评价转基因水稻对白符跳安全性的生物测定方法与流程

本发明涉及评价转基因水稻对白符跳安全性的生物测定方法。

背景技术：

跳虫，又称弹尾虫(springtails)、粘管虫(collembolans)，是弹尾纲(collembola)动物的俗称，是分布极为广泛的一类小型土壤节肢动物，是土壤生态系统中重要的分解者，对调节土壤营养物质循环发挥着十分重要的作用。由于跳虫对土壤质量及土壤中污染物质十分敏感。因此，跳虫的多样性以及群落结构、物种组成对土壤质量和环境污染状况能起到很好的指示性作用。

转基因抗虫作物如bt作物的种植，其植株可通过根部分泌、植物残体和花粉飘落等方式向土壤中释放转基因杀虫蛋白如bt蛋白。跳虫作为土壤生态系统中的分解者，可通过取食植物残渣或者花粉直接地摄取到转基因作物产生的外源杀虫蛋白。因此，在转基因抗虫植物的非靶标效应评价中，常把土壤跳虫作为重要的评价对象之一。白符跳(folsomiacandida)是跳虫中最常见的一种，其对土壤质量及土壤中化学物质的毒性非常敏感，且其为孤雌生殖，易于人工饲养，因此，传统上白符跳作为模式生物被广泛应用于土壤农药残留和质量的检测。转基因抗虫作物出现后，白符跳作为指示性生物逐渐被用于转基因抗虫作物的非靶标效应评价工作中(michelleetal.,2005；yuanetal.,2011,2013,2014；baietal.,2011；simsetal.,1997；bakonyietal.,2011；romeisetal.,2003)，但一直缺乏比较完善和标准的评价方法。为此，本实验室近年开展了一系列研究工作，旨在建立高标准的评价转基因抗虫植物对白符跳安全性的技术体系。2014年，我们发展了评价转基因抗虫植物表达的外源杀虫蛋白对白符跳潜在毒性影响的试验方法，并已提交一项专利申请(201410746168.7)。本发明是为了提供一种可用于检测取食转基因水稻植株组织对白符跳生长发育及繁殖能力影响的试验方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种评价转基因水稻对白符跳安全性的生物测定方法，以用于检测取食转基因水稻植株组织对白符跳生长发育及繁殖能力的影响。

本发明提供的评价转基因水稻对白符跳安全性的生物测定方法，将转基因水稻叶片饲喂给白符跳，通过测定白符跳的生命参数评价转基因水稻对白符跳的安全性，其中，将转基因水稻叶片饲喂给白符跳的方法为，用转基因水稻叶片冻干粉与酵母粉混合饲料作为测试饲料饲喂，转基因水稻叶片冻干粉与酵母粉的重量比为5～15：1。

优选地，所述叶片冻干粉与酵母粉的重量比为8～12：1，更优选地为9～11：1，尤以10：1、11：1为佳。

优选地，选用10-14天白符跳虫开始测定，测定持续25-35天，更优选地，选用11-12天白符跳虫开始测定，测定持续26-30天。

优选地，以非转基因水稻叶片冻干粉与酵母粉的混合物为阴性对照饲料，阴性对照饲料中的非转基因水稻叶片冻干粉与酵母粉的重量比等同于所述测试饲料中的转基因水稻叶片冻干粉与酵母粉的重量比。

优选地，将所述阴性对照饲料混入蛋白酶抑制剂e-64作为阳性对照饲料，e-64的质量浓度为0.7％～1％。

优选地，所述冻干粉都是加入液氮研磨而成的。可以放-50℃～-70℃冰箱保存备用。

优选地，所述生命参数包括产卵量、子代数、粪球排泄量和死亡情况中的一种或多种。

优选地，所选用的白符跳用如下方法饲养：将制备好的饲料置于具有基底的培养皿内，随机选取1头白符跳置于准备好的培养皿中，把培养皿置于培养箱内饲养。

优选地，培养箱的条件为，温度：20±1℃，相对湿度：70±5％，光照：12h:12h；每天上午和晚上观察白符跳的产卵量、子代数、粪球排泄量和死亡情况，每隔5～8天测量白符跳的头宽和体长，将阳性对照、阴性对照和处理组的数据进行比较，评价转基因水稻对白符跳的安全性。

优选地，所述具有基底的培养皿的制备方法为，将石膏：活性炭：水按照8～10：1：9～12的重量比充分混匀，倒入培养皿中，室温下凝固形成3～5mm基底，当饲养白符跳时，首先用蒸馏水润湿培养基，再擦干多余水分。

通过实验研究，证明了本发明所提供的方法简单、易行，可用于检测取食转基因水稻植株组织对白符跳生长发育及繁殖能力的影响，具有可靠的有效性和灵敏性。

附图说明

图1a、图1b、图1c、图1d依次分别为取食不同配比(水稻叶片冻干粉：酵母粉)饲料的白符跳的生存曲线图以及产卵量、子代数和粪球排泄量的对比示意图；

图2为利用本发明所提供的生物测定方法测得取食不同转基因水稻组织及含蛋白酶抑制剂e-64(阳性对照)饲料的白符跳生存曲线图。

具体实施方式

下面说明本发明提供的一种评价转基因水稻对白符跳安全性的生物测定方法的具体实施方案。

1用水稻叶片组织饲喂白符跳的方法

评价转基因植物非靶标效应，一个简单而重要的方式就是将含转基因外源杀虫蛋白的转基因植物组织如叶片直接饲喂给受试生物，通过观察受试生物的生命参数分析转基因植物对受试生物的潜在影响。这样，就需要建立一个可以把转基因植物组织直接饲喂给受试生物的饲喂方法。本发明提供的将水稻组织直接饲喂给白符跳的方法为：将水稻叶片冻干粉与酵母粉混合饲喂白符跳。

试验表明，饲喂时，叶片冻干粉与酵母粉的重量比可以为5～15:1，能够保证白符跳的正常生长发育，生长率达到国际要求(>80％)。下面是一些试验情况。

1)试验处理：

饲料配方一：全部为水稻组织冻干粉

饲料配方二：水稻组织冻干粉：酵母粉＝5：1混合

饲料配方三：水稻组织冻干粉：酵母粉＝7：1混合

饲料配方四：水稻组织冻干粉：酵母粉＝8：1混合

饲料配方五：水稻组织冻干粉：酵母粉＝9：1混合

饲料配方六：水稻组织冻干粉：酵母粉＝10：1混合

饲料配方七：水稻组织冻干粉：酵母粉＝11：1混合

饲料配方八：水稻组织冻干粉：酵母粉＝12：1混合

饲料配方九：水稻组织冻干粉：酵母粉＝13：1混合

饲料配方十：水稻组织冻干粉：酵母粉＝15：1混合

水稻叶片采用非转基因水稻mh63叶片。将处于分蘖期生长状况良好的水稻叶片置于研钵，加入液氮，研磨至粉状，放-60c冰箱保存备用。

2)生物测定步骤

首先需要准备用于饲喂白符跳的培养皿。将石膏：活性炭：水按照9：1：10的重量比充分混匀，适量倒入塑料培养皿(直径：55mm；高：10mm)中，室温下凝固形成基底(3-5mm)。当饲养白符跳时，首先用蒸馏水润湿培养基，再用无屑纸擦干多余水分。

试验选用12天大的白符跳。将制备好的饲料置于培养皿底部中央，随机选取1头白符跳置于准备好的培养皿中。每个处理设30个重复。饲料每隔2天更换一次。试验在培养箱(温度：20±1℃，相对湿度：70±5％，光照：12h:12h)中进行。

试验一共持续28天，每天上午9点和晚上9点观察白符跳生长发育情况，记录产卵量、子代数、粪球排泄量和死亡情况，每隔7天测量白符跳的头宽和体长。采用spss13.0统计分析软件对数据进行比较。

3)试验结果

以上试验，每种饲料配方设置3个试验。试验结果表明，用饲料二～十饲喂的存活率均显著高于饲料一，其中，饲料二和六的存活率没有差异，均达到100％。饲料三、四、五、七、八、九、十的饲喂试验中有达不到100％的情况。但从5～15:1的叶片酵母粉重量比范围内考量饲喂存活率，没有发现明确的递增或递减规律。图1a表示了饲料一、二和六的饲喂白符跳的生存曲线，即生存率情况，饲料二和六没有没有差异，高于饲料一。

其它如产卵量、子代数、粪球排泄量、体长、头宽等指标的相对高低对比情况，也存在与上述存活率对比情况相同的情况。下面具体举例说明。

饲料二和六的白符跳产卵量、子代数、粪球排泄量、体长和头宽等生命参数无显著差异(p>0.05)。然而，取食饲料一的白符跳产卵量。子代数及喷球排泄量显著低于取食饲料2和饲料3的白符跳(p<0.05)。详见图1b、1c和1d所示。

4)试验结论

虽然取食纯水稻叶片对白符跳的生存能力没有显著影响，但白符跳的食物取食量和繁殖能力显著下降。取食5:1或10:1的水稻叶片和酵母粉混合饲料对白符跳的生长发育和繁殖能力没有显著影响，且白符跳生存率均为100％，符合转基因作物非靶标影响实验室评价试验的国际要求(romeisetal.,2011)。但在转基因水稻非靶标影响评价中，为了使受试白符跳取食到尽可能多的水稻材料，提高评价结论的可靠性，水稻叶片和酵母粉干重比例为10:1的配比优势明显。

2评价体系有效性验证

根据上述发展的白符跳饲料配方(水稻组织：酵母粉＝10:1)，建立了可用于检测取食转基因水稻对白符跳生长发育和繁殖能力影响的试验方法，并通过该实验方法，评价了分别表达cry1c和cry2a蛋白的转基因水稻t1c-19和t2a-1对白符跳的安全性，验证了该试验体系的有效性。

1)试验处理:

a:纯对照水稻(mh63)叶片冻干粉：酵母粉(10:1)(阴性对照)

b:转基因水稻t1c-19叶片冻干粉：酵母粉(10:1)

c:转基因水稻t2a-1叶片冻干粉：酵母粉(10:1)

d:蛋白酶抑制剂e-64混入饲料处理a(75μg/g饲料)(阳性对照)

按上述方法，用4种饲料饲喂白符跳35天，并测定其各项生命参数如产卵量、子代数、粪球排泄量、体长和头宽等参数。

2)试验结果与结论：

取食饲料a，b和c的白符跳各生命参数无显著性差异(p>0.05)。然而，取食加入e-64的饲料，白符跳存活率显著下降(p<0.05)(图2)。其它生命参数如白符跳的产卵量、子代数、粪球排泄量、体长和头宽等生命参数也均显著低于取食饲料饲料a，b和c的白符跳(p<0.05)。这一负面影响结果说明了本专利所描述的实验方法能检测到取食转基因水稻组织对白符跳可能带来的负面影响。然后，试验检测到取食两转bt基因水稻叶片组织对白符跳的生长发育和繁殖能力产生显著影响，说明了两转基因水稻对白符跳安全性。

总之，通过实验研究，证明了本发明所提供的方法简单、易行，非常适于评价转基因水稻对白符跳的安全性。