的无菌种苗移栽至ms-1培养基中以诱导形成愈伤组织，经测定，愈伤生成率为94％。请参见图1中的图a～c。培养条件为：温度23～27℃、光照12h/d、培养基ph值为5.2，培养35～45天。
4.不定芽的获得
向每升ms培养基中添加1.0mgnaa、1.0mg6-ba、30g蔗糖及6.0g琼脂，用1mol/l的naoh溶液调节ph值至5.8，后用121℃高压灭菌15min后得到ms-2培养基，此时培养基的ph值为5.2。
将步骤3的愈伤组织从外植体上剥离下来后置于ms-2培养基中以诱导分化不定芽，经测定，幼芽生成率为95％。请参见图1中的图d～h，培养条件为：温度23～27℃、光照14h/d、培养基ph值为5.2，增殖培养3～5代。
5.根的诱导
将步骤4的不定芽移栽到ms-0培养基中以诱导生根，请参见图1中的图i，经测定，生根率为97％。其中：培养条件为：温度23～27℃、光照14h/d、培养时间17～22天。
6.炼苗移栽
将步骤5得到的生根苗转入大棚内炼苗2周后，采用环境条件逐渐过渡的方法进行移栽。经测定，移栽成活率为98％。
实施例2
1.种子的消毒
选取黑果枸杞种子，用70v％的酒精浸泡7min后再用0.1wt％的氯化汞溶液消毒10min，然后用无菌水冲洗3遍。
2.无菌种苗的获得
向每升ms培养基中添加30g蔗糖和8.0g琼脂，用1mol/l的naoh溶液调节ph值至5.6，后用121℃高压灭菌15min后得到ms-0培养基，此时培养基的ph值为5.0。
将步骤1的种子置于ms-0培养基中，待所述种子萌发8～12天后得到无菌种苗。
3.愈伤组织的诱导
向每升ms培养基中添加0.5mgnaa、2.5mg6-ba、30g蔗糖及8.0g琼脂，用1mol/l的naoh溶液调节ph值至5.6，后用121℃高压灭菌15min后得到ms-0培养基，此时培养基的ph值为5.0。
将步骤2的无菌种苗移栽至ms-1培养基中以诱导形成愈伤组织，经测定，愈伤生成率为91％。培养条件为：温度23～27℃、光照12h/d、培养基ph值为5.2，培养35～45天。
4.不定芽的获得
向每升ms培养基中添加0.5mgnaa、1.4mg6-ba、30g蔗糖及6.0g琼脂，用1mol/l的naoh溶液调节ph值至5.6，后用121℃高压灭菌15min后得到ms-2培养基，此时培养基的ph值为5.0。
将步骤3的愈伤组织从外植体上剥离下来后置于ms-2培养基中以诱导分化不定芽，经测定，幼芽生成率为94％。培养条件为：温度23～27℃、光照14h/d、培养基ph值为5.0，增殖培养3～5代。
5.根的诱导
将步骤4的不定芽移栽到ms-0培养基中以诱导生根，经测定，生根率为96％。其中：培养条件为：温度23～27℃、光照14h/d、培养时间17～22天。
6.炼苗移栽
将生根苗转入大棚内炼苗2周后，采用环境条件逐渐过渡的方法进行移栽。经测定，移栽成活率为94％。
实施例3
1.种子的消毒
选取黑果枸杞种子，用体积分数为70％的酒精浸泡3min后再用体积分数为0.1％的氯化汞溶液消毒20min，然后用无菌水冲洗3遍。
2.无菌种苗的获得
向每升ms培养基中添加30g蔗糖和8.0g琼脂，用1mol/l的naoh溶液调节ph值至6.1，后用121℃高压灭菌15min后得到ms-0培养基，此时培养基的ph值为5.5。
将步骤1的种子置于ms-0培养基中，待所述种子萌发8～12天后得到无菌种苗。
3.愈伤组织的诱导
向每升ms培养基中添加0.8mgnaa、1.5mg6-ba、30g蔗糖及8.0g琼脂，用1mol/l的naoh溶液调节ph值至6.1，后用121℃高压灭菌15min后得到ms-0培养基，此时培养基的ph值为5.5。
将步骤2的无菌种苗移栽至ms-1培养基中以诱导形成愈伤组织，经测定，愈伤生成率为90％。培养条件为：温度23～27℃、光照12h/d、培养基ph值为5.5，培养35～45天。
4.不定芽的获得
向每升ms培养基中添加0.8mgnaa、0.5mg6-ba、30g蔗糖及6.0g琼脂，用1mol/l的naoh溶液调节ph值至6.1，后用121℃高压灭菌15min后得到ms-2培养基，此时培养基的ph值为5.5。
将步骤3的愈伤组织从外植体上剥离下来后置于ms-2培养基中以诱导分化不定芽，经测定，幼芽生成率为92％。培养条件为：温度23～27℃、光照14h/d、培养基ph值为5.0，增殖培养3～5代。
5.根的诱导
将步骤4的不定芽移栽到ms-0培养基中以诱导生根，经测定，生根率为92％。其中：培养条件为：温度23～27℃、光照14h/d、培养时间17～22天。
6.炼苗移栽
将生根苗转入大棚内炼苗2周后，采用环境条件逐渐过渡的方法进行移栽。经测定，移栽成活率为95％。
对比例1
1.种子的消毒
选取黑果枸杞种子，用70v％的酒精浸泡5min后再用0.1wt％的氯化汞溶液消毒15min，然后用无菌水冲洗3遍。
2.无菌种苗的获得
向每升ms培养基中添加30g蔗糖和8.0g琼脂，用1mol/l的naoh溶液调节ph值至5.8，后用121℃高压灭菌15min后得到ms-0培养基，此时培养基的ph值为5.2。
将步骤1的种子置于ms-0培养基中，待所述种子萌发至种苗长到叶片数为10～20片。
3.愈伤组织的诱导
向每升ms培养基中添加1.0mgnaa、2.0mg6-ba、30g蔗糖及8.0g琼脂，用1mol/l的naoh溶液调节ph值至5.8，后用121℃高压灭菌15min后得到ms-0培养基，此时培养基的ph值为5.2。
将步骤2中生长良好的幼叶片横向剪或切为直径3～5mm的小块(单片叶剪为2～3块)后移栽至栽至ms-1培养基中以诱导形成愈伤组织，经测定，愈伤生成率为79％。培养条件为：温度23～27℃、光照12h/d、培养基ph值为5.2，培养35～45天。
4.不定芽的获得
向每升ms培养基中添加1.0mgnaa、1.0mg6-ba、30g蔗糖及6.0g琼脂，用1mol/l的naoh溶液调节ph值至5.8，后用121℃高压灭菌15min后得到ms-2培养基，此时培养基的ph值为5.2。
将步骤3的愈伤组织从外植体上剥离下来后置于ms-2培养基中以诱导分化不定芽，经测定，幼芽生成率为84％。培养条件为：温度23～27℃、光照14h/d、培养基ph值为5.2，增殖培养3～5代。
5.根的诱导
将步骤4的不定芽移栽到ms-0培养基中以诱导生根，经测定，生根率为87％。其中：培养条件为：温度23～27℃、光照14h/d、培养时间17～22天。
6.炼苗移栽
将步骤5得到的生根苗转入大棚内炼苗2周后，采用环境条件逐渐过渡的方法进行移栽。经测定，移栽成活率为89％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。